Diese Arbeit wurde von einem New Yorker Stem Cell Science (NYSTEM C028107) Grant unterstützt GHT.

1. Vorbereitung der Tiere für Temperatur, Ernährung und Hell / Dunkel-Zyklus <ol><li> Erhalten Nematostella vectensis Erwachsene aus einem der zahlreichen Nematostella Labors weltweit, oder Non-Profit - Anbieter (Tabelle 1) </li><li> Aufrechterhaltung Nematostella bei konstanter Temperatur (typischerweise zwischen 18 und 21 ° C) im Dunkeln, in &quot;1 / 3x&quot; künstlichem Meerwasser (ASW) in einer Salinität von 12 Teilen pro Tausend (ppt). Pflegen Kulturen in einfachen Kalk-Natron-Glas Kulturschalen, in der Regel 250 ml oder 1,5 l Kapazität 11. Hinweis: Diese einfachen Kulturbedingungen werden häufig unter Labors verwendet , die Nematostella studieren, aber Kultur Pflege kann auch 19 automatisiert werden. </li><li> Feed - Nematostella frisch geschlüpften Artemianauplien 2 - 4x pro Woche. Hatch Artemia Zysten in voller Stärke (36 ppt) oder 1 / 3x ASW bei 30 ° C, in einem flachen rechteckigen Glasschale 20 oder ineine beliebige Anzahl von kleinen, kommerzielle oder hausgemachte Artemia Brütereien. Wenn ein Inkubator nicht verfügbar ist, Garnelen wird bei RT schlüpfen aber nicht so langsam mehr. Hinweis: Dies erfordert oft mehr als 24 Stunden für die Fertigstellung. </li><li> Ersetzen Anemone Kultur Wasser mindestens einmal pro Woche. Für beste Erwachsene Gesundheit, gründlich zu reinigen (ohne Seife) Schüsseln die Kultur einmal pro Woche von angesammeltem Schleimabsonderungen, die die Schüssel Mantel und kann Falle Futterreste und Abfall, und die Tiere verstricken. </li></ol> 2. Auswahl und Entspannung der Ernährungsphysiologisch Anlage Tiere <ol><li> Wählen Sie Größe abgestimmte Polypen von etwa der gleichen Länge (3 - 5 cm, wenn natürlich entspannt) und legen Sie sie in eine Schüssel aus der Kolonie getrennt für drei Tage vor der Amputation. Hinweis: Die Anzahl der Tiere zum Schneiden ausgewählt wird durch das Experiment bestimmt werden wird durchgeführt, natürlich, aber im Allgemeinen empfehlen wir mindestens fünf Tiere pro Probenpunkt mit sechs Replikationen. So,in einem typischen Versuch würde ein Minimum von 30 Tieren vorgewählt werden. Im Allgemeinen ist es ratsam, mehr als die Mindestzahl (30) seit Amputationen zu wählen, die unregelmäßig sind (siehe unten) können Scoring später auswirken. </li><li> Entfernen Sie die Schale von ausgewählten Tieren aus dem Inkubator in Raumlicht mindestens eine Stunde vor der Amputation. Hinweis: Die Exposition gegenüber Raumlicht und Schwingungen der Handhabung wird wahrscheinlich die Tiere verursachen schrumpfen, also müssen sie durch Inkubation auf dem Labortisch angepasst oder &quot;entspannt&quot; werden. Die Tiere werden sich Feuerfest- und Lichtexposition zu berühren und an diesem Punkt kann durch vorsichtiges Pipettieren bewegt werden. </li><li> Optional: Anesthetize die Tiere um 7,5% MgCl 2 Zugabe (in 1 / 3x ASW). Sanft fügen Sie die MgCl 2 - Lösung mit einem Standard - Kunststoff - 5 - ml - Pipette in die Schüssel. Hinweis: Obwohl Tiere schließlich gewöhnt, wird dem Licht und physikalische Manipulation kann es vorteilhaft sein, Tiere zu betäuben zu erhalten oder zu &quot;reparieren&quot; ter entspannte Zustand , nachdem sie länglichen 16,21,22 geworden sind. </li><li> Verwenden Sie eine große Bohrung (&gt; 0,5 cm) Plastikpipette zu übertragen (in 1 / 3x ASW) fünf Tiere aus dem Pool amputiert werden, in den Boden einer sterilen Glasschneideschale von 100 mm Durchmesser mit 12 ppt ASW. Die Schale auf die Bühne eines Stereomikroskops mit variabler Vergrößerung zwischen 10 - 40X. Hinweis: Wurden die Tiere nicht betäubt worden und entspannt zum Schneiden, können sie immer noch zu berühren