The author thanks Drs. Mingjian Lu and Morris Birnbaum for helpful advice and funding support from NIDDK (R21DK089391).

방사성 표지 대사 기판을 포함하는 플라이 음식 1. 준비 <ol><li> 2 μCi를 방사성 표지 된 기질 (D- 글루코스 [6- (14) C] 글루코스, D- [1- (14) C] 또는 [1-14 C] -palmitic 산 40 - - 60 mCi의 / A 미세 원심 분리 관에서 혼합 한 15 μL FD &amp; C 청색 1 호 식품 염료 mmol) 및 H 2 O 25 ㎕의 총 부피를 같게한다. 주의 : 탄소 14 저에너지 베타 터이며 공기 짧은 범위를 가진다. 그러나 방사성 표지 분자 또는 실험자에 의해 우발적 인 섭취의 유출 방지하기 위해주의를 기울입니다. 식품 유리 병은 쉽게 뒤집어 비행; 방사성 표지는 액체 형태로 특히 때, 팁 것을 방지하는 용기를 수용해야합니다 (1.2 단계) 또는 응고 식품 (단계 1.4)에. 공급되는 또는 방사성 표지 CO 2의 소량을 내쉬고 시작합니다 방사성 표지 된 기판을 공급 한 파리. 이 파리는 흄 후드에 아크릴 상자에 보관하고, 작은 접시 KOH의 캘리포니아의해야n은 CO 2 스크러버로서 사용 상자에 설정 될 수있다. </li><li> 피펫 빈 플라이 식품 유리 병의 바닥에 방사성 표지 기판과 파란색 염료 믹스의 모든 (높이 : 9.4 cm, 폭 : 2.2 cm). </li><li> (- 음식 10 ㎖를 함유 한 유리 병에 대해 높은 전력 레벨에서 20 초 15) 식품 단지 액화 될 때까지 가열 표준 전자 레인지에서 음식 비행. </li><li> 푸른 색의 균일 성을 모니터링하는 것은 완전한 혼합을 보장하기 위해, 소용돌이 빠르게 방사성 표지 기판 / 파란색 염료 혼합 975 μl의 용융 음식을 추가합니다. </li><li> 30 분 - 음식이 식 20 실온에서 완전히 응고 할 수 있습니다. </li></ol> 성인 과일 파리 2. 먹이 방사성 표지 대사 기질 <ol><li> 성인 마취하는 압력 조절기와 CO 2 탱크 아크릴 기재에 융착 접속 다공성 폴리에틸렌으로 이루어진 CO 2 마취 장치를 이용 날아간다. / 분 5 L로 마취 장치에 CO 2 흐름. <ol><li> 전송 마취(- 바이알 당 30 파리 N = 15) d를 방사성 표지, 파란색으로 염색 한 음식을 포함하는 튜브 (으)로 운항하는 항공사. 캡 거품 마개 유리 병, 그리고 파리가 일어날 때까지 수평으로 휴식. 뚜껑이 아크릴 용기에 전송 튜브 (180cm X 180cm X 240cm 높이). </li></ol></li><li> 2에 대한 방사성 표지 음식에 파리를 전송하기 전에 24 시간 - - 단기 공급을 위해, 18 파리를 굶어. 3 시간 공급 단계 T 그는 기아 단계가 중요합니다 공급 파리 안정적으로 그들에게 제시 음식의 새로운 소스를 먹을 수 없기 때문에 . (5)의 과정을 통해 장기 급지 - 8 일 파리 고갈 될 필요는 없지만, 실험자는 파리에 수납 된 바이알에서 방사성 표지 된 식품의 수분 함량을 모니터하고 바이알에 물을 첨가하는 바늘과 주사기를 사용해야 건조 식품과 함께. </li><li> 전송 새로운 유리 병으로 그들을 &quot;도청&quot;로 레이블이 지정되지 않은 음식 (으)로 운항하는 항공사. (2)의 초기 추적 기간 - 4 시간은 파리가 자신의 손톱에서 방사성 표지 음식 입자를 청소 할 수 있으며 방사성 표지의 소화를 허용장내에 남아있는 에드 음식. 푸른 복부를 찾기 위해 파리의 육안 검사에 의해 장내를 통해 음식의 진행 상황을 모니터링합니다. </li><li> 그 후, 전송은 다른 음식 유형으로 운항하는 항공사 96 시간 유전 18 C 또는 30 ℃에서 - - 또는 주위 온도 (12 (12의 효과 측정을위한 표준 식품 1 % 한천에 24 시간 호흡에 금식 상태 대 공급) 조작 예를 들어, 온도에 민감한 GAL80 (GAL80 TS)를 사용하여). 주 :이 체이스 기간의 길이는 실험이 수행되면서 달라진다. 