이 작품은 NIH R01 GM113602 (WFM) 보조금과 NSF 1144247 (알)에 의해 지원 되었다. 우리 인정 마크 Slabodnick 나탈리 커 클 랜드 이러한 프로토콜 중 일부의 초기 버전을 개발 하 고 유익한 토론 합니다. 우리는 원고의 중요 한 독서에 대 한 카 리 나 Perlaza 및 Greyson 루이스 감사합니다.

<ol>
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저자는 공개 없다.

경작 Stentor 다양을 한 도전 선물 한다. 첫째, 세포의 많은 수를 필요로 하는 실험을 수행 하기 위해 하나 Stentor 농도 20 셀/mL을 초과 하면 건강에 해로운 될 문화로 Stentor 문화의 많은 수를 유지 해야 합니다. 둘째, 자주 Stentor 문화를 오염 수 생물 Stentor 보다 빠르게 분할 하 고 (일반적인 오염 물질은 rotifers) 문화를 압도. 따라서, 그것은 현미경으로 문화를 주기적으로 검사 하 고 오염 물질을 제거 하는 데 필요한입니다. 때때로, 새로운 문화는 오염 된 문화에서 수동으로 구출 하는 세포의 작은 숫자에서 시작 될 필요가 있다. 이 건강 한 Stentor 문화를 유지 하는 데 필요한 시간이 증가 합니다. 셋째, 단일 셀 400 mL 문화 확대 필요 합니다 적어도 한 달 Stentor 세포 주기는 3-5 일 때문에. 넷째, 다른 모델과 달리 ciliates Stentor 드물게 낭종에가 하 고 그들은 동결 수 없습니다 키를 누릅니다.
Stentor 경작의 중요 한 측면의 적절 한 음식 유 기체의 선택 이다. Stentor 경작을 위한 다양 한 방법은 설명 이전 했다. 그들 중 하나를 사용 하 여 탈지 우유 Stentor피드 박테리아 문화 제안 합니다. 이러한 기술은 Stentor; 경작에 효과적입니다. 그러나, 게놈 기술 응용 프로그램에서 정의 되지 않은 식품 생물 게놈 읽기에서 발생 하는 혼동을 피하기 위해 순수 샘플을 요구 한다. 현재 프로토콜을 사용 하 여, Stentor 질량에서 성장 될 수 있다 고, 그들의 음식, Chlamydomonas, 시퀀싱 되었습니다 때문에 genomic 오염 식품 유기 체에서 존재 수 수 감지 제어. 알 수 없는 이유로 타르 타르 어디 그가 발견 하기 전에 Stentor 반환 하 여 그의 주식을 보충 했다. 현재 프로토콜 우리 Stentor 수년간 계속 할 수 있게 되었습니다.
Stentor 재생 실험은 일반적으로 간단 하지만 마음에 계속 몇 가지 중요 한 세부 사항. 섹션 2에 관한 Stentor 절단 절반 세포 분에 마스터 수 있습니다. 마스터링 Stentor 의 고급 미세 절차 연습 주가 필요할 수 있습니다. 동안 때 자당 치료 다음 수행 됩니다에 대 한 10-30에 의해 부 화 시간을 증가 (제 3), 영상 시작 되는 시점에 대부분 셀 아직도 있다면 그들의 membranellar 밴드 자당 또는 요소 처리를 수행. 3 분 보육 넘어 자당 치료의 시간 그것은 세포 죽음 귀 착될 것 이다 때문에 늘리지 마십시오.
Stentor 의 영상 재생 시간의 오랜 기간 동안 이미지 큰 셀에 방법을 필요 합니다. 섹션 4에 이미징 방법만 똑바로 현미경으로 사용할 수 있습니다. 거꾸로 현미경 대신 사용할 수 있는 경우, 셀 슬라이드 또는 작은 챔버에 coverslip에 배치할 수 있습니다. 한 가지 방법은 증발을 방지 하기 위해 다른 coverslip와 석유 젤리와 커버 챔버를 만드는 것입니다. 또는 개별 셀에 대 한 챔버 1 x 1 cm2 실리콘 스페이서의 평방에 원하는 크기의 구멍 펀치 구멍을 만들어 할 수 있다 (테이블의 재료)는 coverslip에는 스페이서를 배치, 셀 챔버 그리고 다른 coverslip와 챔버. 이미징, Stentor 중생의 각 단계의 특성을 관찰 하는 올바른 방향에 있지 않은 경우 때 셀 계약을 확고 하 게 접시를 누릅니다. 중생의 단계를 식별 하는 확장 셀 보고 (전체 확장 소요 약 45 s). 셀이 잘못 된 방향에 있는 아직도, 두드리는 반복 합니다. 그림 1 과 그림 6 에 표시 된 이미지는 스테레오 줌 현미경;로 찍은 그러나, 모든 실험 상세한 해 부 실체 현미경 X 5를 사용 하 여 수행할 수 있습니다.
경작 및 이미징 Stentor 외 또 다른 도전을 재생, 특히 단계를 식별 하는 데 필요한 시간의 양의 추적 이다. 완벽 하 게 명확 하 게 보이는 구두 primordium의 지역 중심 재생 셀 이면 무대의 몇 초 걸립니다. 그러나 가끔은,, Stentor 셀 재생 단계, 따라서 식별 하기 위해 더 많은 시간을 복용의 명확한 임무를 방지 하는 방향에서입니다. 상당한 양의 무대 개별 재생 셀 모든 재생 세포, 따라서 감소 하는 준비 하 고 기다려야 관찰자 요구의 시간 정밀도의 정량화를 지연 시킬 수 및 다시 후 셀 이동 이미지 하는 데 필요한 시간 새로운 방향입니다. 따라서,이 실험은 모두 시간과 노동 집약. 이러한 이유로, 그것은 매우 바람직한 Stentor 세포를 감지 하 고 비디오 현미경 데이터에는 중생의 단계 할당에 대 한 자동화 된 방법을 개발 하는 것입니다. 이들은 또한 더 재현 실험에 대 한 허용 샘플 크기와 인간의 편견의 제거에서 증가 한다.
매우 민감한 genomic와 proteomic 방법의 출현은 단일 세포의 연구 범위에 넣어 하기 시작 했다. 이러한 단일 세포 분석 Stentor 셀의 거 대 한 크기 네요 개념 증명 실험에 대 한 바람직한 테스트 주제. 가능, 같은 실험에 대 한 기본적, 이다 Stentor 경작 하 고 그래서 여기에 설명 된 방법을 더 고급 단일 셀 기술의 추가 개발 역할을 담당할 해야.

