Questo lavoro è stato supportato da una Stem Cell Science di New York (NYSTEM C028107) Concessione di GHT.

1. preparare gli animali per la temperatura, la nutrizione e la luce / buio ciclo <ol><li> Ottenere Nematostella vectensis adulti da uno dei numerosi laboratori Nematostella in tutto il mondo, o un fornitore senza scopo di lucro (Tabella 1) </li><li> Mantenere Nematostella a temperatura costante (tipicamente tra 18 e 21 ° C) al buio, in &quot;1 / 3x&quot; artificiale del mare (ASW) ad una salinità di 12 parti per mille (ppt). Mantenere le culture in semplici soda-calce piatti di coltura in vetro, in genere da 250 ml o da 1,5 L di capacità 11. Nota: Queste semplici condizioni di coltura sono comunemente utilizzati tra i laboratori che studiano Nematostella, ma la cura della cultura possono anche essere automatizzati 19. </li><li> Alimentare Nematostella Artemia appena schiusi naupli 2 - 4 volte a settimana. Hatch Artemia cisti a piena forza (36 ppt) o 1 / 3x ASW a 30 ° C, in un poco profondo piatto di vetro rettangolare 20 o inqualsiasi di un certo numero di piccola scala, gli incubatoi di salamoia gamberetti commerciale o fatti in casa. Se un incubatore non è disponibile, il gambero si schiudono a temperatura ambiente, ma lo fanno più lentamente. Nota: Questo richiede spesso più di 24 ore per il completamento. </li><li> Sostituire l&#39;acqua cultura anemone, almeno una volta alla settimana. Per una migliore salute degli adulti, pulire accuratamente (senza sapone) la cultura bocce una volta alla settimana di secrezioni mucose accumulati, che rivestire la ciotola e possono intrappolare resti di cibo e rifiuti, e impigliare gli animali. </li></ol> 2. Selezione e rilassamento degli animali Nutrizionalmente condizionata <ol><li> Selezionare i polipi di dimensioni corrispondenza di circa la stessa lunghezza (3 - 5 cm, quando naturalmente rilassato) e metterli in una ciotola separata dalla colonia per tre giorni prima di amputazione. Nota: Il numero di animali selezionati per il taglio sarà determinata dall&#39;esperimento condotto, naturalmente, ma in generale si consiglia almeno cinque animali per punto di campionamento con sei repliche. Così,in un tipico esperimento un minimo di 30 animali sarebbe preselezionato. In generale, è consigliabile selezionare più di un numero minimo (30) dal amputazioni che sono irregolari (vedi sotto) in seguito possono influenzare punteggio. </li><li> Rimuovere il piatto di animali selezionati dal termostato in luce ambiente almeno un&#39;ora prima amputazione. Nota: L&#39;esposizione alla luce artificiale e vibrazioni di movimentazione probabilmente causerà gli animali a contrarsi, così hanno bisogno di essere adattati o &quot;rilassato&quot; di incubazione sul banco di laboratorio. Animali diventeranno refrattari al tatto e l&#39;esposizione alla luce e, a quel punto può essere spostato delicatamente pipettando. </li><li> Opzionale: Anestetizzare gli animali con l&#39;aggiunta di 7,5% MgCl 2 (in 1 / 3x ASW). Delicatamente aggiungere la soluzione MgCl 2 alla ciotola con uno standard di plastica 5 ml pipetta. Nota: Anche se gli animali finirà per diventare abituati alla luce e alla manipolazione fisica, può essere vantaggioso per anestetizzare gli animali per mantenere o &quot;fissare&quot; tsi rilassò stato dopo la loro entrata 16,21,22 allungata. </li><li> Utilizzare un ampio foro (&gt; 0.5 cm) pipetta di plastica per il trasferimento (in 1 / 3x ASW) cinque animali dalla piscina essere amputata, sul fondo di un piatto sterile taglio del vetro del diametro di 100 mm contenente 12 ppt ASW. Porre la capsula sul palcoscenico di uno stereomicroscopio con ingrandimento variabile tra i 10 - 40X. Nota: Se gli animali non sono stati anestetizzati e rilassato per il taglio, essi possono ancora rispondere al tatto e l&#39;illuminazione stereoscopio, e quindi potrebbe essere necessario qualche minuto per diventare di nuovo rilassato. </li></ol> 3. Amputazione <ol><li> Usando un bisturi sterile, amputazione l&#39;Physa aboral da ciascun polipo, con l&#39;obiettivo di ottenere una sezione del Physa che è circa fintanto che è ampia e non contenente mesentere. Nota: Il sito taglio ideale è solo aboral alla cessazione del mesentere. Al piano di taglio c&#39;è una transizione da mesentere propria sottile lines corrispondente ad ogni inserzione mesenterial (vedere Figura 1, frecce). L&#39;assenza di mesentere è fondamentale perché produce muco che possono facilitare &#39;collegare&#39; il buco 17,30. <ol><li> Posizionare il bisturi in contatto con l&#39;animale al sito desiderato di amputazione. Fate questo sia autonomamente (a mano libera), oppure afferrando delicatamente il corpo dell&#39;animale con un # 5 pinze (stile Dumont o simili). </li><li> Tagliare il tessuto sfruttando la lama curva del bisturi in un movimento &#39;dondolo&#39; in tutto il corpo. Nota: Il tessuto deve recidere pulito come il bisturi viene scosso e liberare la sezione desiderata Physa dal donatore. Tuttavia, se un piccolo pezzo di tessuto collega ancora il corpo e la Physa, tagliare con il bisturi. Non tentare di separare i pezzi collegati tirando, in quanto ciò potrebbe danneggiare il Physa. </li></ol></li><li> Rimuovere ogni &#39;donatore&#39; polipo amputato dal piatto e restituirlo ad un sepaciotola tasso etichettato &#39;amputati messe in comune; data la ciotola e restituirlo al magazzino della cultura. Nota: polipi amputate guarirà la ferita aboral entro un giorno e quindi può essere alimentato normalmente. Saranno rigenerare un normale Physa cercando entro due settimane a questo punto il Physa può essere