예를 들어, 30 ℃에서 96 시간 체이스 순서대로 GAL80 TS를 사용하여 실험에 필요할 수있다 완전히 GAL4 종속 유전자 발현을 활성화합니다. </li></ol> 이산화탄소 -collection 장치의 제조 3 <ol><li> 14 C-포도당 또는 14 C-팔 미트 산, 그쪽으로 표시 파리를 포함 구성 &quot;포드 비행&quot;하는 재료, 메쉬 캡 튜브를 조립t는 대기에 개방 유지됩니다. 25mm 길이, 둥근 바닥 튜브를 떠나, 12mm X 75mm 폴리 프로필렌 튜브의 상단에 50mm를 잘라. 130 μm의 나일론 메쉬의 35mm X 35mm 사각형을 준비합니다. 또한, 테이프 디스펜서에 투명 테이프를 구하십시오. </li><li> 이산화탄소 -collection 장치의 재료를 조립합니다. 각 포드 플라이를 들어, 20 ㎖ 유리 섬광 바이알, 오프 중심 구멍을 가진 고무 상부 스토퍼 잘 상부 스토퍼의 구멍을 통해 삽입되는 중심 학년 GF / B 유리 미세 섬유 필터 종이 (2.1 cm 직경 어셈블 원, 1 ㎛ 기공). GF / B 여과지 때문에 높은 습윤 강도 및 높은 로딩 용량이 사용된다. </li><li> 사용의 날에 5 % KOH의 신선한를 준비합니다. 단지 3.4 단계 전에 접어 아니라 그 고무 상부 스토퍼 구멍을 통해 나사 결합되는 중앙에 원형 GF / B 여과지를 놓고, 5 % KOH 100 ㎕로 포화. 그림 1을 참조하십시오. </li><li> 레이블이없는 미디어하는 인큐베이션 (들)에 따라nesthetize는 CO 2로 날아갑니다. 브러시는 나일론 메쉬로 차단 폴리 프로필렌 튜브, 모자로 날아와 튜브에 메쉬를 준수하는 투명 테이프를 사용합니다. 파리 깨어과 메쉬가 안전하게 튜브에 부착되기 전에 탈출 방지하기 위해 신속하게 작업 할 수 있습니다. 파리의 동일한 수는 특정 실험에 대한 각 플라이 포드에 사용되어야한다; 10 - 플라이 포드 당 20 파리는 섬광 계수 (아래 단계 4.1)에 의해 측정을 위해 충분한 방사성 표지-CO 2 생산하고 있습니다. </li><li> 20 ㎖의 유리 섬광 유리 병에 파리 포드를 전송합니다. 고무 상단 마개가 잘 KOH 포화 GF / B 여과지를 포함하는 센터를 들고 유리 병 캡. 유리 섬광 유리 병의 입술 위에 고무 상단 마개의 넓은 정상을 접습니다. 그림 1을 참조하십시오. </li><li> 세트 유리 뚜껑이, 아크릴 용기에 파리를 포함하는 유리 병, 시간 (2 ~ 12 시간이 잘 작동)의 다양한 기간 동안 품어. </li></ol> 결과 4. 분석 <ol><li> 에서4 ml의 신틸레이션 칵테일을 함유하는 6 ml의 플라스틱 섬광 바이알로 배양, 뚜껑을 벗기다 유리 바이알 및 전송 KOH 포화 GF / B 여과지의 끝. </li><li> 필요한 경우, 저장 기판의 후 결정을 위해 -80 ℃에서 드라이 아이스와 저장소의 비행 포드에서 파리를 동결. 이러한 샘플은 방사성하고 그에 따라 저장해야합니다. </li><li> / μCi를을 CPM을 결정하기 위해 0.5 μCi를 방사성 표지 기판 - 배경 역할을하지 않는 GF / B 형 종이 필터를 포함하는 하나 0.1을 포함하는 하나 2 등 : 추가 섬광 유리 병을 준비합니다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라, 섬광 계수기를 사용하여 각 시료에 대한 CPM을 측정한다. </li><li> 시간당 비행 당 pmol의 14 CO 2 / CPM 및 pmol의 14 CO 2를 계산합니다. 각 샘플에 대한 CPM 값의 배경 CPM을 뺍니다. 깔끔한 방사성 표지 기판 데이터에서 배경 보정 CPM / 샘플의 μCi를 카운트 계산합니다. <ol><li> 사용제조자가 제공 한 특정 활성 및 방사성 표지 된 기질의 농도를 방사 (예를 들어, 50 μCi를 / μmol, 0.1 μCi를 μL / 각각)이 pmol의 / CPM을 계산하도록. pmol의 14 CO 2 / 샘플 14 CO 2 / 샘플 CPM에서 배경 보정 플라이 포드 데이터를 변환하기 위해이 요소를 사용합니다. 그리고 파리의 수와 비행 포드 시간의 숫자로 나눕니다. </li></ol></li></ol>