세포의 효소, 하지만 그 구성 요소는 신중 하 게 정확한 크기로 조정 하 고 잘 정의 된 위치에서 배열 오히려 매우 복잡 한 기계 간단한 가방 않습니다. 개별 셀의 morphogenesis 셀과 발달 생물학, 핵심 프로세스를 나타내지만 그것의 분자 메커니즘은 알 수 없는1,2. 동안 일부 교양된 셀 모양을 닮은, 단 세포 유기 체 수는 매우 복잡 한 아키텍처, ciliates3,4복잡 한 대뇌 피 질의 패턴에 의해 exemplified.
아마도 가장 극단적인 예를 고도로 구조화 된 셀의 거 대 한 heterotrichous ciliate Tetrahymena Paramecium 하 먼 관련 Stentor coeruleus, 이다. Stentor 길이 1 m m 이며 속눈썹 microtubule 리본 전체 셀의 길이 실행 하는 병렬 스택 주최의 행으로 교체 하는 블루 안료의 이상의 100 세로 줄무늬를 덮여 있다. 셀은 트럼펫-모양 (그림 1), membranellar 밴드와 그것의 앞쪽 끝과 후부 끝 기판에 셀 연결 holdfast 구강 장치 (OA). 분명 이전 후부 극성 외 셀 또한 보여줍니다 독특한 랄 패턴화 속눈썹 행 사이의 간격 점차적으로 시계 방향으로 증가 되도록. 불연속 좁은 행 만나는 넓은 행 및 셀 표면에의이 지역에서에서이 결과 스트라이프 대비의 소재 시로 알려진, 앞쪽 끝 구조에 다른 셀5, 융합 때의 두 번째 세트의 형성을 일으킬 수 있다 공식적으로 Spemann의 조직자에 해당 하 고 있습니다. 따라서, 개발 생물학의 모든 주요 프로세스에 있는 그들의 아날로그 Stentor: axiation, 패턴 형성, 그리고 유도. 배아, Stentor다른 세포 사이 에서도 이러한 프로세스 운명 차이 의해 구동 됩니다, 그리고 그들은 운명 단일 셀 내의 다른 지역 간의 차이 의해 구동 되어야 합니다. 무슨 Stentor 내에서 지역 간의 차이점을 정의 신비 이다.
Stentor 의 일부 차단 하는 경우 셀의 푸는 시간에 정상적인 세포를 재생할 수 있습니다. 셀 경우 절반, 또는 훨씬 더 작은 조각으로 심지어 각 조각 정상 찾고 하지만 작은 셀으로 재구성 하 여 잘라내어 셀 부품6,7사이의 적절 한 비례를 복구. 심지어 작은 조각, 1/64번째 원래 셀의 크기는 작지만 일반적으로 잡힌 셀으로 다시 생성 하 고 다음 전체 크기6성장 수 있습니다. Stentor 따라서 세포 기관이 크기 스케일링 및 세포 성장 규제의 조직 또는 전체 유기 체 수준에 일반적으로 적용 되는 수술 방법을 사용 하 여 기계 장치를 공부 하는 독특한 기회를 제공 합니다.
Stentor 수술 작업의 넓은 범위에서 재생성 하 수의 속성 중 하나는 단일 nodulated macronucleus (그림 1)8전체 게놈 약 50000 사본을 포함입니다. 셀 조각 macronuclear 노드를 하나 이상 포함, 그것은 완벽 하 게 다시 생성 하는 기능. Stentor의 재생 능력을 기본 또 다른 재산의 막대 한 상처 치유 능력 이다. 많은 세포 유형9그들의 상처 치유 할 수 있다, 비록 Stentor 물리적 섭의 특별 한 범위에서 복구할 수 있다. Stentor10 세포질 흐름을 시각화 하는 방법 함께 과감 한 섭 동에서 Stentor 복구의 예로 이전 보고 되었다. 이러한 메서드는 세포질의 물리적 상태 어떻게 부상 하 고 이후 재생 영향의 연구를 수 있습니다.
Stentor의 거 대 한 크기, 특별 한 재생 능력, 그리고 사실 (예: 조직, axiation, 및 패턴화) 다세포 배아에서 발달 현상의 많은 명단 매력 중 많은 발달 생물학 토머스 헌트 모건7을 포함 하 여 지난 세기의 켜십시오. 50 년대와 60 년대 동안 microsurgical 접근 입증이 단 세포 유기 체11에서 재생 및 전체적 프로세스의 놀라운 배열. 그러나, Stentor 개발 되었습니다 분자 생물학 모델 시스템으로 최근에. 지난 몇 년 동안 Stentor 의 게놈 시퀀싱은8, 조립 하 고 먹이로 RNAi를 사용 하 여 유전자 발현을 교란 하는 방법은 개발된12살.
