이 작품은 GHT에 뉴욕 줄기 세포 과학 (NYSTEM C028107) 그랜트에 의해 지원되었다.

온도, 영양과 빛 / 어둠의 사이클에 대한 동물의 1. 컨디셔닝 <ol><li> 전 세계적으로 수많은 Nematostella 연구소 중 하나, 또는 비영리 업체에서 Nematostella vectensis 성인을 얻습니다 (표 1) </li><li> 에, 어둠 속에서 일정한 온도 (일반적으로 사이 18 및 21 ° C)에서 Nematostella 유지 &quot;/ 배 1&quot;인공 해수 천 (PPT) 당 12 부품의 염분에서 (ASW). 일반적으로, 간단한 소다 석회 유리 배양 접시에 250 mL의 1.5 L 용량 (11) 문화를 유지한다. 참고 :이 간단한 배양 조건은 일반적으로 Nematostella을 연구 실험실들 사이에서 사용되지만, 문화주의는 19 자동화 할 수 있습니다. </li><li> 일주일에 4 배 - 2 노 플리 우스 Nematostella 갓 부화 아테 피드. 얕은 직사각형 유리 접시 (20) 또는 30 ° C에서 전체 강도 (36 PPT) 또는 1 / 3 배 ASW에서 해치 아테 미아는 낭종,소규모, 상업적 또는 집에서 소금물 새우 부화장의 수의. 인큐베이터를 사용할 수없는 경우, 새우 RT에서 부화하지만 그래서 더 느리게 할 것입니다. 참고 :이 종종 완성을위한 이상 24 시간을 필요로한다. </li><li> 적어도 일주일에 한 번 말미잘 배양 물을 교체합니다. 최고의 성인 건강을 위해, (비누)없이 철저하게 깨끗한 문화 트랩 먹지 않는 음식 폐기물, 그리고 동물을 얽히게 할 수 코트 그릇과 축적 된 점액 분비물의 일주일에 한 번 그릇. </li></ol> 영양 금연실 동물 2. 선택 및 휴식 <ol><li> 거의 같은 길이의 선택 크기 일치 용종 (3-5cm, 때 자연적으로 완화) 이전 절단에 사흘 동안 식민지에서 분리 한 그릇에 배치합니다. 주 : 절삭 선정 동물의 수는 실험에 의해 결정된다 물론 진행되고 있지만, 일반적으로 우리는 여섯 복제 샘플 포인트 당 적어도 다섯 동물을 추천한다. 그러므로,전형적인 실험에서 30 동물의 최소 미리 선택 될 것이다. 일반적으로, 나중에 점수에 영향을 줄 수 있습니다 (아래 참조) 불규칙 절단 이후 최소 수 (30) 이상을 선택하는 것이 현명합니다. </li><li> 이전에 절단에 실내 조명에 인큐베이터에서 한 시간 이상을 선택 동물의 접시를 제거합니다. 실내 조명 및 취급의 진동에 노출 가능성이 동물이 수축하게됩니다, 그래서 그들은 적응 또는 실험실 벤치에 배양하여 &quot;완화&quot;할 필요합니다. 동물 접촉하는 내화물과 빛에 노출이 될 것이며, 그 시점에서 부드러운 피펫 팅에 의해 이동 될 수있다. </li><li> 선택 사항 : (1 / 3X ASW에서) 7.5 %의 MgCl 2를 첨가하여 동물을 마취. 부드럽게 표준 플라스틱 5 mL를 피펫으로 그릇에의 MgCl 2 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 동물은 결국 빛을 물리적 조작에 길들여 될 것입니다 있지만, 그것은 t &quot;수정&quot;유지하거나 동물을 마취하는 것이 유리할 수있다 : 참고그들은 긴 16,21,22하게 한 후 그 상태를 편안합니다. </li><li> 12 PPT의 ASW를 포함 100mm 직경의 멸균 유리 절단 접시의 바닥에, 절단 할 수있는 풀에서 다섯 동물 (1 / 3 배 ASW에서) 전송 넓은 구멍 (&gt; 0.5 cm) 플라스틱 피펫을 사용합니다. 40X - 10 사이의 가변 배율의 실체 현미경의 무대에 접시를 놓습니다. 참고 : 동물 마취 및 절단 완화되지 않은 경우, 그들은 여전히 ​​다시 편안하게하는 데 몇 분 정도 필요할 수 있습니다 따라서 터치 입체경 조명에 응답하고있다. </li></ol> 3. 절단 수술 <ol><li> 멸균 메스를 사용하여, 약 한이 넓고 더 장간막을 포함하지 않는 그대로입니다 physa의 섹션을 얻을 목적으로, 각각의 폴립에서 반구 physa을 절단. 참고 : 이상적인 컷 사이트가 장간막의 종료에 불과 반구입니다. 절단의면에 얇은 리터에 적절한 장간막에서 변화가있다아이 네스는 각 mesenterial 삽입 (그림 1, 화살표)에 대응. 이 구멍 17,30를 &#39;연결&#39;용이하게 할 수있다 점액을 생산하기 때문에 장간막의 부재는 매우 중요하다. <ol><li> 절단의 원하는 사이트에서 동물과 접촉 메스 블레이드를 배치합니다. 이 중 비 보조 (프리 핸드)를 수행하거나 부드럽게 # 5 포셉 (뒤몽 스타일 또는 유사한)와 함께 동물의 몸을 파악하여. </li><li> 몸에 걸쳐 &#39;흔들&#39;운동에 메스의 곡선 블레이드를 활용하여 조직을 잘라. 참고 : 조직이 메스가 요동으로 깨끗하게 절단 및 기증자로부터 physa의 원하는 부분을 해방해야합니다. 조직의 작은 조각들이 여전히 본체와 연결 physa 경우, 메스로 절단. 