und Stereoskop Beleuchtung reagieren und damit ein paar Minuten brauchen kann wieder entspannt zu werden. </li></ol> 3. Amputation <ol><li> Mit einem sterilen Skalpell, amputiert die aboral Physa von jeder Polyp, mit dem Ziel, einen Abschnitt des Physa zu erhalten, die etwa so lang ist wie breit und kein Mesenterium enthielt. Hinweis: Die ideale Schnittbaustelle zur Beendigung des Mesenteriums nur aboral ist. Auf der Ebene des Schneidens gibt es einen Übergang von Gekröse eigentlichen dünnen lines zu jeder mesenteriales Einfügung entsprechenden (siehe Abbildung 1, Pfeile). Das Fehlen von Gekröse ist kritisch , weil es produziert Schleim, der &quot;Verstopfung&quot; das Loch 17,30 erleichtern kann. <ol><li> Platzieren Sie die Skalpellklinge in Kontakt mit dem Tier an der gewünschten Stelle der Amputation. Tun Sie dies entweder ohne fremde Hilfe (freihändig) oder durch sanft den Körper des Tieres mit einem # 5 Zange (Dumont Stil oder ähnliches) zu erfassen. </li><li> Schneiden durch das Gewebe durch die gebogene Klinge des Skalpells Nutzung in einem Rucken Bewegung über den Körper. Hinweis: Das Gewebe sollte sauber durchtrennen, wie das Skalpell geschwenkt wird und befreien den Abschnitt von Physa vom Spender gewünscht. Wenn jedoch ein kleines Stück Gewebe noch den Körper und den Physa verbindet, schneiden Sie es mit dem Skalpell. Versuchen Sie nicht, durch Ziehen der verbundenen Stücke trennen, da dies den Physa beschädigen können. </li></ol></li><li> Entfernen Sie jede amputierte &quot;Spender&quot; Polyp aus der Schale und senden es an einem sepaRate Schüssel &quot;gepoolt Amputierte&quot; markiert; datieren die Schüssel und senden es an Stammkultur. Hinweis: Amputierte Polypen wird die aboral Wunde innerhalb eines Tages heilen und dann normal gefüttert werden kann. Sie werden eine normal aussehende Physa innerhalb von zwei Wochen, an welcher Stelle regenerieren die Physa wieder amputiert werden kann, falls gewünscht. </li><li> Spülen Sie das exzidiert Physa, die in 12 ppt ASW in der Schneidschale verbleiben, dann Transfer jedes Physa in eine separate sterile auch in einem Multi-Well-Zellkulturplatte, die bereits 10 ml 12 ppt ASW hat in jeder Vertiefung. Hinweis: Dieses Beispiel eine sechs-Well-Platte verwendet, mit jedem gut hält 10 ml Meerwasser und fünf excised Physa. Im allgemeinen Meerwasser sollte die Physa decken ausreichend Kontakt mit Luft zu vermeiden, aufgrund der Bewegung in der Handhabung und potentielle Verdunstung. Die Platte oder Brunnen sollte einen Deckel haben. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,3 für jede experimentelle Behandlung mindestens 5 Physa in jeder Vertiefung zurückhaltender zu sammeln. </li><li> Inkubieren Sie die Physa bei einer Temperatur, die prov wirdide den günstigsten Preis der Regeneration für die geplanten experimentellen Verhöre. Die Platte, die Physa in einen temperaturgeregelten Inkubator enthält, bei einer festen Temperatur von der gewünschten Rate der Regeneration bestimmt. Hinweis: Die Physa regenerieren Gewebe und bilden eine vollständige Polyp fehlen, wenn zwischen 15 und 27 ° C bei Temperaturen inkubiert. Die Regenerationsrate temperaturabhängig ist mit Ausnahme der ersten beiden Stufen. Die durchschnittliche Tag für das Erreichen Stufe 4 für alle Temperaturen 7 d nach dem Schneiden und dies deckt sich auch mit der Regeneration bei 21 ° C. Bei 27 ° C, Stufe 4 wird etwa 3 Tage früher erreicht und bei 15 ° C, Stufe 4 wird von etwa 3 d im Vergleich zu Regeneration bei 21 ° C (siehe auch Referenz 10) verzögert. </li></ol> 4. Bewertung Regeneration mit dem Nematostella Regeneration Staging System (NRSS) <ol><li> Ergebnis der Physa mit einem Stereomikroskop