TEM 단층 촬영은 세포 이미징에 널리 사용되지만 표본 두께 측면에서 매우 제한적입니다. FIB SEM 및 소프트 X 선 단층 촬영은 더 낮은 해상도 임에도 불구하고 더 큰 샘플에 사용할 수 있습니다. STEM 단층 촬영은 이 격차를 완벽하게 메웁니다.
STEM 단층 촬영은 수 나노미터의 해상도로 미크론 두께의 샘플을 관찰할 수 있습니다. 극저온 제제와 함께 사용하면 생물학적 샘플과 단면을 3D로 볼 수 있습니다. 이미지 형성을 이해하고 서비스 엔지니어가 스템 및 Lomax 스템 모드를 잘 정렬했는지, 보정 단계가 비디오의 단계와 같은지 확인하기 위해 STEM 광학의 기본 사항을 검토합니다.
시작하려면 열 정렬 파일을 로드하고 열 값을 엽니다. 측면 입구 극저온 홀더를 사용하는 경우 극저온 실드를 열고 TEM 모드에서 시작합니다. 빔이 화면에 나타나야 합니다.
빔이 나타나지 않으면 배율을 낮추십시오. 제어판의 버튼을 눌러 현미경을 유센트릭 초점으로 가져옵니다. 형광 화면을 직접 시각화하거나 내장 카메라로 시각화하기 위해 스폿 크기를 편리한 값으로 설정합니다.
현미경을 STEM 모드로 설정하고 초점이 대물렌즈가 아닌 콘덴서 렌즈를 사용하는지 확인합니다. 패널에서 유센트릭 포커스를 설정하고 초기 조정을 위해 회절 모드를 종료합니다. 빔이 비어 있지 않은지 확인하고 빔이 화면에 나타날 때까지 배율을 줄입니다.
빔 이동을 중앙으로 조정하고 빔을 중앙에 유지하면서 최대 70, 000 단계까지 배율을 높입니다. 그런 다음 원하는 콘덴서 조리개(마이크로 프로브 모드의 경우 일반적으로 50마이크로미터)를 삽입하고 조리개 센터링을 확인합니다. 초점 노브를 앞뒤로 돌리는 동안 스폿은 팽창 및 수축해야 하지만 비행기가 가상의 수직 모래시계를 자르는 것처럼 제자리에 남아 있어야 합니다.
조리개가 중앙에 있지 않으면 모래시계가 기울어진 것처럼 조명이 측면으로 이동합니다. 빔에 초점을 맞추거나, 정렬 탭에서 강도 목록 초점을 누르거나, 유센트릭 초점으로 돌아갑니다. 빔 위치를 중앙으로 재조정하고 회전 중심을 조정합니다.
이제 초점 스텝 휠을 최소 또는 한 단계 위로 돌려 빔이 부드럽게 펄스하고 초점이 위아래로 움직일 때 고정된 상태를 유지하도록 합니다. 피벗 포인트를 선택하고 X 및 Y 조정과 함께 두 포인트를 가져옵니다. 콘덴서 스티그메이터를 조정하여 빔을 둥글게 만듭니다.
초점을 위아래로 움직여 최적화합니다. 초점을 통과할 때 한 방향 또는 다른 방향으로 늘어나는 경향이 없어야 합니다. 렌즈를 정규화 한 다음 빔 시프트를 사용하여 스폿을 중앙에 유지하고 회전 중심 및 피벗 포인트 조정을 반복하면서 배율을 약 240, 000으로 점진적으로 증가시킵니다.
회절 모드로 돌아갑니다. 이 단계에서 빔은 형광 스크린에 균일한 디스크로 나타나야 합니다. 카메라 길이는 이제 X선 결정학으로 검출기까지의 광학 거리를 효과적으로 제어합니다.
그것을 바꾸고 스크린 위치가 표본을 향하거나 멀어지는 것처럼 디스크가 수축하고 확대되는 것을 지켜보십시오. 이 원뿔은 명시야 조명을 나타냅니다. 고배율에서 STEM 모드를 사용하려면 명시야 줄기 검출기로 시작하여 원하는 카메라 길이를 사용하여 빔을 중앙에 배치하도록 회절 정렬을 조정합니다.
화면의 명시야 표시를 켜고 카메라 길이를 330으로 줄인 다음 화면을 들어 올리고 감지기를 삽입합니다. 현미경 소프트웨어에서 스캔을 시작합니다. 스코프 디스플레이를 사용하여 원고에 설명된 대로 밝기 및 대비 설정을 조정하는 데 도움을 줍니다.