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The author declares no competing financial interests.

이 프로토콜은 성인 초파리 특정 방사성 표지 된 기질의 산화를 측정하는 방법을 설명한다. 이 방법은 간단 정량적 재현성 성이며,이 ATP 생산에 산화 영양소 (들)를 식별 할 수 있기 때문에 전체 CO 2 생산 O이 소비를 측정하는 기존의 방법을 보완한다. 여기에 설명 된 방법을 사용하여 특정 방사성 표지 된 기질의 산화로부터 유리 CO 2의 측정은 전체 CO 2 생산을 측정하는 기술을 보완한다. 총 CO 2 제품 (V의 CO2가) 및 총 O 2 소모량 (V O2)가 공지되면, 대사 속도를 산출 할 수 있고, 산화 반응을위한 연료 소스 호흡 교환 비율에 기초하여 추정 될 수있다 (V를 대사량의 평가를 허용 CO2 / V의 O2 = RER). 언제탄수화물 배타적 기판 RER = 1이지만, 지방산은 단독 소스 RER = 0.7, 포도당, 지질의 산화 반응의 화학량 론에 의해이 때. 초파리 (14)의 산소 소비를 측정하는 장치의 부재에있어서, 상기 산화성 연료 소스를 식별 할 수 없다. 라벨이 추적 한 방사성 기판 또는 다른 양 및 방사성 표지 CO 2 생산의 측정 속도로 운항하는 항공사에 의해 그러나, 하나는 자극 동안이나 효과에 대해 서로 다른 시간 지점에서 주어진 기판을 산화하는 파리의 능력에 대한 결론을 도출 할 수 있습니다 연료의 산화에 돌연변이를 부여. 이 프로토콜에서 중요한 단계가 있습니다. 유출 및 연구 분야의 오염을 방지하기 위해, 방사성 물질을 사용할 때는 먼저주의를 기울여야한다. 단계 2.1 및 3.4 중 파리 마취 둘째, 실험자 장시간 CO (2)의 효과를 피하기 위하여 신속하게 작동해야신진 대사와 행동에 노출. 20 파리의 그룹 마취 새로운 바이알에 20 초 이하에서 비행 포드로 전송할 수 있습니다. 식품 유리 병에 마취 장치에서 전송하면, 유리 병은 음식 표면에 갇히지에서 마취 파리를 방지하기 위해 옆에 휴식해야한다. 파리 단계 2.2에서와 같이 여러 날에 걸쳐 공급 방사성 표지 음식 경우, 실험자는 파리 탈수에 민감로 음식이 건조하지 않도록 보장해야한다. 연방 또는 금식 상태 사전 라벨링 라벨의 선택, 표시 시간의 길이, 플라이 포드 기간, 마취의 방법은이 방법을 사용할 때, 문제 및 변형을 실시 할 수있는 파라미터이다. (- 3 시간 2) 사전에 금식 기간을 실시하지 않는 방사성 표지 음식의 상당량을 소비 할 가능성이 첫째, 짧은 라벨링 기간을 실시 날아갑니다. 라벨 C 둘째, 검색한 대사 표현형에 대한 이끌어 낼 수있는 결론에 영향을 미칩니다. 예를 들어, D-에서 방사성 표지 CO 2 생산 [1- (14) C] 글루코스는 시트르산 사이클 또는 펜 토스 포스페이트 션트 통해 산화를 반영 할 수는 D-에서 방사성 CO 2 생산 반면 [6- (14) C] 글루코스 산화 반영 시트르산 회로 통해서만 12,15,16. 필수 아미노산 (17, 18)에 대한 방사성 트레이서 파리 먹이는 것은 단백질 유래의 아미노산의 산화를 평가하는 좋은 전략이 될 것이다. 