Verbindung mit variabler magnification (10 - 80X). Ergebnis der frisch geschnittenen Nematostella Physa als Stufe 0 und weiter Scoring zur gleichen Zeit jeden Tag nach der Amputation (dpa) mit dem NRSS 10. Hinweis: Für die Schlüssel Inszenierung Kriterien und Details siehe Referenz 10. <ol><li> Score Physa als Stufe 0 (offene Wunde), wenn ein frisch geschnittenem Physa erscheint als schalenförmige Masse einen schlaffen Ballon ähnelt, mit einer offenen Wunde ist wahrscheinlich sichtbar. Hinweis: Die Wundränder können auch zusammenhalten von Anfang an, aber das Gewebe wird noch zusammengeklappt werden, und es fehlt ihnen Steifigkeit. Die Ränder der offenen Wunde kann eine radiale Kontraktion als die Wunde heilt beobachtet werden, unterziehen. </li><li> Score Physa als Stufe 1 (Wunde geschlossen), wenn die Amputation Wunde geschlossen erscheint. Hinweis: Wund Standort für die Zukunft oralen Pol entsprechen. Die Außenfläche rund um die Zukunft oralen Pol beginnen kann entsprechend den zugrunde liegenden radial symmetrischen endodermaler mesenteriales Einfügungen unterschiedliche Bögen anzuzeigen. </li><li> Score physa als Stufe 2 (radiale Bögen), wenn die Oberfläche der Mund pole aufgeblasen erscheint, acht erhöht Bögen in einem radialsymmetrischen Muster angeordnet sind offenbart und durch Rillen getrennt sind. Beobachten kleine, halbkugelige blebs an der Spitze der Bögen. Sie werden in etwa so hoch wie breit, wahrscheinlich vorübergehend sein und zunächst durch eine einzige ektodermale Zellschicht besteht. Hinweis: In einigen Fällen doppelschichtigen blebs stabilisieren kann. Hinweis: Bei dieser oder späteren Stadien eine Schleimschicht erscheinen die Physa (Abbildung 2) in einer membranartigen &#39;Mantel&#39; zu verkapseln. Das Verkapselungsmaterial sollte Scoring zu erleichtern entfernt werden. </li><li> Score Physa als Stufe 3 (Tentakel), wenn die Knospen der Tentakeln enthält endodermaler und ektodermalen Gewebeschichten sind stabil in der mündlichen Ende wenigstens einigen radialen Bögen gebildet. Hinweis: Die Fühler sind länger als breit sind und sind minimal beweglich. Die Physa wird zeigen, erhöht, aber variable Inflation, so dass Gekröse Rudimente kann vis werdenIVK vom mesenterialen Einführen in die Körperhöhle erstreckt (coelenteron). </li><li> Score Physa als Stufe 4 (Linear Mesenterien), wenn die Physa enthält acht verschiedene, sichtbare Gekröse, die in die coelenteron von Einfügungen in der Körperwand erstrecken, mit oral-aboralen Längen, die mehr als das Doppelte ihrer radialen Breite sind gemessen, von wo sie erscheinen zu verbinden zu den Rachen an seinem aboral Ende (enterostome). Hinweis: vier oder weniger Gekröse &quot;gefaltete&quot; interne freie Kanten aufweisen. Der Rachen ist sichtbar. Mehr als acht Tentakeln sichtbar sind, beweglich und manchmal in den Körper sie schrumpfen. </li><li> Score Physa als Stufe 5 (vorwiegend Plissee Mesenterien), wenn die Physa mehr als vier Gekröse mit Plissee hat, und das Plissee ist voll und gewundenen als in Stufe 4. Das Tier eine fast &quot;normalen&quot; Erwachsenen Aussehen hat, aber es gibt keine sichtbaren Gonadenzellen. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Die Verwendung von Nematostella als Modell der Wundheilung und Regeneration wird immer beliebter. Somit ist es wichtig, die morphologische Muster eines bestimmten Protokolls vor dem wirksamen zellulären und molekularen Analysen zu können, können zur Visualisierung zugeordnet und verglichen werden. Nematostella haben ein hohes Maß an regenerativen &quot;Flexibilität&quot;, fast jedes fehlende Struktur an jeder Stelle amputiert zu reformieren , in der Lage, bei post-Planula Phasen des Lebens. So hab...

