산호 미세 전파는 아직 초기 단계에 있습니다. 폴립 구제 금융을위한 프로토콜을 최적화하는 것은 과학자들이 폴립을 실험실 환경에서 산호를 연구하기위한 모델로 사용할 수 있도록이 격차를 메우는 열쇠입니다. Polyp bail-out은 작은 산호 조각에서 여러 전파를 만들 수있게합니다.
폴립은 예를 들어 산호에서 미세한 과정의 관찰을 용이하게하는 다른 실험에 사용될 수 있습니다. 산호초가 위협받고 있습니다. 우리의 목표는이 복제 가능한 모델을 사용하여 효율적이고 비 침습적 인 방법으로 표백 및 기타 환경 위협으로부터 산호를 보호하기위한 전략을 개발하는 것입니다.
이 방법은 산호 생리학, 숙주 미생물 상호 작용 및 표백과 관련된 메커니즘의 조사를 도울 수 있습니다. 이러한 발견은 예를 들어 산호 프로바이오틱스의 최적화에 기여할 수 있습니다. 적절한 염분으로 바닷물을 사용하는 것이 중요합니다.
염분은 산호의 자연 환경 수준에서 시작하여 스트레스가 과도하게 해롭지 않도록 천천히 증가해야합니다. 정확한 순간에 폴립을 수집하고 가장 손상되지 않은 폴립을 선택하는 것은 생존에 매우 중요합니다. 시각적 데모는 이러한 단서를 이해하는 데 필수적 일 수 있습니다.
첫째, 대각선 절단 펜치를 사용하여 산호 식민지에서 작은 조각을 자른 다음 산호 식민지가 순응 된 12 밀리리터의 바닷물로 채워진 작은 페트리 접시에 넣으십시오. 플레이트를 주변 온도에서 약 24 시간 동안 열어 두어 물이 증발하고 염도가 점차 증가하도록하십시오. 폴립 사이에서 조직 소화가 관찰 될 때, 1 밀리리터 전달 피펫을 사용하여 산호 조직에 가까운 부드러운 흐름을 만듭니다.
흐름은 골격에서 이미 주변 조직을 소화 한 폴립의 분리를 천천히 완료 한 다음 피펫으로 페트리 접시의 물을 등압 수와 천천히 교환하는 데 도움이됩니다. 염분이 높은 바닷물을 준비하려면 일반 바닷물을 가져 와서 염도가 85 % 증가 할 때까지 염분이 높은 해수 3 리터를 준비하기 위해 염화나트륨을 첨가하십시오 이전에 입증 된 것처럼 산호의 작은 조각을 절단 한 후 연동 펌프에 연결된 등변성 해수 3 리터가있는 10 리터 용기에 넣으십시오. 이 용기에 이전에 준비된 염분 해수 세 리터를 시간당 126 밀리리터의 속도로 24 시간 동안 채우고 염분을 약 40 % 증가시킵니다 피펫을 사용하여 부드러운 물의 흐름을 만들어 골격에서 폴립을 방출하십시오.
컨테이너의 물을 이소 모틱 바닷물과 천천히 교환하십시오. 26.29 그램의 염화나트륨, 0.872 그램의 염화칼륨, 2.16 그램의 황산마그네슘, 11.94 그램의 염화마그네슘, 3.42 그램의 황산나트륨 및 0.26 그램의 중탄산나트륨을 탈이온수 1 리터에 첨가하여 칼슘이없는 바닷물을 준비한 다음이 칼슘이없는 바닷물로 페트리 접시를 채 웁니다. 작은 산호 조각을 자른 후 페트리 접시의 칼슘이없는 바닷물에 담그십시오.
접시를 80rpm의 회전 속도로 세 시간 동안 궤도 인큐베이터에 넣은 다음 조각을 40 개의 실용적인 염분 단위의 인공 바닷물로 준비하고 암피실린 리터 당 100 밀리그램을 함유 한 20 % DMEM으로 채워진 페트리 접시로 옮깁니다. 단편을 섭씨 26도 및 80rpm에서 인큐베이션한다. 폴립과 개별 폴립 사이에서 조직 소화가 관찰 될 때까지 매일 배지를 교환 한 다음 폴립을 멸균 된 바닷물로 옮기고 한 시간 동안 배양하십시오.
폴립이 스트레스가 없는 염분으로 여과된 바닷물로 되돌아오면, 스테레오 현미경으로 섬모 흐름으로 인한 조직 무결성과 움직임을 관찰하여 실행 가능한 폴립을 선택하십시오. 선택한 폴립을 페트리 접시에 넣고 폴립이 접시에서 멀리 떠 다니지 않도록 200 마이크로 미터 메쉬 크기의 플랑크톤 그물로 페트리 접시를 덮으십시오. Petri 접시를 사용 된 산호 종에 적합한 조건의 수족관 안에 넣으십시오.
조류 과증식을 방지하려면 적어도 일주일에 한 번 페트리 접시를 열어 물을 재생하고 접시를 청소하십시오. 앞과 같이 폴립을 선택한 후, 전사 피펫을 사용하여, 50 밀리리터의 등모성 해수로 채워진 75 평방 센티미터 표면 셀 플라스크에 넣은 다음, 플라스크를 닫고 12시간 광주기, 섭씨 26도 및 40 rpm으로 설정된 인큐베이터에 넣는다. 플라스크에 조류 또는 생물막이 채워지면 내용물을 깨끗한 플라스크로 옮기십시오.
본 연구에서, 폴립 구제금융은 세 가지 다른 방법에 의해 유도되었다. 물 증발 방법은 배양 후 24 시간 이내에 완전한 구제 금융을 초래했으며, 염분은 24 시간 후에 40에서 59 실용적인 염분 단위로 증가했습니다. 염수 공급 방법은 또한 인큐베이션 24 시간 후에 폴립 구제 금융을 초래했다.
여기서, 염도는 12시간 배양 후 40개에서 52개의 실용적인 염분 단위로 증가하였고, 그 후 24시간 후에 59개의 실용적인 염분 단위로 증가하였다. 칼슘이 없는 바닷물에서의 인큐베이션을 통한 구제금융 유도는 그 안에서 폴립을 세 시간 동안 배양한 후 완료하였고, 이어서 20%DMEM 배지에서 20시간 인큐베이션한 후, 세 가지 방법 모두에서, 개별화된 산호 폴립이 생성될 수 있었다. 증발 방법에 의해 생성 된 산호 폴립은 육 주 동안 생존 할 수있는 반면, 염분이 높은 해수 공급 방법으로 생성 된 폴립은 수족관 내부의 페트리 접시에서 여덟 주 동안 생존 할 수 있습니다.
인큐베이터 내부의 세포 배양 플라스크에 보관된 해수 증발 방법으로부터 얻은 폴립은 조직의 완전한 해리 없이 최대 삼주 동안 생존하였다. 해골에서 폴립을 분리 할 때, 온화한 것이 중요합니다. 그들이 완전히 분리되지 않은 경우, 강하게 피펫팅 된 물에 의한 분리를 강요하면 손상이 발생하고 생존율이 낮아집니다.
이러한 방법을 사용하여 폴립의 정착을 유도 할 수 있습니다. 폴립 정착은 석회화 및 성장 과정에 대한 질문에 대답 할 수 있습니다. 폴립 구제 유인자의 개발 후, 연구자들은 산호 골격의 초기 형성을 연구하고 폴립 스케일에서 산호 표백을 직접 시각화 할 수있었습니다.