마지막으로, 방사성 표지 포도당과 긴 표시 기간은 또한 중성 지방 (19)와 같은 쉽게 피루브산과 interconverts 알라닌 등의 아미노산과 같은 분자의 다른 클래스에이 전구 물질의 혼입의 가능성을 올립니다. 이것은 분자 (6)의 서로 다른 클래스에 혼입 된 방사능을 측정함으로써 평가 될 수있다. 사실, 파리의 별도의 동료가 공급 될 수 방사선동일한 방식으로 기판 iolabeled하고, 예를 들면 조건 (6)에 저장된 공급 글리코겐 및 트리글리세리드 유지 금식된다 플라이 포드 실험 또는 방사능 표지의 측정에 사용된다. 또 다른 전략은 방사성 표지식이 영양소 자체 산화 이들 영양소 저장되지 형태 공개 가능성 단락 표시 기간을 사용하는 것이다. 셋째, 파리의 두 그룹이 처음 주어진 시간에 걸쳐 14 CO 2 생산의 동일 등급하지만, 매우 상이한 레이트를 가질 수 있다는 것도 가능하다. 따라서, 플라이 창에 지출 파리 시간의 양을 변화하면 표현형의 변화를 평가할 때 변경하는 중요한 매개 변수 일 수있다. 마지막으로,이 프로토콜은 CO 2 마취 플라이 포드 장치에 파리를 넣어 짧은 기간의 사용을 요구한다. CO 2 마취 플라이 포드 실험의 과정을 통해 대사 기능에 영향을 미칠 수있다. 또 다른 a를pproach은 신진 대사 속도 (20)에 영향을주지 않습니다 질소 마취를 사용하는 것입니다. 연료의 산화 및 신진 대사 속도와 같은 복잡한 시스템을 측정하는 기술과 마찬가지로, 여기에 설명 된 방법은 한계가있다. 첫째, 기판의 다른 시작 양 분석의 CO 2 컬렉션 위상을 입력 따라서 방사성 음식의 다른 양을 소비 할 수있는 다른 그룹에 날아 것이 가능하다. 이것은 큰 샘플 크기의 실험을 수행함으로써 한꺼번에 파리를 공급함으로써 어느 정도에 대해 제어 될 수있다. 비슷한 푸른 색 용기는 방사성 표지를 소비 한 것이며 실험의 추적 부분에 이월 할 수와 짧은 라벨 기간 동안, 파리. 파리의 그룹에 남아있는 방사성 표지의 양을 또한 실험의 끝에서 상기 공급 및 초기 추적 기간 종료 후 파리 별도 코호트를 측정 할 수있다. 사이 둘째, 활동 수준파리 포드에서 파리의 그룹이 다를 수 있습니다. 이는 실험적으로 결정된 데이터를 해석 할 때 고려되어야 할 것이다. 셋째로,이 기술은 전체 CO 2 생산 특정한식이 영양제 또는 영양소의 저장 형태 (들) 만 생산을 측정하지 않는다. 이 프로토콜은 대체하지 않습니다하지만 다른 및 추가 정보를 제공하기 때문에 대신 VCO (2)의 측정을 보완. 여기에 기재된 방법은 특정 대사 기질 미량의 산화 반응의 산물이며, 방사성 CO 2 호기 측정한다. 포도당 지방산 또는 아미노산 - - 사용 된 상표를 변화시킴으로써 하나는 기아 같은 다른 유전 적 배경에 다른 생리 학적 조건하에 대사 상이한 기판들의 기여를 평가하기 위해 더욱 정교한 실험을 설계 할 수있다. 이 기술의 미래 응용 프로그램은 metabolis의 측정을 포함개발의 애벌레와 번데기 단계, 각각 영양소 저장 및 고장의 극단을 특징으로 초파리의 수명주기의 두 단계에서 m.