Die Beobachtung der Regeneration in einem einzigen hydra war das wegweisendes Ereignis in dem Aufkommen der Biologie als experimentelle Wissenschaft 1,2. Regeneration bleibt ein Phänomen der außerordentlich breiten Appell an Biologe und Laien gleichermaßen. Das Potenzial für die Entwicklungsbiologen, Kliniker, biomedizinische Wissenschaftler und Gewebe - Ingenieure zu verstehen und die Grenzen für die menschliche Regeneration überwinden macht mehr Regenerationsbiologie als eigen interessant. Jetzt, mit dem Einsatz neuer Technologien wie der Genomsequenzierung und Gewinn und Verlust der Funktion Tools, wird das Feld balanciert auseinander regenerative Mechanismen zu necken und um schließlich zu verstehen, wie verschiedene Arten regenerieren kann, während andere nicht können. Der Grad der Gemeinsamkeit in der molekularen, zellulären und morphologischen Reaktionen ist noch nicht geklärt werden, aber bisher scheint es, dass die grundlegenden Reaktionen bei den Tieren, die mehr ähnlich regenerieren kann, ist als gewesen imagi hättened nur vor einem Jahrzehnt 3. Die Nesseltiere sind vor allem leicht auf fast alle ihre Körperteile unter einem breiten Spektrum von morphologischen Vielfalt zu regenerieren. Aus dem einsamen Süßwasserpolypen, Hydra zusammen mit den winzigen Meeres Polypen, die immense Korallenriffe, auf die komplexen Kolonial Siphonophoren, wie der portugiesischen Man-O-War bauen, Regeneration ist oft eine Art der Fortpflanzung, zusätzlich zu einem Mechanismus für Reparatur oder beschädigte oder verlorene Körperteile Reformierung von Verletzungen und predation führt. Ob die verschiedenen Arten von Cnidaria verwenden ähnliche oder andere Mechanismen für die Regeneration ist eine grundsätzlich interessante Frage 4-6. Wir und andere haben die anthozoan entwickelt, vectensis Nematostella als Modell für die Regeneration 17.07. Wir entwickelten kürzlich ein Staging-System zur Beschreibung Regeneration eines gesamten Körpers von einem morphologisch einheitlichen Stück Gewebe aus dem Abora halbiertenl Ende der Polyp 10. Während Nematostella Polypen regenerieren kann , wenn auf jeder Ebene halbierten, haben wir uns für Erwachsene in einer aboral Position in der die meisten morphologisch einfachen Region, die Physa, teilweise zu schneiden , da dies zu der normalen Ebene der natürlichen asexuelle Spaltung 18 in der Nähe ist, und weil es auch erlaubt die Beobachtung und molekulare Analysen, wie ein ganzer Körper von den einfachsten morphologischen Komponenten wieder zusammengebaut. Die Nematostella Regeneration Staging System (NRSS) bietet eine relativ einfache Reihe von morphologischen Benchmarks , die verwendet werden könnten , um den Fortschritt von jedem Aspekt der Regeneration von einem amputierten Physa unter normalen Kulturbedingungen zu punkten oder gestört experimentell Situationen wie kleine Molekül - Behandlungen, genetische Manipulation oder Umwelt Veränderung. Wie erwartet, wird immer die NRSS als morphologische Gerüst angenommen, auf dem die zellulären und molekularen Vorgänge der Regeneration verwiesen werden kann10. Endlich ist unser Verfahren des Schneidens erzeugt ein klaffendes Loch mehrere Größenordnungen größer ist als die Einstichstift Punkt in einer aktuellen Studie verwendeten 17, doch sind beide Wunden heilen in etwa 6 Stunden. Dokumentieren der visuell Arretieren und verschiedene Phasen des Wundverschlusses sollten experimentelle Ansätze schlagen die scheinbare Unabhängigkeit der Größe einer Wunde und der Zeit, um es zu schließen nimmt zu erklären. So kann ein tieferes visuelles Verständnis des aboral Amputation Prozess, durch dieses Protokoll zur Verfügung gestellt wird, unterstützen weitere Untersuchungen in diesem Regenerationssystem Modell und erweitern die Anwendung dieses Staging - System Nematostella vectensis verwenden.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Nematostella vectensis,&lt;/em&gt; adults</td><td>Marine Biological Lab (MBL)</td><td></td><td>non-profit supplier</td></tr><tr><td>Glass Culture Dish, 250 mL</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>741004</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>Glass Culture Dish, 1,500 mL</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>741006</td><td>1,500 mL</td></tr><tr><td>Polyethylene transfer pipette, 5&amp;nbsp;mL</td><td>USA Scientific&amp;nbsp;</td><td>1022-2500</td><td>narrow bore, graduated</td></tr><tr><td>Polyethylene transfer pipet, tapered</td><td>Samco</td><td>202-205</td><td>cut off 1 inch of tip to make wide bore</td></tr><tr><td>Disposable Scalpel</td><td>Feather Safety Razor Co. Ltd</td><td>no. 10</td><td>blade should be curved</td></tr><tr><td>#5 Dumont Fine point tweezers</td><td>Roboz</td><td>RS5045</td><td>alternative suppliers available</td></tr><tr><td>Pyrex Petri dish, 100 mm diameter</td><td>Corning</td><td>3160</td><td>can substitute other glass Petri plates</td></tr><tr><td>Sterile 6-well plate</td><td>Corning Falcon&amp;nbsp;</td><td>353046</td><td>or similar from other manufacturer</td></tr><tr><td>Sterile 12-well plate</td><td>Nunc&amp;nbsp;</td><td>150628</td><td>or similar from other manufacturer</td></tr><tr><td>Sterile 24-well plate</td><td>Cellstar, Greiner bio-one</td><td>662-160</td><td>or similar from other manufacturer</td></tr><tr><td>Brine shrimp hathery kit</td><td>San Francisco Bay; drsfostersmith.com</td><td>CD-154005</td><td>option for growing brine shrimp</td></tr><tr><td>pyrex baking dish</td><td>common in grocery stores</td><td></td><td>option for growing brine shrimp</td></tr><tr><td>artificial seawater mix 50 gal or more&amp;nbsp;</td><td>Instant Ocean; drsfoster-smith.com</td><td>CD-116528</td><td>others brands may suffice</td></tr><tr><td>Plastic tub for stock ASW preparation</td><td>various</td><td></td><td>common 25 gallon plastic trash can OK</td></tr><tr><td>Polypropylene Carboy</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>716391</td><td>For working stock of ASW @ 12 ppt</td></tr><tr><td>Beaker, Graduated, 4,000 mL</td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>B199</td><td>For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt</td></tr><tr><td>Stereomicroscope and light source</td><td>various&amp;nbsp;</td><td></td><td>with continuous 1 - 40X magnification</td></tr></tbody></table>