amputata di nuovo se lo si desidera. </li><li> Risciacquare il Physa asportato che rimangono nel piatto di taglio 12 ppt ASW, quindi trasferire ciascuna Physa ad un pozzo sterile separata in una piastra di coltura cellulare multi-pozzo che ha già 10 mL di 12 ppt ASW in ciascun pozzetto. Nota: Questo esempio utilizza una piastra ben sei, con ogni ben di detenzione di 10 ml di acqua di mare e cinque Physa asportato. In acqua marina generale dovrebbe coprire il Physa in misura sufficiente a evitare l&#39;esposizione all&#39;aria a causa di movimenti durante la movimentazione e il potenziale di evaporazione. La piastra o pozzetti devono avere un coperchio. </li><li> Ripetere i passaggi 3,1-3,3 per raccogliere almeno 5 Physa in ogni pozzetto riservato per ogni trattamento sperimentale. </li><li> Incubare la Physa ad una temperatura che si provide il miglior tasso di rigenerazione per gli interrogatori sperimentali previste. Posizionare la piastra contenente la Physa in un incubatore temperatura regolata, ad una temperatura fissa determinata dal tasso desiderato di rigenerazione. Nota: Il Physa sarà rigenerare i tessuti mancanti e formare un polipo pieno quando incubate a temperature comprese tra 15 e 27 ° C. Il tasso di rigenerazione dipende dalla temperatura eccezione per le prime due fasi. Il giorno medio per raggiungere la fase 4 per tutte le temperature è 7 d dopo il taglio e questo coincide anche con rigenerazione a 21 ° C. A 27 ° C, la fase 4 è raggiunto circa 3 giorni prima e a 15 ° C, la fase 4 è in ritardo di circa 3 d rispetto alla rigenerazione a 21 ° C (vedi anche Riferimento 10). </li></ol> 4. Valutare rigenerazione con la Staging System Nematostella Regeneration (NRSS) <ol><li> Punteggio ottenuto il Physa utilizzando un microscopio stereo composto con magnifica variabilezione (10 - 80X). Punteggio ottenuto il Physa Nematostella appena tagliata come Stadio 0 e continuare segnando allo stesso tempo ogni amputazione dopo giorno (dpa) utilizzando il NRSS 10. Nota: Per i criteri di stadiazione chiave e informazioni si riferiscono riferimento 10. <ol><li> Punteggio Physa come Stadio 0 (ferita aperta) se un Physa appena tagliata appare come una massa a forma di tazza- simile ad un palloncino flaccida, con un sito ferita aperta è probabile visibile. Nota: I bordi della ferita potrebbe anche stare insieme fin dall&#39;inizio, ma il tessuto sarà ancora crollato e la mancanza di rigidità. I bordi della ferita aperta possono essere osservati in fase di contrazione radiale come la ferita guarisce. </li><li> Punteggio Physa come fase 1 (Wound chiuso) se la ferita amputazione appare chiusa. Nota: posizione della ferita sarà conforme a futuro polo orale. La superficie esterna intorno al futuro polo orale può iniziare a visualizzare archi distinti corrispondenti ai sottostanti radialmente simmetrica endodermico inserimenti mesenterial. </li><li> punteggio physa come Fase 2 (radiali Archi) se la superficie del polo orale appare gonfiato, rivelando otto archi sollevate disposti in uno schema radialmente simmetrica e separate da scanalature. Osservare piccoli, blebs emisferiche all&#39;apice delle arcate. Saranno circa alto come ampia, probabilmente transitoria, e inizialmente composta da un singolo strato di cellule ectodermica. Nota: In alcuni casi, vesciche a doppio strato possono stabilizzarsi. Nota: A questo o poi mette in scena uno strato mucoso può apparire per incapsulare il Physa (figura 2) in una &#39;guaina&#39; membranosa. Questo materiale inglobante dovrebbe essere rimosso per facilitare competenza. </li><li> Punteggio Physa come Fase 3 (Tentacle) se le gemme dei tentacoli contenenti endodermico e ectodermiche strati di tessuto sono stabilmente formate alla fine orale di almeno alcuni archi radiali. Nota: I tentacoli sono più lunghi che larghi e sono minimamente mobili. Il Physa manifestano una maggiore, ma l&#39;inflazione variabile in modo che rudimenti mesentere può diventare visbile estende dall&#39;inserzione mesenterial nella cavità del corpo (coelenteron). </li><li> Punteggio Physa come Fase 4 (Mesenteri lineari) se il Physa contiene otto distinti, mesenteri visibili che si estendono nel coelenteron dal inserimenti nella parete del corpo, con lunghezze orali-aboral che sono più di due volte la loro larghezza radiale misurata dal punto in cui compaiono per la connessione alla faringe alla sua estremità aboral (enterostome). Nota: quattro o meno mesenteri hanno &quot;pieghe&quot; bordi liberi interni. La faringe è visibile. Più di otto tentacoli sono visibili, mobili e talvolta si contraggono nel corpo. </li><li> Punteggio Physa come Fase 5 (prevalentemente Pieghe Mesenteri) se il Physa ha più di quattro mesenteri con pieghe, e la pieghettatura è più piena e sinuosa che in fase 4. L&#39;animale ha un quasi &quot;normale&quot; aspetto adulto, ma non ci sono visibili cellule gonadica. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lenhoff, S. G., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hydra and the Birth of Experimental Biology: Abraham Trembley's Memoirs Concerning the Natural History of a Type of Freshwater Polyp with Arms Shaped like Horns. , (1986).</li><li>Trembley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M&#233;moires pour servir &#224; l'histoire d'un genre de polypes d'eau douce, &#224; bras en forme de cornes. , (1744).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals.">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).</li><li>Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydra,+a+fruitful+model+system+for+270+years.">Hydra, a fruitful model system for 270 years.