모델 생물 초파리 melanogaster의에서 작업 유전 원리, 발달 과정, 성장, 노화, 행동, 내성과 인간의 질병 1,2의 이해에 크게 기여하고있다. 초파리의 유전 및 세포 생물학적 접근 방법의 무수한은이 분야에서 발전을 주도하고있다. 그러나, 초파리의 신진 대사의 연구는 더 느리게 개발 등 작은 동물의 신진 대사 매개 변수를 측정의 어려움에 상당 부분 기인하고있다. 당뇨병과 같은 인간의 질병을 연구하는 모델로 초파리를 이용하여과 성장과 다양한 병리에 신진 대사의 기여를 이해에 대한 관심은 개발이 생물 3,4를위한 대사 기술을 적용 할 필드를 밀었다. 신뢰할 수있는 방법은 이제 초파리 대사 매개 변수의 수의 측정에 사용할 수 있습니다. 예를 들면, 식품 섭취를 평가 간단 <s&gt; 5까지 저장 트리글리세리드 글리코겐뿐만 아니라 혈당 수준 체액 순환 글루코스 4 개의 분자로 구성된 이당류 플라이, 트레할로스, 주요 순환 당 수준. 대사 추적자의 사용은 저장 형태의 글리코겐과 중성 지방 6 포도당으로식이 요법과 흡수 된 영양소의 전환에서 영양소 흡수에 대한 연구를 활성화하고있다. 대사율 열매 산소 소비 7,8 이산화탄소 측정 날아 (CO 2) 생산에 평가 될 수있다. 시트르산 회로식이 저장 탄수화물과 지방산의 대사로부터 유도되는 아세틸 코엔자임 A (COA)로서주기를 입력 할 수있는 두 개의 탄소 단위를 산화시킨다. 싸이클마다 한 차례 GTP (또는 ATP)의 각 분자 및 전자 공여체 FADH 2 NADH 세 분자 및 폐 제품이 CO 2 분자를 생성한다. CO 2 생산 수기초 대사 속도를 추정하는데 이용 될 수있다. 총 CO 2 생산은 시판 또는 제 respirometers 9-10,11의 사용을 통해 초파리에서 정량화 할 수있다. 특히 O이 소비의 측정과 결합 된 총 CO 2 생산의 측정은, 전신 에너지 대사에 대한 통찰력을 제공한다. 그러나, 영양을 식별하지 않는이 법안은 아데노신 삼인산 (ATP) 생산을 위해 산화된다. 탄수화물, 지방산, 단백질 : 영양소의 세 가지 주요 클래스는 CoA를 아세틸하는 TCA 회로 다음 변환을 입력 할 수 있습니다. 글루코오스 -6- 포스페이트, 글루코오스 또는식이 저장된 글리코겐으로부터 유도는 아세틸 CoA를 형성하는 피루 베이트 탈수소 효소에 의해 피루브산 탈 카복실되고 변환 될 수있다. 다음 시트르산 회로 입사 아세틸 -CoA ß 산화 수율로식이로부터 또는 저장 트리글리세리드로부터 유도 된 지방산의 고장. 최종적으로아미노산의 대부분은 알파 - 케 토글 루타 레이트 등의 아실 CoA 또는 시트르산 사이클의 중간체 인 아세틸 피루브산으로 변환 후 시트르산 회로를 입력 할 수있다. 기저 및 자극 조건에서 에너지 대사 영양 관련 기여 방사성 트레이서를 사용하여 모니터링 할 수있다. 여기에 제시된 프로토콜 12,13 배양에서 배양 세포에서 산화를 평가하기 위해 사용되는 프로토콜로부터 초파리에서 사용하기 위해 적합하다. 이 방법에서, 초파리는 공급 (14) C-방사성 표지 대사 기판 (탄수화물, 지방산, 또는 아미노산) 짧은 (시간)의 규정 또는 긴 (일) 펄스, 레이블이없는 음식 추격 한 다음에 노출됩니다 챔버 중탄산 호기 CO 2 포집 수산화 칼륨 (KOH) 포화 된 여과지를 포함. 방사성 표지는 중탄산 섬광 계수에 의해 정량화 될 수있다. 실험 사이의 방사성 표지-CO 2 생산의 차이파리 알 기는 예 유전자형 간의 연료 대사 연장 빠르거나 본질적인 차이에 걸쳐 ATP 생산을위한 다른 연료의 사용을 반영 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 &amp;micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC075H050UC</td><td></td></tr><tr><td>GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50 &amp;micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC045X050UC</td><td></td></tr><tr><td>Glucose, D-[1-14C]-, 50&amp;micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC043X050UC</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116</td><td></td></tr><tr><td>Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12 x 75 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959AA</td><td></td></tr><tr><td>Mesh, nitex nylon, 120 &amp;micro;m</td><td>Genesee Scientific</td><td>57-102</td><td></td></tr><tr><td>20 ml borosilicate glass scintillation vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-15</td><td></td></tr><tr><td>Flask top stopper with off-center hole</td><td>Fisher Scientific</td><td>K882310-0000</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene center well</td><td>Fisher Scientific</td><td>K882320-0000</td><td></td></tr><tr><td>Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-874-20</td><td></td></tr><tr><td>Ecoscint A</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-273</td><td></td></tr><tr><td>6 ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps</td><td>National Diagnostics</td><td>SVC-06</td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of carbon dioxide production from radiolabeled substrates in drosophila melanogaster