inducing complete polyp regeneration from the aboral physa of the starlet sea anemone nematostella vectensis

Die Nesseltiere und insbesondere Hydra, waren die ersten Tiere gezeigt beschädigt oder durchtrennt Strukturen zu regenerieren, und zwar solche Studien wohl moderne biologische Untersuchung durch die Arbeit von Trembley vor mehr als 250 Jahren. Sowohl mit &quot;klassischen&quot; regenerative Organismen, wie die Hydra, planaria und Urodelen sowie eine Verbreiterung Artenspektrum die den Bereich von Metazoen aus Schwämmen durch Säugetiere Derzeit Studium der Regeneration hat ein Wiederaufleben gesehen. Neben dem Eigeninteresse als ein biologisches Phänomen, das Verständnis, wie die Regeneration in einer Vielzahl von Arten Werke werden uns darüber informieren, ob regenerative Prozesse teilen gemeinsame Merkmale und / oder Arten oder kontextspezifischen zellulären und molekularen Mechanismen. Das Starlet Seeanemone, Nematostella vectensis, ist ein aufstrebender Modellorganismus für die Regeneration. Wie Hydra ist Nematostella ein Mitglied der alten Stamm, Nesseltiere, aber innerhalb von ter Klasse anthozoa, eine Schwester Clade zum hydrozoa, die evolutionär basaleren ist. So Aspekte der Regeneration in Nematostella wird interessant sein , mit denen der Hydra und anderen Nesseltieren zu vergleichen und gegenüberzustellen . In diesem Artikel stellen wir eine Methode zu halbieren, zu beobachten und die Regeneration des aboral Ende des Nematostella Erwachsenen zu klassifizieren, die die Physa genannt wird. Die Physa erfährt natürlich Spaltung als Mittel zur ungeschlechtlichen Fortpflanzung, und entweder natürliche Spaltung oder manuelle Amputation des Physa löst erneute Wachstum und Rückbildung von komplexen Morphologien. Hier haben wir diese einfachen morphologischen Veränderungen in einem Nematostella Regeneration Staging - System (die NRSS) kodifiziert. Wir verwenden die NRSS die Wirkung von Chloroquin zu testen, einen Inhibitor der lysosomalen Funktion blockiert Autophagie. Die Ergebnisse zeigen, dass die Regeneration von Polyp Strukturen, insbesondere der Mesenterien, abnormal ist, wenn autophagy gehemmt wird.