</a> Int J Dev Biol. 56 (6-8), 411-423 (2012).</li><li>Gold, D. A., Jacobs, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+dynamics+in+Cnidaria:+are+there+unifying+principles?.">Stem cell dynamics in Cnidaria: are there unifying principles?.</a> Dev Genes Evol. 233 (1-2), 53-66 (2013).</li><li>Holstein, T. W., Hobmayer, E., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cnidarians:+an+evolutionarily+conserved+model+system+for+regeneration?.">Cnidarians: an evolutionarily conserved model system for regeneration?.</a> Dev Dyn. 226 (2), 257-267 (2003).</li><li>Amiel, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Morphological+and+Cellular+Events+Underlying+Oral+Regeneration+in+the+Sea+Anemone,+Nematostella+vectensis.">Characterization of Morphological and Cellular Events Underlying Oral Regeneration in the Sea Anemone, Nematostella vectensis.</a> Int J Mol Sci. 16 (12), 28449-28471 (2015).</li><li>Warren, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+perlecan/HSPG2+gene+and+its+activation+in+regenerating+Nematostella+vectensis.">Evolution of the perlecan/HSPG2 gene and its activation in regenerating Nematostella vectensis.</a> PLoS One. 10 (4), e0124578 (2015).</li><li>Gong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+of+the+starlet+sea+anemone+Nematostella+vectensis.">Integrins of the starlet sea anemone Nematostella vectensis.</a> Biol Bull. 227 (3), 211-220 (2014).</li><li>Bossert, P. E., Dunn, M. P., Thomsen, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+staging+system+for+the+regeneration+of+a+polyp+from+the+aboral+physa+of+the+anthozoan+Cnidarian+Nematostella+vectensis.">A staging system for the regeneration of a polyp from the aboral physa of the anthozoan Cnidarian Nematostella vectensis.</a> Dev Dyn. 242 (11), 1320-1331 (2013).</li><li>Stefanik, D. J., Friedman, L. E., Finnerty, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collecting,+rearing,+spawning+and+inducing+regeneration+of+the+starlet+sea+anemone,+Nematostella+vectensis.">Collecting, rearing, spawning and inducing regeneration of the starlet sea anemone, Nematostella vectensis.</a> Nat Protoc. 8 (5), 916-923 (2013).</li><li>Tucker, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thrombospondin+in+the+anthozoan+Nematostella+vectensis+is+associated+with+the+nervous+system+and+upregulated+during+regeneration.">A thrombospondin in the anthozoan Nematostella vectensis is associated with the nervous system and upregulated during regeneration.</a> Biol Open. 2 (2), 217-226 (2013).</li><li>Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+is+necessary+for+the+regeneration+of+oral+structures+in+the+anthozoan+cnidarian+Nematostella+vectensis.">Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis.</a> BMC Dev Biol. 12, (2012).</li><li>Trevino, M., Stefanik, D. J., Rodriguez, R., Harmon, S., Burton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+canonical+Wnt+signaling+by+alsterpaullone+is+sufficient+for+oral+tissue+fate+during+regeneration+and+embryogenesis+in+Nematostella+vectensis.">Induction of canonical Wnt signaling by alsterpaullone is sufficient for oral tissue fate during regeneration and embryogenesis in Nematostella vectensis.</a> Dev Dyn. 240 (12), 2673-2679 (2011).</li><li>Renfer, E., Amon-Hassenzahl, A., Steinmetz, P. R., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+muscle-specific+transgenic+reporter+line+of+the+sea+anemone,+Nematostella+vectensis.">A muscle-specific transgenic reporter line of the sea anemone, Nematostella vectensis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (1), 104-108 (2010).</li><li>Burton, P. M., Finnerty, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+novel+gene+expression+between+regeneration+and+asexual+fission+in+Nematostella+vectensis.">Conserved and novel gene expression between regeneration and asexual fission in Nematostella vectensis.</a> Dev Genes Evol. 219 (2), 79-87 (2009).</li><li>DuBuc, T. Q., Traylor-Knowles, N., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiating+a+regenerative+response;+cellular+and+molecular+features+of+wound+healing+in+the+cnidarian+Nematostella+vectensis.">Initiating a regenerative response; cellular and molecular features of wound healing in the cnidarian Nematostella vectensis.</a> BMC Biol. 12, (2014).</li><li>Hand, C., Uhlinger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asexual+reproduction+by+transverse+fission+and+some+anomalies+in+the+sea+anemone+Nematostella+vectensis.">Asexual reproduction by transverse fission and some anomalies in the sea anemone Nematostella vectensis.</a> Invert Biol. 114, 9-18 (1995).</li><li>Fritzenwanker, J. H., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+gametogenesis+in+the+basal+cnidarian+Nematostella+vectensis(Anthozoa).">Induction of gametogenesis in the basal cnidarian Nematostella vectensis(Anthozoa).</a> Dev Genes Evol. 212 (2), 99-103 (2002).</li><li>Magie, C., Bossert, P., Aramli, L., Thomsen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Science's+super+star:+The+starlet+sea+anemone+is+an+ideal+tool+for+student+inquiry.">Science's super star: The starlet sea anemone is an ideal tool for student inquiry.</a> The Science Teacher. 83 (3), 33-40 (2016).</li><li>Genikhovich, G., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+of+starlet+sea+anemone+(Nematostella+vectensis)+embryos,+larvae,+and+polyps.">In situ hybridization of starlet sea anemone (Nematostella vectensis) embryos, larvae, and polyps.</a> Cold Spring Harb Protoc. (9), (2009).