Stentor 현대 분자 생물학만을 위한 모형 유기 체에 개발 되었다 이유 중 하나는 최근 성장 때문에 그것의 긴 세포 주기 (3 ~ 5 일) 큰 문화의 어려움 이었다. 그러나 현대 genomic와 proteomic 방법 그들은, 사용 하 고 단일 Stentor 셀의 볼륨은 단일의 분석을 위해 개발 된 磁 방법에의 지 없이 이러한 방법에 대 한 충분 한 보다 더 적은 물자를 요구 하는, 셀 Stentor보다 훨씬 작은. 프로토콜의 섹션 1 단일 Stentor 셀에서 큰 문화를 설정 하기 위한 절차를 자세히 설명 합니다. 동일한 접근 셀 절단에 의해 얻은 세포 조각에서 큰 문화 확립을 사용할 수 있습니다. 섹션 1은 또한 시간의 오랜 기간 동안 건강 한 Stentor 문화를 유지 하기 위한 지침을 제공 합니다. 프로토콜의 섹션 2 유리 바늘으로 셀을 수동으로 절단 하 여 세포 재생을 유도 대 한 방법론을 제공 합니다. 특정 셀 구조 (membranellar 밴드와 구강 장치)의 재생을 유도 하는 두 가지 방법에 전념 하는 프로토콜의 제 3: 다음 이러한 구조를 흘리기 이끌어 자당 또는 요소 셀 치료 그들의 재생입니다. 프로토콜의 제 4 시간의 오랜 기간 동안 개별 재생 세포의 영상에 대 한 방법을 자세히 설명합니다. 제 4 단계의 중생과 중생 역학의 분석에 대 한 도움말의 설명으로 끝납니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stentor coeruleus live culture</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>131598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas reinhardtii on agar</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>152040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteurized springwater, 1-quart bottle</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>132458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose, 1500 cP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M0387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex glass spot plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13748B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>715740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-cup glass container with glass lid</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1095600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CultureWell silicone sheet material</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>664475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass</td>
			<td>Fisher finest</td>
			<td>12-548-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Growth Media, optimized for Chlamydomonas culture</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1379801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>664475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petrolatum, Petroleum Jelly, White</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>P1037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary tubes. 
			OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm.</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B120-90-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller P-87</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 2000 stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiozoom V16, stereo zoom microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the study of regeneration in stentor