조정을 여러 번 반복합니다. 현미경을 고배율 레지스터에서 상대적으로 낮은 배율로 되돌리고 저배율 모드로 들어가지 않습니다. 형광 스크린을 삽입하고 참조를 위해 스크린 전류를 기록하십시오.
TEM에서와 같이 전류는 건 렌즈 및 스폿 크기 설정으로 변경할 수 있으며 감소된 전류에 해당하는 숫자가 증가합니다. 이 시점에서 FEG 레지스터를 저장하여 표준 값으로의 복귀를 용이하게 합니다. 표본을 보려면 LMTEM 모드로 이동합니다.
시편을 삽입합니다. 샘플을 유센트릭 높이로 가져옵니다. 이를 수행하는 방법에는 여러 가지가 있습니다.
예를 들어, 스테이지 워블러를 사용하여 그리드를 기울이면서 이미지가 측면 이동을 멈출 때까지 Z축을 따라 시편 높이를 이동합니다. 또는 보기 화면에 일부 기능을 표시하고 스테이지를 10도에서 30도 기울입니다. 피쳐가 측면으로 이동합니다.
시편 높이를 조정하여 원래 위치로 되돌립니다. 배율 또는 스테이지 기울기를 증가시켜 기울기를 0도로 다듬고 되돌립니다. 이제 STEM 모드로 돌아가 STEM 검출기를 삽입합니다.
LM 스캔 활성화가 선택 취소되어 있는지 확인합니다. 가장 낮은 고배율 모드로 이동합니다. 이 방법으로 콘덴서 난시를 조정하십시오.
얇은 샘플 영역 위에 빔을 놓고 양쪽에 있는 샘플의 그림자 이미지 사이에서 투과된 빔이 폭발하는 지점에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 콘덴서 튜닝을 조정하여 중앙 디스크를 둥글게 만듭니다. 이를 위해서는 특히 극저온 샘플의 경우 약간의 연습이 필요합니다.
50마이크로미터 조리개로 돌아가서 FEG 레지스터를 업데이트합니다. LMSTEM 모드로 이동하여 스캔을 계속하여 관심 있는 영역을 찾습니다. 필요한 경우 이 시점에서 감지기 밝기 및 대비 설정을 대략적으로 다시 조정하십시오.
현미경이 제공하는 초점 루프를 사용하여 스캔하는 동안 유센트릭 포커스를 누르고 배율을 높이고 초점을 미세 조정하고 금 구슬의 난시를 확인합니다. 지금까지 모든 것이 나노 프로브 모드에서 수행되었습니다. 더 작은 콘덴서 조리개를 삽입하면 반 수렴 각도가 감소하여 두꺼운 샘플에 유용합니다.
TFS 기기를 사용하는 또 다른 방법은 마이크로 프로브 모드로 전환하는 것인데, 이로 인해 반 수렴 각도가 감소합니다. 그런 다음 수집 각도가 수렴 각도보다 3배 더 커지도록 카메라 길이를 조정합니다. 즉, 화면의 BF 검출기 영역 표시는 빔보다 약 3배 더 큽니다.
방정식을 사용하여 기록할 선량을 추정합니다. 일반적으로 전체 단층 촬영에 대해 정사각형 잉크 스트롬 당 100-150 개의 전자를 목표로합니다. 스테이지 전체를 되돌리고 스폿 크기 및/또는 건 렌즈 설정을 사용하여 빔 전류를 조정하여 원하는 화면 전류에 도달합니다.
STEM 모드에서 기록된 전체 저배율 그리드 맵은 관심 세포가 있는 영역을 보여줍니다. 세포는 HAADF 검출기를 향해 흩어져있는 전자와 함께 부분적으로 밝게 보입니다. STEM 모드로 기록된 중간 해상도 맵은 두 개의 중간 해상도 앵커 맵을 표시했습니다.
줄기 기울기 시리즈의 0도 기울기를 통해 미토콘드리아의 인산칼슘 침전물, 크리스타 및 금 기준 마커를 시각화할 수 있었습니다. 60 나노미터 및 40 나노미터 두께 섹션의 볼륨 렌더링이 표시됩니다. 극저온 줄기 단층 촬영(CSTET)은 구조 생물학과 세포 생물학 사이의 가교 역할을 할 뿐만 아니라 초고해상도 형광의 맥락을 제공합니다.
절개나 라멜라 준비가 필요 없이 우리는 거의 네이티브 상태에서 전체 세포 극장을 볼 수 있습니다.