Der Verlauf der morphologischen Ereignisse während der Regeneration in abgeschlagene Physa ist in 1A gezeigt , die an jedem NRSS Stufe repräsentative Ansichten von Physa umfasst. Der typische Physa Schnitt Seite ist auf den Erwachsenen (Pfeilspitzen) angegeben. Die Fotografien in 1A zeigen progressive Regeneration von Mund- und Körperstrukturen von frisch geschnittenem Physa durch voll ausgebildete Polyp. 1B, C , die die Anordnung der...

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Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Induzierende komplette Polyp Regeneration von aboraler Physa des Starlet Sea Anemone<em&gt; Nematostella vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

inducing-complete-polyp-regeneration-from-aboral-physa-starlet-sea

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

8.5K Aufrufe.  Stony Brook University. Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Serie: Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to any type of injury. Common injury models in these animals remove large amounts of tissue, which damages multiple organs. To overcome this broad tissue damage, we describe here a method to selectively remove a single organ, the pharynx, in the planarian Schmidtea mediterranea. We achieve this by soaking animals in a solution containing the cytochrome oxidase inhibitor sodium azide. Brief exposure to sodium azide causes extrusion of the pharynx from the animal, which we call &#34;chemical amputation.&#34;&#160;Chemical amputation removes the entire pharynx, and generates a small wound where the pharynx attaches to the intestine. After extensive rinsing, all amputated animals regenerate a fully functional pharynx in approximately one week. Stem cells in the rest of the body drive regeneration of the new pharynx. Here, we provide a detailed protocol for chemical amputation, and describe both histological and behavioral methods to assess successful amputation and regeneration.

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

The planarian Schmidtea mediterranea is an excellent model for studying stem cells and tissue regeneration. This publication describes a method to selectively remove one organ, the pharynx, by exposing animals to the chemical sodium azide. This protocol also outlines methods for monitoring pharynx regeneration.

Chemischen Amputation und Regeneration des Rachens in die Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model organism to study wound healing and subsequent cell regeneration. The Stentor genome became available recently, along with modern molecular biology methods, such as RNAi. These tools make it possible to study single-cell regeneration at the molecular level. The first section of the protocol covers establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, along with general guidelines for maintaining Stentor cultures. Culturing Stentor in large quantities allows for the use of valuable tools like biochemistry, sequencing, and mass spectrometry. Subsequent sections of the protocol cover different approaches to inducing regeneration in Stentor. Manually cutting cells with a glass needle allows studying the regeneration of large cell parts, while treating cells with either sucrose or urea allows studying the regeneration of specific structures located at the anterior end of the cell. A method for imaging individual regenerating cells is provided, along with a rubric for staging and analyzing the dynamics of regeneration. The entire process of regeneration is divided in three stages. By visualizing the dynamics of the progression of a population of cells through the stages, the heterogeneity in regeneration timing is demonstrated.