셀은 외부 섭에서 회복 하기 위해 그들의 부분을 다시 생성할 수 있이 필요가 있다. 단 세포 ciliate Stentor coeruleus 는 상처 치유 공부에 우수한 모델 유기 체 및 후속 세포 재생입니다. Stentor 게놈 최근, RNAi 등 현대 분자 생물학 방법을 함께 제공 되었다. 이러한 도구는 단일 세포 재생 분자 수준에서 연구를 가능 하 게. 프로토콜의 첫 번째 섹션에서 단일 셀 또는 셀 조각 Stentor 문화를 유지 하는 것에 대 한 일반 지침과 함께 수립 Stentor 셀 문화를 다루고 있습니다. 생화학, 시퀀싱, 그리고 질량 분석 같은 유용한 도구를 사용 하 여 대량에서 Stentor 경작 할 수 있습니다. 프로토콜의 후속 섹션 커버 Stentor재생을 유도 하는 다른 접근 방식. 수동으로 유리 바늘으로 세포를 절단 셀의 앞쪽 끝에 있는 특정 구조의 재생을 공부 하 고 수 자당 또는 요소 셀 치료 큰 셀 부품의 재생을 공부 수 있습니다. 이미징 개별 재생 셀에 대 한 방법은 준비 하 고 중생의 역학 분석 표제와 함께 제공 됩니다. 중생의 전체 과정은 3 단계로 분할 된다. 시각화의 진행 단계를 통해 세포의 인구 역학, 여 재생 타이밍에이 증명 됩니다.