초파리 유전학의 힘은 점점 호르몬 신호 전달과 신진 대사의 질문에이 유기체 인간 질병 모델의 개발에 적용되고있다. 이러한 신진 대사 속도와 같은 매개 변수 측정을위한 민감한 방법 등의 과일 파리 같은 작은 동물의 생리 및 질병의 이해를 구동하기 위해 필요하다. 여기에 설명 된 방법은 포도당이나 지방산 등의 14 C 표지 기판 미량 함유 식품을 공급 성인 초파리 소수 연료의 산화를 평가한다. 공급 기간과 추가 실험 조작 후에, 파리, 방사성 CO 2 중탄산 칼륨과 같은 방사성 표지 된 기질의 산화 반응에서 생성 된 후 트랩 호기 KOH 포화 된 여과지를 함유하는 유리 병에 위치 메쉬 캡핑 짧은 튜브로 전송 KHCO 3. 이것은 방사성 중탄산은 섬광 계수에 의해 측정된다. 이 수성이다연료 산화의 연구, uan​​titative 재현하고 간단한 방법. 방사성 표지 된 글루코스, 지방산, 또는 아미노산의 사용은 공급 금식 같은 다른 유전 적 배경을 다른 조건으로 에너지 대사에 서로 다른 연료 원의 기여의 결정을 허용한다. 이것은 생체 에너지 대사에서 측정하는 데 다른 방법을 보완 및 대사 조절의 이해를 촉진한다.