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

The giant ciliate, Stentor coeruleus, is an excellent system to study regeneration and wound healing. We present procedures for establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, inducing regeneration by cutting cells, chemically inducing the regeneration of membranellar band and oral apparatus, imaging, and analysis of cell regeneration.

Methoden für die Untersuchung der Regeneration im Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Genotyping of Sea Anemone during Early Development

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the life of the animal. Following in vitro fertilization and de-jellying, zygotes are allowed to develop for 24 h at room temperature to reach the early- to mid-gastrula stage. The gastrula embryos are then placed on an agarose gel bed in a Petri dish containing seawater. Under the dissecting microscope, a tungsten needle is used to surgically separate an aboral tissue fragment from each embryo. Post-surgery embryos are then allowed to heal and continue development. Genomic DNA is extracted from the isolated tissue fragment and used as a template for locus-specific PCR. The genotype can be determined based on the size of PCR products or presence/absence of allele-specific PCR products. Post-surgery embryos are then sorted according to the genotype. The duration of the entire genotyping process depends on the number of embryos to be screened, but it minimally requires 4&#8211;5 h. This method can be used to identify knockout mutants from a genetically heterogeneous population of embryos and enables analyses of phenotypes during development.

The goal of this protocol is to genotype the sea anemone Nematostella vectensis during gastrulation without sacrificing the embryo.

Genotypisierung von Sea Anemone während der frühen Entwicklung

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the ...

Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential for designing new molecular tools. Sea anemone venom locates in glandular cells from ectoderm and sub-cellular structures called nematocysts, both of which are distributed throughout the sea anemone body. This characteristic implies challenges because the cells and nematocyst must be lysed to release the venom components with other non-toxic molecules. Therefore, first, the venom is derived from a crude extract (mixture of different and diverse molecules and tissue debris). The next step is to detect polypeptides with specific bioactivities. Here, we describe an efficient strategy to obtain the sea anemone crude extract and bioassay to identify the presence of cytolysins. The first step involves inexpensive and straightforward techniques (stirred and freeze-thaw cycle) to release cytolysins. We obtained the highest cytolytic activity and protein (~500 mg of protein from 20 g of dry weight). Next, the polypeptide complexity of the extract was analyzed by SDS-PAGE gel detecting proteins with molecular weights between 10 kDa and 250 kDa. In the hemolytic assay, we used sheep red blood cells and determined HU50 (11.1 &plusmn; 0.3 &#181;g/mL). In contrast, the presence of phospholipases in the crude extract was determined using egg yolk as a substrate in a solid medium with agarose. Overall, this study uses an efficient and inexpensive protocol to prepare the crude extract and applies replicable bioassays to identify cytolysins, molecules with biotechnological and biomedical interests.

Here, we describe a protocol to obtain crude venom extract from sea anemone and detect its hemolytic and phospholipase activity.

Identifizierung der hämolytischen und Phospholipase-Aktivität in Rohextrakten aus Seeanemonen durch einfache Bioassays

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential ...

Biochemie

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

Pharmakologische und Functional genetischen Tests zu manipulieren Regeneration der Planarien Dugesia japonica</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Biologie

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

Erzeugung und Langzeitpflege von Nervenfreiheit<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

Neurowissenschaften

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Ein Test für Laterallinie Regeneration im erwachsenen Zebrafisch

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

Ein Verfahren zur Mikroinjektion von<em&gt; Patiria Minata</em&gt; Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Inducing Polyp Bail-out in Coral Colonies to Obtain Individualized Micropropagates for Laboratory Experimental Use