Stentor 문화를 안정적으로 설립 하 고 개별 셀 또는 셀 조각을 사용 하는 프로토콜의 섹션 1에서 유지 되었습니다 있다. 큰 건강 한 문화에 대 한 대표적인 예제 비디오 1에 표시 됩니다.
중생의 시간 과정 Stentor 시작 단계 3.1, 이미징 및 제 4 (그림 7)에서 설명 하는 분석 방법에서에서 설명 하는 재생에 대 한 자당 치료 방법을 사용 하 여 측정 했다. 이 음모는 어떤 특정 단계에 도달 하 셀의 인구에 의해 걸린 시간에서 한 시간 동안 확산 임을 나타냅니다. 이러한 유형의 분석 셀 회생의 인구에서 재생성 과정에서 시간적이의 연구를 수 있습니다.
다음은 지금까지 수십 자당 치료 (그림 4 및 그림 6) 후 관찰 되었습니다 재생 타이밍의 요약 이다. (이 단계는 자당 희미하게 직후 시작) 어떤 membranellar 밴드 없이 눈물 처럼 Stentor 셀 1 단계 때. 이 단계는 3-6 h. 단계 2는 membranellar 밴드 나타나고 (자당 치료 후 3-6 h) 성장 하는 때 지속 된다. 이 단계는 3-4 h. 3 단계 구강 primordium membranellar 밴드 (자당 치료 후 6-8 h), 후부 끝에 나타나고 두 구조는 셀의 앞쪽 끝으로 이동 하는 경우에 대 한 지속. 이 단계는 1-2 시간 지속 된다. Membranellar 밴드와 구강 장치 셀의 앞쪽 끝에 도달 하면,이 중생의 완료를 나타냅니다. 셀 특성 Stentor 트럼펫 모양을 채택 했다. 셀 자당 치료 후 완전히 거듭난된 8-9 h를 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig1.jpg"> 그림 1입니다. 스냅숏 Stentor의. Membranellar 밴드와 구강 장치는 세포의 앞쪽 끝에 표시 됩니다. holdfast 셀의 후부 끝 이다. Stentor macronucleus nodulated입니다. 잘 먹이 Stentor 녹색 식품 그들 주로 Chlamydomonas를 포함 하는. 눈금 막대는 0.5 m m. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig2.jpg"> 그림 2입니다. Stentor 절단 설정. 셀 절단 수동으로 상용 해 스테레오 현미경을 사용 하 여 셀을 보는 동안 유리 바늘을 조작 하 여 수행 됩니다. 티슈 페이퍼의 목적은 흰색 배경에 더 나은 셀 참조를 제공 하는 것입니다. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig3.jpg"> 그림 3입니다. 비디오 3 유리 바늘 Stentor 를 잘라 하는 방법을 보여주는 스냅샷. (A) A Stentor 직전 바늘 접촉 그것. (B) A Stentor 바늘과 유리 슬라이드 사이 부드럽게 압착. (C) A 계약 Stentor 바늘의 힘에 반응. (D) A Stentor 눌러 부드럽게 셀에 바늘의 측면으로 절단 되 고 (E) A Stentor 하지만 지금 두 잘라 분리 되지 않는다. (F) 두 개의 Stentor 파편. 눈금 막대는 0.25 m m. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2.jpg"> 그림 4입니다. 제 3과 제 4 프로토콜의 구조 시각화. 이것은 자당 또는 요소 치료 및 세포 재생의 관찰을 수행 하기 위한 그림된 프로토콜 이다. 하단 패널에 표시 된 시간 세척 1의 시작에서 측정 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig5.jpg"> 그림 5입니다. 똑바로 현미경으로 중생의 이미징 및 직접 관찰에 대 한 설정. 각 4 µ L 드롭릿은 coverslip에서 매달려, 한 세포 재생을 겪고 있다. 유리 자리 접시의 우물에 물 방울의 증발을 제한합니다. 이 설정을 동시에 여러 세포의 재생에 따라 수 있습니다. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig6.jpg"> 그림 6입니다. Membranellar 밴드와 구강 장치 재생의 각 단계에서 Stentor 의 스냅샷. 1 단계 (A) 눈물 모양의 셀 모양 및 membranellar 밴드의 부재에 의해 특징입니다. (B) 단계 2 속눈썹 기반 구조를 지속적으로 뛰는 membranellar 밴드의 외관 특징 이다. Membranellar 밴드 패널 B에에서 흰색 파선으로 표시 됩니다-디 (C, D) 3 단계 구강 primordium (화살표 표시)의 외관에 의해 특징입니다. 구두 primordium membranellar 밴드의 뒤 끝에는 invagination 처럼 보인다. 