</li><li>Magie, C. R., Pang, K., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+inventory+and+expression+of+Sox+and+Fox+genes+in+the+cnidarian+Nematostella+vectensis.">Genomic inventory and expression of Sox and Fox genes in the cnidarian Nematostella vectensis.</a> Dev Genes Evol. 215 (12), 618-630 (2005).</li><li>Chera, S., Kaloulis, K., Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cAMP+response+element+binding+protein+(CREB)+as+an+integrative+HUB+selector+in+metazoans:+clues+from+the+hydra+model+system.">The cAMP response element binding protein (CREB) as an integrative HUB selector in metazoans: clues from the hydra model system.</a> Biosystems. 87 (2-3), 191-203 (2007).</li><li>Reitzel, A. M., Burton, P. M., Krone, C., Finnerty, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+developmental+trajectories+in+the+starlet+sea+anemone+Nematostella+vectensis:+embryogenesis,+regeneration,+and+two+forms+of+asexual+fission.">Comparison of developmental trajectories in the starlet sea anemone Nematostella vectensis: embryogenesis, regeneration, and two forms of asexual fission.</a> Invertebr Biol. 126, 99-112 (2007).</li><li>Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALEN+and+CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+in+the+early-branching+metazoan+Nematostella+vectensis.">TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis.</a> Nat Commun. 5, 5486 (2014).</li><li>Jahnel, S. M., Walzl, M., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+epithelial+organisation+of+muscle+cells+in+the+sea+anemone+Nematostella+vectensis.">Development and epithelial organisation of muscle cells in the sea anemone Nematostella vectensis.</a> Front Zool. 11, 44 (2014).</li><li>Kelava, I., Rentzsch, F., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+eumetazoan+nervous+systems:+insights+from+cnidarians.">Evolution of eumetazoan nervous systems: insights from cnidarians.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370 (1684), (2015).</li><li>Nakanishi, N., Renfer, E., Technau, U., Rentzsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nervous+systems+of+the+sea+anemone+Nematostella+vectensis+are+generated+by+ectoderm+and+endoderm+and+shaped+by+distinct+mechanisms.">Nervous systems of the sea anemone Nematostella vectensis are generated by ectoderm and endoderm and shaped by distinct mechanisms.</a> Development. 139 (2), 347-357 (2012).</li><li>Richards, G. S., Rentzsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+analysis+of+a+SoxB+gene+reveals+neural+progenitor+cells+in+the+cnidarian+Nematostella+vectensis.">Transgenic analysis of a SoxB gene reveals neural progenitor cells in the cnidarian Nematostella vectensis.</a> Development. 141 (24), 4681-4689 (2014).</li><li>DuBuc, T. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+Nematostella+vectensis+embryogenesis+and+late+development+using+fluorescent+probes.">In vivo imaging of Nematostella vectensis embryogenesis and late development using fluorescent probes.</a> BMC Cell Biol. 15, (2014).</li><li>Kaur, J., Debnath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+at+the+crossroads+of+catabolism+and+anabolism.">Autophagy at the crossroads of catabolism and anabolism.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (8), 461-472 (2015).</li><li>Carroll, B., Korolchuk, V. I., Sarkar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+and+autophagy:+cross-talk+and+co-operation+to+control+cellular+homeostasis.">Amino acids and autophagy: cross-talk and co-operation to control cellular homeostasis.</a> Amino Acids. 47 (10), 2065-2088 (2015).</li><li>Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+cellular+and+molecular+mechanisms.">Autophagy: cellular and molecular mechanisms.</a> J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).</li><li>Rodolfo, C., Di Bartolomeo, S., Cecconi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+stem+and+progenitor+cells.">Autophagy in stem and progenitor cells.</a> Cell Mol Life Sci. 73 (3), 475-496 (2016).</li><li>Guan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+stem+cells.">Autophagy in stem cells.</a> Autophagy. 9 (6), 830-849 (2013).</li><li>Phadwal, K., Watson, A. S., Simon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tightrope+act:+autophagy+in+stem+cell+renewal,+differentiation,+proliferation,+and+aging.">Tightrope act: autophagy in stem cell renewal, differentiation, proliferation, and aging.</a> Cell Mol Life Sci. 70 (1), 89-103 (2013).</li><li>Varga, M., Fodor, E., Vellai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+zebrafish.">Autophagy in zebrafish.</a> Methods. 75, 172-180 (2015).</li><li>Varga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+required+for+zebrafish+caudal+fin+regeneration.">Autophagy is required for zebrafish caudal fin regeneration.</a> Cell Death Differ. 21 (4), 547-556 (2014).</li><li>Gonzalez-Estevez, C., Salo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+apoptosis+in+planarians.">Autophagy and apoptosis in planarians.</a> Apoptosis. 15 (3), 279-292 (2010).</li><li>Buzgariu, W., Chera, S., Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+investigate+autophagy+during+starvation+and+regeneration+in+hydra.">Methods to investigate autophagy during starvation and regeneration in hydra.</a> Methods Enzymol. 451, 409-437 (2008).</li><li>Tettamanti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+invertebrates:+insights+into+development,+regeneration+and+body+remodeling.">Autophagy in invertebrates: insights into development, regeneration and body remodeling.</a> Curr Pharm Des. 14 (2), 116-125 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