Corals are colonial animals formed by modular units called polyps. Coral polyps are physiologically linked and connected by tissue. The phenomenon of polyp bail-out is a process induced by acute stress, in which coral polyps digest the tissue connecting them to the rest of the colony and ultimately detach from the skeleton to continue living as separate individuals. Coral biologists have acknowledged the process of polyp bail-out for years, but only recently the micropropagates generated by this process have been recognized as a model system for coral biology studies. The use of polyp bail-out can create a high number of clonal units from a single coral fragment. Another benefit is that single polyps or patches of polyps can be easily visualized under a microscope and maintained in highly standardized low-cost environments such as Petri dishes, flasks, and microfluidic chips. The present protocol demonstrates reproducible methods capable of inducing coral micropropagation and different approaches for maintaining the single polyps alive in the long term. This methodology was capable of successfully cultivating polyps of the coral species Pocillopora verrucosa for up to 8 weeks after bail-out, exhibiting the practicality of using individual coral polyps for coral research.

Polyp bail-out is a process induced by acute stress, in which coral polyps digest the tissue connecting them to their colony and detach from it to live as individuals. The present protocol describes how to induce coral micropropagation by bail-out using hypersaline or calcium-free seawater treatments.

Induktion der Polypenrettung in Korallenkolonien, um individualisierte Mikropropagate für den experimentellen Laboreinsatz zu erhalten

Corals are colonial animals formed by modular units called polyps. Coral polyps are physiologically linked and connected by tissue. The phenomenon of ...

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

All animal organs, from the skin to eyes to intestines, are covered with sheets of epithelial cells that allow them to maintain homeostasis while protecting them from infection. Therefore, it is not surprising that the ability to repair epithelial wounds is critical to all metazoans. Epithelial wound healing in vertebrates involves overlapping processes, including inflammatory responses, vascularization, and re-epithelialization. Regulation of these processes involves complex interactions between epithelial cells, neighboring cells, and the extracellular matrix (ECM); the ECM contains structural proteins, regulatory proteins, and active small molecules. This complexity, together with the fact that most animals have opaque tissues and inaccessible ECMs, makes wound healing difficult to study in live animals. Much work on epithelial wound healing is therefore performed in tissue culture systems, with a single epithelial cell-type plated as a monolayer on an artificial matrix. Clytia hemisphaerica (Clytia) provides a unique and exciting complement to these studies, allowing epithelial wound healing to be studied in an intact animal with an authentic ECM. The ectodermal epithelium of Clytia is a single layer of large squamous epithelial cells, allowing high-resolution imaging using differential interfering contrast (DIC) microscopy in living animals. The absence of migratory fibroblasts, vasculature, or inflammatory responses makes it possible to dissect the critical events in re-epithelialization in vivo. The healing of various types of wounds can be analyzed, including single-cell microwounds, small and large epithelial wounds, and wounds that damage the basement membrane. Lamellipodia formation, purse string contraction, cell stretching, and collective cell migration can all be observed in this system. Furthermore, pharmacological agents can be introduced via the ECM to modify cell:ECM interactions and cellular processes in vivo. This work shows methods for creating wounds in live Clytia, capturing movies of healing, and probing healing mechanisms by microinjecting reagents into the ECM.

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

This paper describes a method to create wounds in the epithelium of a live Clytia hemisphaerica medusa and image wound healing at a high resolution in vivo. Additionally, a technique to introduce dyes and drugs to perturb signaling processes in the epithelial cells and extracellular matrix during wound healing is presented.

Induzierende komplette Polyp Regeneration von aboraler Physa des Starlet Sea Anemone

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Chemischen Amputation und Regeneration des Rachens in die Planarian Schmidtea mediterranea

Methoden für die Untersuchung der Regeneration im Stentor

Genotypisierung von Sea Anemone während der frühen Entwicklung

Identifizierung der hämolytischen und Phospholipase-Aktivität in Rohextrakten aus Seeanemonen durch einfache Bioassays

Pharmakologische und Functional genetischen Tests zu manipulieren Regeneration der Planarien Dugesia japonica

Erzeugung und Langzeitpflege von Nervenfreiheit

Ein Test für Laterallinie Regeneration im erwachsenen Zebrafisch

Ein Verfahren zur Mikroinjektion von

Induktion der Polypenrettung in Korallenkolonien, um individualisierte Mikropropagate für den experimentellen Laboreinsatz zu erhalten

Charakterisierung der epithelialen Wundheilung in vivo am Nesseltier-Modellorganismus Clytia hemisphaerica