이것은 physa에 손상을 줄 수 있으므로, 당겨 연결 부분을 분리하지 마십시오. </li></ol></li><li> 접시에서 각 절단 &#39;기증자&#39;용종을 제거하고 SEPA에 반환&#39;풀 절단 수술&#39;라고 표시된 속도 그릇; 그릇 날짜 및 주식 문화에 반환. 참고 : 절단 용종이 정상적으로 공급 될 수 후 하루 내에 반구 상처를 치유하고 있습니다. 그들은 원하는 경우 physa 다시 절단 할 수있는 시점에서 2 주 이내에 정상적인 찾고 physa를 다시 생성합니다. </li><li> 다음, 이미 각 웰 12의 PPT ASW의 10 ㎖를 갖는 멀티 웰 세포 배양 접시에 별도 멸균 웰에 각각 physa 전송할 12의 PPT ASW 절삭 접시에 남아 절제 physa 린스. 참고 :이 예에서는 각 해수 잘 잡고 10 mL의 다섯 적출 physa으로, 여섯 웰 플레이트를 사용합니다. 일반적으로 해수에 의한 처리 및 잠재 증발의 움직임에 공기에 노출을 방지하기 위해 충분히 physa을 포함해야한다. 플레이트 또는 우물 뚜껑이 있어야합니다. </li><li> 3.3 각각의 실험적인 치료를 위해 각 웰 예약에 적어도 5 physa를 수집 - 반복 3.1 단계를 반복합니다. </li><li> 잠하는 온도에서 physa을 품어계획된 실험 심문에 대한 재생의 최고 속도를 IDE. 중생의 원하는 속도에 의해 결정되는 고정 된 온도에서 온도 조절 배양기에 physa을 포함하는 판을 놓습니다. 참고 : physa이 누락 된 조직을 재생, 15 및 27 ° C 사이의 온도에서 배양 할 때 전체 용종을 형성 할 것이다. 재생 속도는 처음 두 단계 제외한 온도 의존적이다. 모든 온도에 대해 4 단계에 도달 평균 하루는 절단 후 7 일 이내입니다,이 또한 21 ° C에서의 재생과 일치한다. 27 ° C에서 4 단계는 약 3 일 이전에 도달하고 15 ° C에서, 4 단계는 21 ° C (또한 참조 참조 10)에서 재생에 비해 약 3 일 지연됩니다. </li></ol> 4. Nematostella 회생 준비 시스템과 재생을 평가 (NRSS) <ol><li> 변수 magnific와 스테레오 화합물 현미경을 사용하여 physa 점수ATION (10 - 80X). 스테이지 0으로 갓 잘라 Nematostella의 physa 점수와 동시에 NRSS (10)를 사용하여 매일 포스트 절단 (DPA)에 점수를 계속합니다. 참고 : 키 준비 기준 및 세부 사항 참조 (10)를 참조하십시오. <ol><li> 갓 잘라 physa이 이완 풍선을 닮은 컵 - 모양의 덩어리로 나타나는 경우 열려있는 상처 부위로, 스테이지 0 (오픈 상처) 등 physa 점수 것은 가능성을 볼 수 있습니다. 주 : 상처의 가장자리는 처음부터 뭉쳐 수 있지만, 티슈 계속 축소되고 강성이 부족하다. 오픈 상처의 가장자리는 상처 치유 등의 방사형 수축을 겪고 관찰 할 수있다. </li><li> 절단 상처가 닫혀 나타나는 경우 1 단계 (폐쇄 상처) 등 physa 점수. 주 : 상처 위치가 미래 경구 자극에 해당 할 것이다. 미래 구두 극 주변의 외부 표면은 기본 방사상으로 대칭 내배엽 mesenterial 삽입에 해당하는 별개의 아치를 표시하기 시작할 수 있습니다. </li><li> 점수 산도YSA 구강 극의 표면이 방사상으로 대칭 패턴으로 배열하고 홈으로 구분 팔 제기 아치를 공개, 비정상적으로 나타나는 경우 2 단계 (레이디 얼 아치) 등. 아치의 정점에 작은 반구형 소포을 준수하십시오. 그들은 같은 높이 넓은 가능성 과도 대해, 그리고 초기 단일 외배엽 세포 층에 의해 구성된다. 참고 : 어떤 경우에는 두 층 소포가 안정 수 있습니다. 참고 :이 이상이 단계에서 점액 층이 physa 멤브레인 &#39;시스&#39;에서 (그림 2) 캡슐화 나타날 수 있습니다. 이 밀봉재 득점을 용이하게 제거되어야한다. </li><li> 내배엽과 외배엽 조직 층을 포함하는 촉수의 싹이 안정적으로 적어도 일부 반경 아치의 구두 끝 부분에 형성되어있는 경우 3 단계 (촉수)로 physa 점수. 참고 : 촉수들이 넓은하고 최소한의 운동성보다 길다. physa 증가 보여하지만, 장간막의 초보가 마주 변수 인플레이션이 될 수 있도록체강 (coelenteron)에 mesenterial 삽입에서 연장 ible. </li><li> physa들이 연결 표시되는 위치에서 측정 된 두 배로 반경 폭 이상입니다 구강 - 반구 길이로, 몸 벽에 삽입에서 coelenteron로 연장 팔 구별, 눈에 보이는 장간막이 포함 된 경우 4 단계 (선형 장간막)로 physa 점수 그 반구 끝 (enterostome)에서 인두합니다. 참고 : 네 개 이하의 장간막은 &quot;주름&quot;내부 무료 가장자리가. 인두 볼 수 있습니다. 이상 팔 촉수는 운동성, 볼 수 있습니다 때때로 그들은 몸으로 계약. </li><li> physa이 주름과 개 이상의 장간막을 가지고 있으며, 주름 무대 동물은 거의 &quot;정상&quot;성인 외관이 4보다 더 완전하고 꾸불 꾸불 한 경우 5 단계 (우세 주름 장간막)로 physa 점수 있지만 볼 수는 없다 생식 세포. </li></ol></li></ol>