구두 primordium 됩니다 다음 구강 장치 될 셀의 앞쪽을 향해 이동 합니다. (E) 재생 셀 Stentor 트럼펫 모양, 특성을 채택 했다 하 고 구강 장치 (화살표 표시) 셀의 앞쪽 끝에서 확대가 완료 됩니다. 눈금 막대는 0.25 m m. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig7.jpg"> 그림 7입니다. 스택 상자 플롯 표시 어떻게 자당 치료 후 재생의 모든 단계에서 세포의 비율 시간이 지남에 변경. 음모 재생 세포의 인구 내의 재생 단계의 타이밍에서이 보여 줍니다. "최종 등록" 중생의 완료를 나타냅니다. 셀 개수: 28. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57759/57759video1.jpg"> 비디오 1입니다. 건강 한 Stentor 문화의 예. 일반적으로, 문화는 집중, 문화를 나누는 것이 좋습니다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="/files/ftp_upload/57759/Video1.mp4" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57759/57759video2.jpg"> 비디오 2입니다. 스와 Stentor 늦추고. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="/files/ftp_upload/57759/Video2.mov" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/57759/57759video3.jpg"> 비디오 3입니다. 절단 Stentor. 개별 셀 수동으로 스테레오 현미경 셀 통해 유리 바늘을 눌러 해 부 아래 여러 조각으로 잘릴 수 있다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="/files/ftp_upload/57759/Video3.mov" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>문화에 대 한 문제</td>
			<td>가능한 치료</td>
			<td>가능한 예방</td>
		</tr>
<tr>
<td>문화는 rotifers 또는 다른 큰 유기 체에 의해 압도 됩니다.</td>
			<td>새로운 문화 접시에 가능한 많은 Stentor 를 제거 합니다. 다음 셀 세 번 세척.</td>
			<td>상용 공급 업체에서 구입 하는 경우에, 그들을 받을 때 Stentor 를 철저히 씻으십시오.</td>
		</tr>
<tr>
<td>문화는 곰 팡이 또는 다른 작은 유기 체에 의해 압도 됩니다.</td>
			<td>식별 코너는 최소한 Stentor. 그 지역에서 많은 Stentor 제거 하지 않고 최대한 많은 미디어를 제거 하 고 새로운 PSW에 추가 합니다. 섞어 부드럽게 하지만 완전히 distrubute에 침입 유기 체. 다음 먹이 생략 하 고 Stentor 그들을 먹을 것 이다.</td>
			<td>문화를 정기적으로 관찰 하 고 신선한 PSW에 대 한 미디어를 교환 하 여 작은 오염 물질을 제거.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor 서로 위에 누워 있다.</td>
			<td>농도 20 셀/mL 문화를 분할.</td>
			<td>더 자주 문화를 분할.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor 셀 결합 됩니다.</td>
			<td>5 일 마다 대신 4 일 마다 피드.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>문화는 어두운 폐기물의 많은 있다.</td>
			<td>어두운 소재, 셀을 제거 하지 않고 가능한 Stentor 폐기물의 제거. Stentor 어두운 소재에 장착 하는 경우 위쪽 및 아래쪽으로 그들의 낭비에서 Stentor 세포를 다음 셀을 제거 하지 않고는 쓰레기와 함께 미디어를 제거 플라스틱. 또는, 그 Stentor 제거 하 고 그에 따라 피드 덜.</td>
			<td>피드 Stentor 음식 문화의 100 mL 당 적은 1 mL.</td>
		</tr>
<tr>
<td>유해한 수준의 vacuolated/비 대 한 (둥근) Stentor.
</td>
			<td>많은 Stentor 세포를 제거 하지 않고 최대한 많은 미디어를 제거 하 고 새로운 PSW를 추가 합니다.</td>
			<td>미디어를 정기적으로 교환 합니다.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. Stentor경작에 대 한 문제 해결 가이드입니다.