L&#39;utilizzo di Nematostella come modello di guarigione delle ferite e la rigenerazione sta diventando sempre più popolare. Pertanto, è importante essere in grado di visualizzare i modelli morfologici di un particolare protocollo prima analisi cellulari e molecolari efficaci possono essere assegnati e confrontati. Nematostella hanno un alto grado di rigenerazione &quot;flessibilità&quot;, potendo riformare quasi ogni struttura mancante amputati in qualsiasi luogo, nelle fasi post-planula di vita. ...

L&#39;osservazione della rigenerazione in un unico idra è stato l&#39;evento seminale l&#39;avvento della biologia come scienza sperimentale 1,2. Rigenerazione rimane un fenomeno di straordinariamente ampio ricorso al biologo e laico allo stesso modo. Il potenziale di biologi dello sviluppo, medici, scienziati e ingegneri biomedici tessuti per comprendere e superare i limiti di rigenerazione umana rende biologia rigenerazione più di intrinsecamente interessante. Ora, con l&#39;uso di tecnologie emergenti come il sequenziamento del genoma e il guadagno e la perdita di strumenti di funzione, il campo è pronta a prendere in giro i meccanismi rigenerativi a parte e in ultima analisi, per capire come le varie specie in grado di rigenerare, mentre altri non possono. Il grado di comunanza di risposte molecolari, cellulari e morfologiche rimane da chiarire, ma finora sembra che le risposte di base tra gli animali che possono rigenerare è più simile di quanto sarebbe stato Imagined solo un decennio fa 3. Cnidari in particolare, sono facile a rigenerare quasi tutte le loro parti del corpo in mezzo a un ampio spettro di diversità morfologica. Dal solitari polipo acqua dolce, Hydra insieme con i minuscoli polipi marini che costruiscono enormi coralli, alle complesse sifonofore coloniale, come il portoghese Man-O-Guerra, la rigenerazione è spesso una modalità di riproduzione, in aggiunta a un meccanismo di la riparazione o la riforma parti del corpo danneggiate o perse derivanti da un infortunio e predazione. Se le diverse specie di Cnidaria utilizzano meccanismi simili o differenti per la rigenerazione è una domanda interessante fondamentalmente 4-6. Noi e altri abbiamo sviluppato il antozoo, Nematostella vectensis come modello per la rigenerazione 7-17. Abbiamo recentemente sviluppato un sistema di stadiazione per descrivere la rigenerazione di un intero corpo da un pezzo morfologicamente uniforme di tessuto tagliato in due dai Aboral fine del polipo 10. Mentre polipi Nematostella possono rigenerare quando attraversata a qualsiasi livello, abbiamo scelto di tagliare adulti in posizione aboral nella regione più morfologicamente semplice, il Physa, in parte perché questo è vicino al piano normale della naturale fissione asessuata 18, ed anche perché permessi osservazione e analisi molecolari di come un intero corpo viene ricomposto dai componenti morfologiche semplici. Il Staging System Nematostella Regeneration (NRSS) fornisce una relativamente semplice serie di parametri morfologici che potrebbero essere utilizzati per segnare il progresso di qualsiasi aspetto della rigenerazione da un Physa amputata, in condizioni di coltura normali o sperimentalmente perturbato situazioni come trattamenti di piccole molecole, manipolazione genetica o alterazione ambientale. Come anticipato, il NRSS sta diventando adottato da impalcatura morfologica su cui è possibile fare riferimento gli eventi cellulari e molecolari della rigenerazione10. Infine il nostro metodo di taglio produce un Gaping fori diversi ordini di grandezza superiore alla puntura fenomenale utilizzato in uno studio recente 17, ma entrambe le ferite guariscono in circa 6 ore. Documentare le fasi visivamente arrestando e distinti di chiusura della ferita dovrebbe suggerire approcci sperimentali per spiegare l&#39;apparente indipendenza della dimensione di una ferita e il tempo necessario per chiuderla. Così, una più profonda comprensione visiva del processo di amputazione aboral, fornita da questo protocollo, sarà di aiuto ulteriori indagini in questo sistema di rigenerazione del modello e ampliare l&#39;applicazione di questo sistema di stadiazione utilizzando Nematostella vectensis.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Nematostella vectensis,&lt;/em&gt; adults</td><td>Marine Biological Lab (MBL)</td><td></td><td>non-profit supplier</td></tr><tr><td>Glass Culture Dish, 250 mL</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>741004</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>Glass Culture Dish, 1,500 mL</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>741006</td><td>1,500 mL</td></tr><tr><td>Polyethylene transfer pipette, 5&amp;nbsp;mL</td><td>USA Scientific&amp;nbsp;</td><td>1022-2500</td><td>narrow bore, graduated</td></tr><tr><td>Polyethylene transfer pipet, tapered</td><td>Samco</td><td>202-205</td><td>cut off 1 inch of tip to make wide bore</td></tr><tr><td>Disposable Scalpel</td><td>Feather Safety Razor Co. Ltd</td><td>no. 10</td><td>blade should be curved</td></tr><tr><td>#5 Dumont Fine point tweezers</td><td>Roboz</td><td>RS5045</td><td>alternative suppliers available</td></tr><tr><td>Pyrex Petri dish, 100 mm diameter</td><td>Corning</td><td>3160</td><td>can substitute other glass Petri plates</td></tr><tr><td>Sterile 6-well plate</td><td>Corning Falcon&amp;nbsp;</td><td>353046</td><td>or similar from other manufacturer</td></tr><tr><td>Sterile 12-well plate</td><td>Nunc&amp;nbsp;</td><td>150628</td><td>or similar from other manufacturer</td></tr><tr><td>Sterile 24-well plate</td><td>Cellstar, Greiner bio-one</td><td>662-160</td><td>or similar from other manufacturer</td></tr><tr><td>Brine shrimp hathery kit</td><td>San Francisco Bay; drsfostersmith.com</td><td>CD-154005</td><td>option for growing brine shrimp</td></tr><tr><td>pyrex baking dish</td><td>common in grocery stores</td><td></td><td>option for growing brine shrimp</td></tr><tr><td>artificial seawater mix 50 gal or more&amp;nbsp;</td><td>Instant Ocean; drsfoster-smith.com</td><td>CD-116528</td><td>others brands may suffice</td></tr><tr><td>Plastic tub for stock ASW preparation</td><td>various</td><td></td><td>common 25 gallon plastic trash can OK</td></tr><tr><td>Polypropylene Carboy</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>716391</td><td>For working stock of ASW @ 12 ppt</td></tr><tr><td>Beaker, Graduated, 4,000 mL</td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>B199</td><td>For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt</td></tr><tr><td>Stereomicroscope and light source</td><td>various&amp;nbsp;</td><td></td><td>with continuous 1 - 40X magnification</td></tr></tbody></table>