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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+cellular+and+molecular+mechanisms.">Autophagy: cellular and molecular mechanisms.</a> J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).</li><li>Rodolfo, C., Di Bartolomeo, S., Cecconi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+stem+and+progenitor+cells.">Autophagy in stem and progenitor cells.</a> Cell Mol Life Sci. 73 (3), 475-496 (2016).</li><li>Guan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+stem+cells.">Autophagy in stem cells.</a> Autophagy. 9 (6), 830-849 (2013).</li><li>Phadwal, K., Watson, A. S., Simon, A. 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The authors have nothing to disclose.

상처 치유 및 재생의 모델로 Nematostella의 사용은 점점 더 인기를 끌고있다. 따라서,이 할당과 비교 될 수 효과적인 세포 및 분자 분석 전에 특정 프로토콜의 형태 패턴을 가시화 할 수있는 것이 중요하다. 삶의 포스트 플랜 울라 단계에서, 거의 모든 위치에서 절단 누락 된 구조를 개혁 할 수있는, 재생 &quot;유연성&quot;의 높은 수준을 Nematostella. 따라서, 여러 연구자들은 다른 연령대에,...

하나의 히드라의 재생의 관찰 실험 과학 1, 2 등 생물학의 출현에 정액 사건이었다. 재생은 생물학에 매우 폭 넓은 매력의 현상 유지와 비슷하게 사람을 누워. 인간의 재생에 한계를 이해하고 극복하기 위해 발달 생물 학자, 의사, 의학자 및 조직 엔지니어를위한 잠재력은 더 본질적으로 재미보다 재생 생물학을합니다. 이제, 이러한 게놈 시퀀싱 및 이득 및 기능 도구의 손실과 같은 새로운 기술의 사용으로, 필드가 떨어져 재생 메커니즘을 애타게 태세 궁극적으로 재생하는 방법을 다양한 종 이해할 수있는 동안 다른 사람은 할 수 없습니다. 분자 세포 및 형태 학적 반응에 공통성의 정도는 밝혀지지 남아 있지만 지금까지 그것을 다시 생성 할 수 있습니다 동물 중 기본 응답이 있었다 imagi있는 것보다 더 유사하다는 것을 나타납니다NED 만 10 년 전 3. 특히 자포 동물은 형태 학적 다양성의 폭 넓은 스펙트럼 속에서 거의 모든 신체 부위의 재생에서 손쉬운 있습니다. 고독한 신선한 물 용종에서 히드라는 포르투갈 사람-O-전쟁과 같은 복잡한 식민지 siphonophores에, 거대한 산호초를 구축 작은 해양 폴립과 함께, 재생을위한 메커니즘 이외에, 자주 재생하는 모드입니다 수리 또는 부상 포식으로 인해 손상되거나 손실 된 신체 부위를 개혁. 자포 동물의 다양한 종의 재생을 위해 유사하거나 다른 메커니즘을 사용할지 여부를 근본적으로 흥미로운 질문 4-6이다. 우리와 다른 사람들이 anthozoan을 개발 한 Nematostella는 재생 7-17 모델로 vectensis. 우리는 최근 abora부터 타개 조직의 형태 학적으로 균일 한 편에서 전신의 재생을 설명하기위한 스테이징 시스템을 개발폴립 (10)의 리터 끝. 모든 수준에서 양분 때 Nematostella 용종이 다시 생성 할 수 있지만, 우리는이 자연 무성 분열 (18)의 정상 평면에 가까운 때문에 부분적으로 가장 형태 학적으로 단순한 지역의 physa의 반구 위치에 성인을 삭감하기로 결정하고, 또한 때문에 허가 관찰하고 몸 전체가 단순한 형태 구성 요소에서 재 조립하는 방법의 분자 분석. Nematostella 재생 스테이징 시스템 (NRSS)은 일반 배양 조건에서, 절단 physa에 의해 재생의 모든 측면의 진행을 득점하는 데 사용할 수 형태 벤치 마크의 비교적 간단한 세트를 제공하거나 실험적으로 같은 작은 분자 치료, 유전자 조작으로 상황을 교란 , 또는 환경 변경. 예상 된 바와 같이, 재생은 NRSS의 세포 및 분자 이벤트가 참조 할 수있는 형태소 지지체로서 채택되고10. 마지막으로 절단 우리의 방법은 최근의 연구 (17)에 사용되는 핀 포인트 구멍보다 큰 크기의 벌어진 구멍 여러 주문을 생산하고, 아직 모두 상처를 6 시간의 주위에 치유. 상처 봉합의 시각 체포와 별개의 단계를 문서화하는 것은 상처의 크기와이 종료하는 데 걸리는 시간의 외관상의 독립성을 설명하는 실험 방법을 제안한다. 따라서,이 프로토콜에 의해 제공되는 반구 절단 공정의 깊은 시각적 이해는,이 모델은 재생 시스템으로 추가 조사를 돕고 Nematostella의 vectensis를 사용하여이 스테이징 시스템의 적용 범위를 확장 할 것이다.