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Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Stentor 에 중생의 연구 방법

거 대 한 ciliate, Stentor coeruleus, 재생을 연구 하 고 상처 치유에 뛰어난 시스템입니다. 단일 셀 또는 셀 조각에서 Stentor 셀 문화를 구축, 절단 세포 재생을 유도, 화학적 membranellar 밴드 및 구강 장치, 이미징, 및 세포의 분석의 재생성을 유도 하기 위한 절차 소개 재생입니다.

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

methods-for-the-study-of-regeneration-in-stentor

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

11.6K 조회수.  University of California San Francisco. 거 대 한 ciliate, Stentor coeruleus, 재생을 연구 하 고 상처 치유에 뛰어난 시스템입니다. 단일 셀 또는 셀 조각에서 Stentor 셀 문화를 구축, 절단 세포 재생을 유도, 화학적 membranellar 밴드 및 구강 장치, 이미징, 및 세포의 분석의 재생성을 유도 하기 위한 절차 소개 재생입니다.

비디오: Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

코스닥 시스템의 사용은 분자 메커니즘 Zebrafish의 재생의 연구를

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

연구

발생학

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or biliary-driven liver regeneration. In hepatocyte-driven liver regeneration, regenerating hepatocytes are derived from preexisting hepatocytes, whereas, in biliary-driven regeneration, regenerating hepatocytes are derived from biliary epithelial cells (BECs). For hepatocyte-driven liver regeneration, there are excellent rodent models that have significantly contributed to the current understanding of liver regeneration. However, no such rodent model exists for biliary-driven liver regeneration. We recently reported on a zebrafish liver injury model in which BECs extensively give rise to hepatocytes upon severe hepatocyte loss. In this model, hepatocytes are specifically ablated by a pharmacogenetic means. Here we present in detail the methods to ablate hepatocytes and to analyze the BEC-driven liver regeneration process. This hepatocyte-specific ablation model can be further used to discover the underlying molecular and cellular mechanisms of biliary-driven liver regeneration. Moreover, these methods can be applied to chemical screens to identify small molecules that augment or suppress liver regeneration.

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

담즙 중심의 간 재생을 연구하는 Zebrafish의에서 간세포 특이 절제

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of cyclic nucleotides. By modulating intracellular cyclic nucleotide concentration, MRP4 can regulate multiple cyclic nucleotide-dependent cellular events including cell migration. Previously, we demonstrated that in the absence of MRP4, fibroblast cells contain higher levels of intracellular cyclic nucleotides and can migrate faster. To understand the underlying mechanisms of this finding, we adopted a direct yet multifaceted approach. First, we isolated potential interacting protein complexes of MRP4 from a MRP4 over-expression cell system using immunoprecipitation followed by mass-spectrometry. After identifying unique proteins in the MRP4 interactome, we utilized Ingenuity Pathway Analysis (IPA) to explore the role of these protein-protein interactions in the context of signal transduction. We elucidated the potential role of the MRP4 protein complex in cell migration and identified F-actin as a major mediator of the effect of MRP4 on cell migration. This study also emphasized the role of cAMP and cGMP as key players in the migratory phenomena. Using high-content microscopy, we performed cell-migration assays and observed that the effect of MRP4 on fibroblast migration is completely abolished by disruption of the actin cytoskeleton or inhibition of cAMP-dependent kinase A (PKA). To visualize signaling modulations in a migrating cell in real time, we utilized a FRET-based sensor for measuring PKA activity and found, the presence of more polarized PKA activity near the leading edge of migrating Mrp4-/- fibroblast, compared to Mrp4+/+fibroblasts. This in turn increased cortical actin formation and augmented the process of migration. Our approach enables identification of the proteins acting downstream to MRP4 and provides us with an overview of the mechanism involved in MRP4-dependent regulation of fibroblast migration.

MRP4 regulates various cyclic nucleotide-dependent signaling events including a recently elucidated role in cell migration. We describe a direct, but multifaceted approach to unravel the downstream molecular targets of MRP4 resulting in identification of a unique MRP4 interactome that plays key roles in the fine-tuned regulation of fibroblast migration.