inducing complete polyp regeneration from the aboral physa of the starlet sea anemone nematostella vectensis

Cnidari, e in particolare Hydra, sono stati i primi animali indicati per rigenerare le strutture danneggiate o mozzate, e in effetti questi studi probabilmente lanciati indagine biologica moderna attraverso il lavoro di Trembley più di 250 anni fa. Attualmente lo studio della rigenerazione ha visto una rinascita utilizzando entrambi i microrganismi rigenerativi &quot;classici&quot;, come l&#39;Hydra, planaria e urodeli, nonché uno spettro ampliamento di specie che misurano la gamma di metazoi, dalle spugne attraverso mammiferi. Oltre al suo interesse intrinseco come fenomeno biologico, la comprensione di come la rigenerazione lavora in una varietà di specie ci illustrerà se i processi rigenerativi condividono caratteristiche e / o specie comuni o meccanismi cellulari e molecolari specifici al contesto. L&#39;anemone di mare starlet, Nematostella vectensis, è un organismo modello emergente per la rigenerazione. Come Hydra, Nematostella è un membro delle antiche phylum, Cnidaria, ma all&#39;interno di tLa classe Anthozoa, un clade sorella al Hydrozoa che è evolutivamente più basale. Così gli aspetti della rigenerazione in Nematostella sarà interessante mettere a confronto con quelli di Hydra e altri cnidari. In questo articolo, vi presentiamo un metodo per bisect, di osservare e classificare la rigenerazione della fine aboral dell&#39;adulto Nematostella, che si chiama il Physa. Il Physa subisce naturalmente la fissione come mezzo di riproduzione asessuata, e sia la fissione naturali o amputazione manuale del Physa innesca ricrescita e la riforma delle morfologie complesse. Qui abbiamo codificato questi semplici cambiamenti morfologici in un sistema di gestione temporanea Nematostella rigenerazione (il NRSS). Usiamo il NRSS per testare gli effetti di clorochina, un inibitore della funzione lisosomiale che blocca l&#39;autofagia. I risultati mostrano che la rigenerazione delle strutture polipo, in particolare i mesenteri, è anormale quando autofagia è inibita.