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Nematostella vectensis,&lt;/em&gt; adults</td><td>Marine Biological Lab (MBL)</td><td></td><td>non-profit supplier</td></tr><tr><td>Glass Culture Dish, 250 mL</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>741004</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>Glass Culture Dish, 1,500 mL</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>741006</td><td>1,500 mL</td></tr><tr><td>Polyethylene transfer pipette, 5&amp;nbsp;mL</td><td>USA Scientific&amp;nbsp;</td><td>1022-2500</td><td>narrow bore, graduated</td></tr><tr><td>Polyethylene transfer pipet, tapered</td><td>Samco</td><td>202-205</td><td>cut off 1 inch of tip to make wide bore</td></tr><tr><td>Disposable Scalpel</td><td>Feather Safety Razor Co. Ltd</td><td>no. 10</td><td>blade should be curved</td></tr><tr><td>#5 Dumont Fine point tweezers</td><td>Roboz</td><td>RS5045</td><td>alternative suppliers available</td></tr><tr><td>Pyrex Petri dish, 100 mm diameter</td><td>Corning</td><td>3160</td><td>can substitute other glass Petri plates</td></tr><tr><td>Sterile 6-well plate</td><td>Corning Falcon&amp;nbsp;</td><td>353046</td><td>or similar from other manufacturer</td></tr><tr><td>Sterile 12-well plate</td><td>Nunc&amp;nbsp;</td><td>150628</td><td>or similar from other manufacturer</td></tr><tr><td>Sterile 24-well plate</td><td>Cellstar, Greiner bio-one</td><td>662-160</td><td>or similar from other manufacturer</td></tr><tr><td>Brine shrimp hathery kit</td><td>San Francisco Bay; drsfostersmith.com</td><td>CD-154005</td><td>option for growing brine shrimp</td></tr><tr><td>pyrex baking dish</td><td>common in grocery stores</td><td></td><td>option for growing brine shrimp</td></tr><tr><td>artificial seawater mix 50 gal or more&amp;nbsp;</td><td>Instant Ocean; drsfoster-smith.com</td><td>CD-116528</td><td>others brands may suffice</td></tr><tr><td>Plastic tub for stock ASW preparation</td><td>various</td><td></td><td>common 25 gallon plastic trash can OK</td></tr><tr><td>Polypropylene Carboy</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>716391</td><td>For working stock of ASW @ 12 ppt</td></tr><tr><td>Beaker, Graduated, 4,000 mL</td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>B199</td><td>For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt</td></tr><tr><td>Stereomicroscope and light source</td><td>various&amp;nbsp;</td><td></td><td>with continuous 1 - 40X magnification</td></tr></tbody></table>