방법은 섬유 아세포 마이그레이션의 규정에 Mrp4 함유 Macromolecular의 단지를 공부하기

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Zebrafish의에서 에탄올에 의한 섬유 성 간 모델의 개발은 전구 세포 매개 간세포의 재생을 연구하는

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

방법은 림프 글 랜드와 혈구 세포에서를 검사합니다<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

작은 별 말미의 반구 Physa에서 전체 폴립 재생을 유도<em&gt; Nematostella의 vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

마우스 자궁 내막 상피와 기질 세포의 분리에 대한<em&gt; 체외</em&gt; 탈락

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their abundant pluripotent stem cell population and ability to regenerate all cell and tissue types after injuries that would be catastrophic for most animals. Recently, planarians have gained popularity as a model for eye regeneration. Their ability to regenerate the entire eye (comprised of two tissue types: pigment cells and photoreceptors) allows for the dissection of the mechanisms regulating visual system regeneration. Eye ablation has several advantages over other techniques (such as decapitation or hole punch) for examining eye-specific pathways and mechanisms, the most important of which is that regeneration is largely restricted to eye tissues alone. The purpose of this video article is to demonstrate how to reliably remove the planarian optic cup without disturbing the brain or surrounding tissues. The handling of worms and maintenance of an established colony is also described. This technique uses a 31 G, 5/16-inch insulin needle to surgically scoop out the optic cup of planarians immobilized on a cold plate. This method encompasses both single and double eye ablation, with eyes regenerating within 1-2 weeks, allowing for a wide range of applications. In particular, this ablation technique can be easily combined with pharmacological and genetic (RNA interference) screens for a better understanding of regenerative mechanisms and their evolution, eye stem cells and their maintenance, and phototaxic behavioral responses and their neurological basis.

This protocol shows how to consistently excise planarian eyes (optic cups) without disturbing surrounding tissues. Using an insulin needle and syringe, either one or both eyes can be ablated to facilitate investigations into the mechanisms regulating eye regeneration, the evolution of visual regeneration, and the neural basis of light-induced behavior.

수술 절제 분석 플라나리아에 아이 재생을 유학을위한

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

Uranium has been shown to interfere with bone physiology and it is well established that this metal accumulates in bone. However, little is known about the effect of natural uranium on the behavior of bone cells. In particular, the impact of uranium on osteoclasts, the cells responsible for the resorption of the bone matrix, is not documented. To investigate this issue, we have established a new protocol using uranyl acetate as a source of natural uranium and the murine RAW 264.7 cell line as a model of osteoclast precursors. Herein, we detailed all the assays required to test uranium cytotoxicity on osteoclast precursors and to evaluate its impact on the osteoclastogenesis and on the resorbing function of mature osteoclasts. The conditions we have developed, in particular for the preparation of uranyl-containing culture media and for the seeding of RAW 264.7 cells allow to obtain reliable and highly reproductive results. Moreover, we have optimized the use of software tools to facilitate the analysis of various parameters such as the size of osteoclasts or the percentage of resorbed matrix.

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

Uranium is known to affect bone metabolism. Here, we present a protocol aimed at investigating the effect of natural uranium exposure on the viability, the differentiation, and the function of osteoclasts, the cells in charge of bone resorption.

생체 외에서 Osteoclastogenesis에 자연 우라늄의 영향을 분석 하기 위한 방법

Uranium has been shown to interfere with bone physiology and it is well established that this metal accumulates in bone. However, little is known about ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to any type of injury. Common injury models in these animals remove large amounts of tissue, which damages multiple organs. To overcome this broad tissue damage, we describe here a method to selectively remove a single organ, the pharynx, in the planarian Schmidtea mediterranea. We achieve this by soaking animals in a solution containing the cytochrome oxidase inhibitor sodium azide. Brief exposure to sodium azide causes extrusion of the pharynx from the animal, which we call &#34;chemical amputation.&#34;&#160;Chemical amputation removes the entire pharynx, and generates a small wound where the pharynx attaches to the intestine. After extensive rinsing, all amputated animals regenerate a fully functional pharynx in approximately one week. Stem cells in the rest of the body drive regeneration of the new pharynx. Here, we provide a detailed protocol for chemical amputation, and describe both histological and behavioral methods to assess successful amputation and regeneration.

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

The planarian Schmidtea mediterranea is an excellent model for studying stem cells and tissue regeneration. This publication describes a method to selectively remove one organ, the pharynx, by exposing animals to the chemical sodium azide. This protocol also outlines methods for monitoring pharynx regeneration.

화학 절단 및 Planarian Schmidtea 지중해 에 인 두의 재생

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Stentor 에 중생의 연구 방법

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