La progressione degli eventi morfologici durante la rigenerazione in Physa tagliata è mostrato in figura 1A, che include viste rappresentativi di Physa in ciascuna fase NRSS. Il sito tipico Physa taglio è indicato l&#39;adulto (punte di freccia). Le fotografie di Figura 1A mostrano progressiva rigenerazione delle strutture orali e corpo da Physa appena tagliata attraverso polipo completamente formato. Figura 1B, C mostrano la disposizi...

Watch this Scientific Journal Video about Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis at JoVE.com

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Indurre completa Polyp Rigenerazione dal aboral Physa della Starlet Anemone di mare<em&gt; Vectensis Nematostella</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

inducing-complete-polyp-regeneration-from-aboral-physa-starlet-sea

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

8.5K Views.  Stony Brook University. Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Video: Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to any type of injury. Common injury models in these animals remove large amounts of tissue, which damages multiple organs. To overcome this broad tissue damage, we describe here a method to selectively remove a single organ, the pharynx, in the planarian Schmidtea mediterranea. We achieve this by soaking animals in a solution containing the cytochrome oxidase inhibitor sodium azide. Brief exposure to sodium azide causes extrusion of the pharynx from the animal, which we call &#34;chemical amputation.&#34;&#160;Chemical amputation removes the entire pharynx, and generates a small wound where the pharynx attaches to the intestine. After extensive rinsing, all amputated animals regenerate a fully functional pharynx in approximately one week. Stem cells in the rest of the body drive regeneration of the new pharynx. Here, we provide a detailed protocol for chemical amputation, and describe both histological and behavioral methods to assess successful amputation and regeneration.

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

The planarian Schmidtea mediterranea is an excellent model for studying stem cells and tissue regeneration. This publication describes a method to selectively remove one organ, the pharynx, by exposing animals to the chemical sodium azide. This protocol also outlines methods for monitoring pharynx regeneration.

Chimica l'amputazione e la rigenerazione della faringe nella Planaria planarie mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model organism to study wound healing and subsequent cell regeneration. The Stentor genome became available recently, along with modern molecular biology methods, such as RNAi. These tools make it possible to study single-cell regeneration at the molecular level. The first section of the protocol covers establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, along with general guidelines for maintaining Stentor cultures. Culturing Stentor in large quantities allows for the use of valuable tools like biochemistry, sequencing, and mass spectrometry. Subsequent sections of the protocol cover different approaches to inducing regeneration in Stentor. Manually cutting cells with a glass needle allows studying the regeneration of large cell parts, while treating cells with either sucrose or urea allows studying the regeneration of specific structures located at the anterior end of the cell. A method for imaging individual regenerating cells is provided, along with a rubric for staging and analyzing the dynamics of regeneration. The entire process of regeneration is divided in three stages. By visualizing the dynamics of the progression of a population of cells through the stages, the heterogeneity in regeneration timing is demonstrated.

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

The giant ciliate, Stentor coeruleus, is an excellent system to study regeneration and wound healing. We present procedures for establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, inducing regeneration by cutting cells, chemically inducing the regeneration of membranellar band and oral apparatus, imaging, and analysis of cell regeneration.

Metodi per lo studio della rigenerazione in Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Genotyping of Sea Anemone during Early Development

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the life of the animal. Following in vitro fertilization and de-jellying, zygotes are allowed to develop for 24 h at room temperature to reach the early- to mid-gastrula stage. The gastrula embryos are then placed on an agarose gel bed in a Petri dish containing seawater. Under the dissecting microscope, a tungsten needle is used to surgically separate an aboral tissue fragment from each embryo. Post-surgery embryos are then allowed to heal and continue development. Genomic DNA is extracted from the isolated tissue fragment and used as a template for locus-specific PCR. The genotype can be determined based on the size of PCR products or presence/absence of allele-specific PCR products. Post-surgery embryos are then sorted according to the genotype. The duration of the entire genotyping process depends on the number of embryos to be screened, but it minimally requires 4&#8211;5 h. This method can be used to identify knockout mutants from a genetically heterogeneous population of embryos and enables analyses of phenotypes during development.

The goal of this protocol is to genotype the sea anemone Nematostella vectensis during gastrulation without sacrificing the embryo.

Genotipizzazione dell'Anemone marino durante lo sviluppo precoce

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the ...

Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential for designing new molecular tools. Sea anemone venom locates in glandular cells from ectoderm and sub-cellular structures called nematocysts, both of which are distributed throughout the sea anemone body. This characteristic implies challenges because the cells and nematocyst must be lysed to release the venom components with other non-toxic molecules. Therefore, first, the venom is derived from a crude extract (mixture of different and diverse molecules and tissue debris). The next step is to detect polypeptides with specific bioactivities. Here, we describe an efficient strategy to obtain the sea anemone crude extract and bioassay to identify the presence of cytolysins. The first step involves inexpensive and straightforward techniques (stirred and freeze-thaw cycle) to release cytolysins. We obtained the highest cytolytic activity and protein (~500 mg of protein from 20 g of dry weight). Next, the polypeptide complexity of the extract was analyzed by SDS-PAGE gel detecting proteins with molecular weights between 10 kDa and 250 kDa. In the hemolytic assay, we used sheep red blood cells and determined HU50 (11.1 &plusmn; 0.3 &#181;g/mL). In contrast, the presence of phospholipases in the crude extract was determined using egg yolk as a substrate in a solid medium with agarose. Overall, this study uses an efficient and inexpensive protocol to prepare the crude extract and applies replicable bioassays to identify cytolysins, molecules with biotechnological and biomedical interests.