inducing complete polyp regeneration from the aboral physa of the starlet sea anemone nematostella vectensis

자포 동물, 특히 히드라가 손상되거나 절단 구조 및 참으로 틀림없이 250 개 이상의 년 전 Trembley의 작품을 통해 현대 생물학의 질문을 출시 이러한 연구를 다시 생성하는 것으로 첫 번째 동물했다. 현재 재생의 연구는 스폰지에서 포유 동물을 통해 같은 히드라, planaria 및 Urodeles 등 모두 &quot;고전적인&quot;재생 생물을 이용하여 부활뿐만 아니라, 후생 동물의 범위에 걸쳐 종의 확대 스펙트럼을 볼 수있다. 생물학적 현상과 같은 고유의 관심 외에도, 재생이 종의 다양한 작동 방식을 이해하는 재생 과정이 일반적인 기능 및 / 또는 종 또는 상황에 특정 세포 및 분자 메커니즘을 공유하는지 여부에 대한 정보를 통보하는 것입니다. 작은 별의 말미는 Nematostella의 vectensis는 재생을위한 신흥 모델 생물이다. 히드라처럼, Nematostella하지만 t에서, 고대 문, 자포 동물의 구성원 인그는 클래스 산호충 강, 진화 적으로 더 기초 인 히드로 충에 자매 계통 군. Nematostella에서 재생의 따라서 측면을 비교하고 히드라 등 자포 동물의 것과 대조 흥미로운 일이 될 것이다. 이 글에서, 우리는 이등분 관찰하고 physa 호출되는 Nematostella 성인의 반구 끝의 재생을 분류하는 방법을 제시한다. physa 자연스럽게 무성 생식의 수단으로 분열을 거쳐, 자연 분열 또는 physa 수동 절단 중 하나는 복잡한 형태학의 재 성장과 개혁을 트리거합니다. 여기서 우리는 Nematostella 재생 준비 시스템합니다 (NRSS)에 다음의 간단한 형태 학적 변화를 성문화했다. 우리는 클로로퀸의 효과, 리소좀 기능 블록의 자식 작용의 억제제를 테스트 할 NRSS를 사용합니다. 결과는 자식 작용이 억제 될 때 용종 구조, 특히 장간막의 재생이 비정상이라고 나타낸다.

절단 된 physa에서 재생하는 동안 형태 학적 이벤트의 진행은 각 NRSS 단계에서 physa의 대표적인 전망을 포함 그림 1A에 표시됩니다. 전형적인 physa 컷 사이트는 성인 (화살촉)에 표시됩니다. 그림 1A의 사진은 완전히 형성 용종을 통해 갓 잘라 physa에서 구강 및 신체 구조의 점진적 재생을 보여줍니다. 도 1b는 각각 4 단계 및 5 단계에서의 ?...

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Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

작은 별 말미의 반구 Physa에서 전체 폴립 재생을 유도<em&gt; Nematostella의 vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

inducing-complete-polyp-regeneration-from-aboral-physa-starlet-sea

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

8.5K 조회수.  Stony Brook University. Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

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Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to any type of injury. Common injury models in these animals remove large amounts of tissue, which damages multiple organs. To overcome this broad tissue damage, we describe here a method to selectively remove a single organ, the pharynx, in the planarian Schmidtea mediterranea. We achieve this by soaking animals in a solution containing the cytochrome oxidase inhibitor sodium azide. Brief exposure to sodium azide causes extrusion of the pharynx from the animal, which we call &#34;chemical amputation.&#34;&#160;Chemical amputation removes the entire pharynx, and generates a small wound where the pharynx attaches to the intestine. After extensive rinsing, all amputated animals regenerate a fully functional pharynx in approximately one week. Stem cells in the rest of the body drive regeneration of the new pharynx. Here, we provide a detailed protocol for chemical amputation, and describe both histological and behavioral methods to assess successful amputation and regeneration.

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

The planarian Schmidtea mediterranea is an excellent model for studying stem cells and tissue regeneration. This publication describes a method to selectively remove one organ, the pharynx, by exposing animals to the chemical sodium azide. This protocol also outlines methods for monitoring pharynx regeneration.

화학 절단 및 Planarian Schmidtea 지중해 에 인 두의 재생

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

연구

발생학

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model organism to study wound healing and subsequent cell regeneration. The Stentor genome became available recently, along with modern molecular biology methods, such as RNAi. These tools make it possible to study single-cell regeneration at the molecular level. The first section of the protocol covers establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, along with general guidelines for maintaining Stentor cultures. Culturing Stentor in large quantities allows for the use of valuable tools like biochemistry, sequencing, and mass spectrometry. Subsequent sections of the protocol cover different approaches to inducing regeneration in Stentor. Manually cutting cells with a glass needle allows studying the regeneration of large cell parts, while treating cells with either sucrose or urea allows studying the regeneration of specific structures located at the anterior end of the cell. A method for imaging individual regenerating cells is provided, along with a rubric for staging and analyzing the dynamics of regeneration. The entire process of regeneration is divided in three stages. By visualizing the dynamics of the progression of a population of cells through the stages, the heterogeneity in regeneration timing is demonstrated.

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

The giant ciliate, Stentor coeruleus, is an excellent system to study regeneration and wound healing. We present procedures for establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, inducing regeneration by cutting cells, chemically inducing the regeneration of membranellar band and oral apparatus, imaging, and analysis of cell regeneration.