Here, we describe a protocol to obtain crude venom extract from sea anemone and detect its hemolytic and phospholipase activity.

Identificazione dell'attività emolitica e fosfolipasi in estratti grezzi di anemoni di mare mediante saggi biologici semplici

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential ...

Biochimica

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

I dosaggi farmacologici genetica e funzionale di manipolare Rigenerazione del Planaria Japonica Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Biologia

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

Generazione e manutenzione a lungo termine di nervi liberi<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

Neuroscienze

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Un test per Lateral Rigenerazione Line in Zebrafish adulti

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

Un metodo per la microiniezione di<em&gt; Patiria minata</em&gt; zigoti

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Inducing Polyp Bail-out in Coral Colonies to Obtain Individualized Micropropagates for Laboratory Experimental Use

Corals are colonial animals formed by modular units called polyps. Coral polyps are physiologically linked and connected by tissue. The phenomenon of polyp bail-out is a process induced by acute stress, in which coral polyps digest the tissue connecting them to the rest of the colony and ultimately detach from the skeleton to continue living as separate individuals. Coral biologists have acknowledged the process of polyp bail-out for years, but only recently the micropropagates generated by this process have been recognized as a model system for coral biology studies. The use of polyp bail-out can create a high number of clonal units from a single coral fragment. Another benefit is that single polyps or patches of polyps can be easily visualized under a microscope and maintained in highly standardized low-cost environments such as Petri dishes, flasks, and microfluidic chips. The present protocol demonstrates reproducible methods capable of inducing coral micropropagation and different approaches for maintaining the single polyps alive in the long term. This methodology was capable of successfully cultivating polyps of the coral species Pocillopora verrucosa for up to 8 weeks after bail-out, exhibiting the practicality of using individual coral polyps for coral research.

Polyp bail-out is a process induced by acute stress, in which coral polyps digest the tissue connecting them to their colony and detach from it to live as individuals. The present protocol describes how to induce coral micropropagation by bail-out using hypersaline or calcium-free seawater treatments.

Indurre il salvataggio di polipi nelle colonie di corallo per ottenere micropropagati individualizzati per uso sperimentale di laboratorio

Corals are colonial animals formed by modular units called polyps. Coral polyps are physiologically linked and connected by tissue. The phenomenon of ...

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

All animal organs, from the skin to eyes to intestines, are covered with sheets of epithelial cells that allow them to maintain homeostasis while protecting them from infection. Therefore, it is not surprising that the ability to repair epithelial wounds is critical to all metazoans. Epithelial wound healing in vertebrates involves overlapping processes, including inflammatory responses, vascularization, and re-epithelialization. Regulation of these processes involves complex interactions between epithelial cells, neighboring cells, and the extracellular matrix (ECM); the ECM contains structural proteins, regulatory proteins, and active small molecules. This complexity, together with the fact that most animals have opaque tissues and inaccessible ECMs, makes wound healing difficult to study in live animals. Much work on epithelial wound healing is therefore performed in tissue culture systems, with a single epithelial cell-type plated as a monolayer on an artificial matrix. Clytia hemisphaerica (Clytia) provides a unique and exciting complement to these studies, allowing epithelial wound healing to be studied in an intact animal with an authentic ECM. The ectodermal epithelium of Clytia is a single layer of large squamous epithelial cells, allowing high-resolution imaging using differential interfering contrast (DIC) microscopy in living animals. The absence of migratory fibroblasts, vasculature, or inflammatory responses makes it possible to dissect the critical events in re-epithelialization in vivo. The healing of various types of wounds can be analyzed, including single-cell microwounds, small and large epithelial wounds, and wounds that damage the basement membrane. Lamellipodia formation, purse string contraction, cell stretching, and collective cell migration can all be observed in this system. Furthermore, pharmacological agents can be introduced via the ECM to modify cell:ECM interactions and cellular processes in vivo. This work shows methods for creating wounds in live Clytia, capturing movies of healing, and probing healing mechanisms by microinjecting reagents into the ECM.

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

This paper describes a method to create wounds in the epithelium of a live Clytia hemisphaerica medusa and image wound healing at a high resolution in vivo. Additionally, a technique to introduce dyes and drugs to perturb signaling processes in the epithelial cells and extracellular matrix during wound healing is presented.

Indurre completa Polyp Rigenerazione dal aboral Physa della Starlet Anemone di mare

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Chimica l'amputazione e la rigenerazione della faringe nella Planaria planarie mediterranea

Metodi per lo studio della rigenerazione in Stentor

Genotipizzazione dell'Anemone marino durante lo sviluppo precoce

Identificazione dell'attività emolitica e fosfolipasi in estratti grezzi di anemoni di mare mediante saggi biologici semplici

I dosaggi farmacologici genetica e funzionale di manipolare Rigenerazione del Planaria Japonica Dugesia

Generazione e manutenzione a lungo termine di nervi liberi

Un test per Lateral Rigenerazione Line in Zebrafish adulti

Un metodo per la microiniezione di

Indurre il salvataggio di polipi nelle colonie di corallo per ottenere micropropagati individualizzati per uso sperimentale di laboratorio

Caratterizzazione della guarigione delle ferite epiteliali in vivo utilizzando l'organismo modello cnidariano Clytia hemisphaerica