Stentor 에 중생의 연구 방법

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Genotyping of Sea Anemone during Early Development

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the life of the animal. Following in vitro fertilization and de-jellying, zygotes are allowed to develop for 24 h at room temperature to reach the early- to mid-gastrula stage. The gastrula embryos are then placed on an agarose gel bed in a Petri dish containing seawater. Under the dissecting microscope, a tungsten needle is used to surgically separate an aboral tissue fragment from each embryo. Post-surgery embryos are then allowed to heal and continue development. Genomic DNA is extracted from the isolated tissue fragment and used as a template for locus-specific PCR. The genotype can be determined based on the size of PCR products or presence/absence of allele-specific PCR products. Post-surgery embryos are then sorted according to the genotype. The duration of the entire genotyping process depends on the number of embryos to be screened, but it minimally requires 4&#8211;5 h. This method can be used to identify knockout mutants from a genetically heterogeneous population of embryos and enables analyses of phenotypes during development.

The goal of this protocol is to genotype the sea anemone Nematostella vectensis during gastrulation without sacrificing the embryo.

초기 개발 중 바다 말미잘의 지질 형질이

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the ...

Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential for designing new molecular tools. Sea anemone venom locates in glandular cells from ectoderm and sub-cellular structures called nematocysts, both of which are distributed throughout the sea anemone body. This characteristic implies challenges because the cells and nematocyst must be lysed to release the venom components with other non-toxic molecules. Therefore, first, the venom is derived from a crude extract (mixture of different and diverse molecules and tissue debris). The next step is to detect polypeptides with specific bioactivities. Here, we describe an efficient strategy to obtain the sea anemone crude extract and bioassay to identify the presence of cytolysins. The first step involves inexpensive and straightforward techniques (stirred and freeze-thaw cycle) to release cytolysins. We obtained the highest cytolytic activity and protein (~500 mg of protein from 20 g of dry weight). Next, the polypeptide complexity of the extract was analyzed by SDS-PAGE gel detecting proteins with molecular weights between 10 kDa and 250 kDa. In the hemolytic assay, we used sheep red blood cells and determined HU50 (11.1 &plusmn; 0.3 &#181;g/mL). In contrast, the presence of phospholipases in the crude extract was determined using egg yolk as a substrate in a solid medium with agarose. Overall, this study uses an efficient and inexpensive protocol to prepare the crude extract and applies replicable bioassays to identify cytolysins, molecules with biotechnological and biomedical interests.

Here, we describe a protocol to obtain crude venom extract from sea anemone and detect its hemolytic and phospholipase activity.

간단한 생물 분석법에 의한 바다 아네몬의 조추출물에서 용혈성 및 포스포리파아제 활성의 확인

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential ...

생화학

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

약리 및 기능성 유전자 Assays은 Planarian의 재생을 조작하는<em자포니카> Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

생물학

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

신경이없는 세대의 장기간 유지 관리<em&gt; 히드라</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

신경과학

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian regeneration of any missing or damaged tissues is made possible by adult stem cells termed neoblasts3. Although these stem cells have been definitively shown to be pluripotent and singularly capable of reconstituting an entire animal4, the heterogeneity within the stem cell population and the dynamics of their cellular behaviors remain largely unresolved. Due to the large number and wide distribution of stem cells throughout the planarian body plan, advanced methods for manipulating subpopulations of stem cells for molecular and functional study in vivo are needed.
Tissue transplantation and partial irradiation are two methods by which a subpopulation of planarian stem cells can be isolated for further study. Each technique has distinct advantages. Tissue transplantation allows for the introduction of stem cells, into a na&iuml;ve host, that are either inherently genetically distinct or have been previously treated pharmacologically. Alternatively, partial irradiation allows for the isolation of stem cells within a host, juxtaposed to tissue devoid of stem cells, without the introduction of a wound or any breech in tissue integrity. Using these two methods, one can investigate the cell autonomous and non-autonomous factors that control stem cell functions, such as proliferation, differentiation, and migration.
Both tissue transplantation5,6 and partial irradiation7 have been used historically in defining many of the questions about planarian regeneration that remain under study today. However, these techniques have remained underused due to the laborious and inconsistent nature of previous methods. The protocols presented here represent a large step forward in decreasing the time and effort necessary to reproducibly generate large numbers of grafted or partially irradiated animals with efficacies approaching 100 percent. We cover the culture of large animals, immobilization, preparation for partial irradiation, tissue transplantation, and the optimization of animal recovery. Furthermore, the work described here demonstrates the first application of the partial irradiation method for use with the most widely studied planarian, Schmidtea mediterranea. Additionally, efficient tissue grafting in planaria opens the door for the functional testing of subpopulations of na&iuml;ve or treated stem cells in repopulation assays, which has long been the gold-standard method of assaying adult stem cell potential in mammals8. Broad adoption of these techniques will no doubt lead to a better understanding of the cellular behaviors of adult stem cells during tissue homeostasis and regeneration.

An effective method for grafting tissue of defined and consistent size between planaria is described. Also included is a description of how the immobilization technique used for transplantation can be adapted, in conjunction with lead shields, for the partial irradiation of live animals.

Planarian의 부동화, 부분 조사 및 조직 이식

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

의 미세 주입을위한 방법<em&gt; Patiria의 minata</em&gt; 접합자

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Inducing Polyp Bail-out in Coral Colonies to Obtain Individualized Micropropagates for Laboratory Experimental Use

Corals are colonial animals formed by modular units called polyps. Coral polyps are physiologically linked and connected by tissue. The phenomenon of polyp bail-out is a process induced by acute stress, in which coral polyps digest the tissue connecting them to the rest of the colony and ultimately detach from the skeleton to continue living as separate individuals. Coral biologists have acknowledged the process of polyp bail-out for years, but only recently the micropropagates generated by this process have been recognized as a model system for coral biology studies. The use of polyp bail-out can create a high number of clonal units from a single coral fragment. Another benefit is that single polyps or patches of polyps can be easily visualized under a microscope and maintained in highly standardized low-cost environments such as Petri dishes, flasks, and microfluidic chips. The present protocol demonstrates reproducible methods capable of inducing coral micropropagation and different approaches for maintaining the single polyps alive in the long term. This methodology was capable of successfully cultivating polyps of the coral species Pocillopora verrucosa for up to 8 weeks after bail-out, exhibiting the practicality of using individual coral polyps for coral research.

Polyp bail-out is a process induced by acute stress, in which coral polyps digest the tissue connecting them to their colony and detach from it to live as individuals. The present protocol describes how to induce coral micropropagation by bail-out using hypersaline or calcium-free seawater treatments.

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Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

All animal organs, from the skin to eyes to intestines, are covered with sheets of epithelial cells that allow them to maintain homeostasis while protecting them from infection. Therefore, it is not surprising that the ability to repair epithelial wounds is critical to all metazoans. Epithelial wound healing in vertebrates involves overlapping processes, including inflammatory responses, vascularization, and re-epithelialization. Regulation of these processes involves complex interactions between epithelial cells, neighboring cells, and the extracellular matrix (ECM); the ECM contains structural proteins, regulatory proteins, and active small molecules. This complexity, together with the fact that most animals have opaque tissues and inaccessible ECMs, makes wound healing difficult to study in live animals. Much work on epithelial wound healing is therefore performed in tissue culture systems, with a single epithelial cell-type plated as a monolayer on an artificial matrix. Clytia hemisphaerica (Clytia) provides a unique and exciting complement to these studies, allowing epithelial wound healing to be studied in an intact animal with an authentic ECM. The ectodermal epithelium of Clytia is a single layer of large squamous epithelial cells, allowing high-resolution imaging using differential interfering contrast (DIC) microscopy in living animals. The absence of migratory fibroblasts, vasculature, or inflammatory responses makes it possible to dissect the critical events in re-epithelialization in vivo. The healing of various types of wounds can be analyzed, including single-cell microwounds, small and large epithelial wounds, and wounds that damage the basement membrane. Lamellipodia formation, purse string contraction, cell stretching, and collective cell migration can all be observed in this system. Furthermore, pharmacological agents can be introduced via the ECM to modify cell:ECM interactions and cellular processes in vivo. This work shows methods for creating wounds in live Clytia, capturing movies of healing, and probing healing mechanisms by microinjecting reagents into the ECM.

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

This paper describes a method to create wounds in the epithelium of a live Clytia hemisphaerica medusa and image wound healing at a high resolution in vivo. Additionally, a technique to introduce dyes and drugs to perturb signaling processes in the epithelial cells and extracellular matrix during wound healing is presented.

작은 별 말미의 반구 Physa에서 전체 폴립 재생을 유도

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Cnidarian 모델 유기체 Clytia hemisphaerica를 사용한 생체 내 상피 상처 치유 특성화