방사성 기질의 대사로부터 생성되는 호기 및 포획 방사성 CO 2의 양 플라이 포드 파리의 수뿐만 아니라 동물의 CO 2 회수 장치에 소요되는 시간과 상관한다. 이를 테스트하기 위해 18 시간 동안 금식 한 파리 2 시간 동안 방사성 표지 팔 미트 산 (0.02 μCi를 / μL 음식)를 공급 한 후 3 ~ 6 시간의 배양을위한 12 또는 25 동물의 그룹에서 방사성 표지 CO 2 생산을위한 시험 하였다. 25 파리 제조 CO 2의 양은 12 파리 제조 거의 두 배였으며, 각 그룹의 양이 항온 처리 시간은 6 시간 (도 2a)을 3 시간으로 증가 될 때 두배. pmol의 14 CO 2 / 파리 / 시간은 각 그룹에서 거의 동등했다. 금식 ß 오하여 지방산 류의 분해를 촉진xidation; 따라서 지방산 산화에서 CO 2 생산 먹인 동물에 비해 절식 동물에서 증가한다. 이 경우인지 확인하려면 18 시간이 파리 2 시간 동안 방사성 팔 미트 산을 공급 하였다 금식. 짧은 펄스 공급 후, 파리의 두 그룹으로 분할하고, 3 시간 동안 비 표지 즉석 식품을 1 % 아가로 전송 한 다음 2 시간 동안 포드 비행 옮겼다. 두 개의 별도의 실험에서, ß 산화가 금식 동물 증가되었음을 나타내는 식품 (그림 2B)에 쫓아 파리와 비교 한천 생산 훨씬 더 많은 방사성 표지 CO 2에 쫓아 날아갑니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig1.jpg" /> 도 1 호기 수집 장치 방사성 표지 CO 2. 방사성 표지 대사 기판을 소비 한 파리는는 &quot;비행 포드&quot;(FP), 메시 (M)로 출장 컷오프 원심 분리기 튜브에 배치했다. 플라이 포드 100 μL 포화 GF / B 여과지를 포함하는 중앙 웰 (CW)를 배치되는 오프 - 센터 홀을 포함하는 고무 상부 스토퍼 (S)와 20 ㎖ 유리 섬광 바이알에 넣고, 캡핑 5 % KOH. 호기 CO 2는 KOH와 반응 중탄산 여과지에 포집된다. 갇혀, 방사성 표지 CO 2가 포화 여과지의 섬광 계수에 의해 정량화 할 수있다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54045/54045fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig2.jpg" /> 그림 2 시간 14 CO 2 생산의 상관 관계와 파리에서의 수연준 금식 조건에 비행 포드와 응답합니다. (A) 방사성 표지 팔미 테이트 공급 파리에서 생산 된 14 CO 2의 양 (N = 12 (오픈 바) 또는 25 (폐쇄 바)) 파리 포드에서 소비와 시간 (3 또는 6 시간 시험 파리의 수와 상관 관계 ). 당 비행을 바탕으로, 파리는 0.99, 1.13, 1.10 및 1.01 pmol의 14 CO 2 / 시간 (그래프 데이터로 올바른 순서로 같은 왼쪽에 나열된 데이터)를 생산했다. (B) 음식을 추격했다 파리보다 팔미 테이트 더 많은 방사성 표지 산화 한천에 추격했다 파리. 데이터는 두 실험이며 표준 편차 수단으로보고되는 N = 16-17 파리 / 그룹 (실험 1); N = 10 파리 / 그룹 (실험 2). * P = 0.017, 학생의 t-test를. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54045/54045fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

방사성 표지 된 기판에서 이산화탄소 생산에서의 측정<em&gt; 노랑 초파리</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...

measurement-carbon-dioxide-production-from-radiolabeled-substrates

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

9.1K 조회수.  University of Virginia. This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Drosophila Melanogaster에서 애벌레 CNS의 해부

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

연구

생물학

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human organs, possess highly conserved metabolic pathways and have a relatively short lifespan that allows the study of different fundamental mechanisms in a short period of time. It is, however, surprising that one of the mechanisms essential for cellular metabolism, the mitochondrial respiration, has not been thoroughly investigated in this model. It is likely because the measure of the mitochondrial respiration in Drosophila usually requires a very large number of individuals and the results obtained are not highly reproducible. Here, a method allowing the precise measurement of mitochondrial oxygen consumption using minimal amounts of tissue from Drosophila is described. In this method, the thoraxes are dissected and permeabilized both mechanically with sharp forceps and chemically with saponin, allowing different compounds to cross the cell membrane and modulate the mitochondrial respiration. After permeabilization, a protocol is performed to evaluate the capacity of the different complexes of the electron transport system (ETS) to oxidize different substrates, as well as their response to an uncoupler and to several inhibitors. This method presents many advantages compared to methods using mitochondrial isolations, as it is more physiologically relevant because the mitochondria are still interacting with the other cellular components and the mitochondrial morphology is conserved. Moreover, sample preparations are faster, and the results obtained are highly reproducible. By combining the advantages of Drosophila as a model for the study of metabolism with the evaluation of mitochondrial respiration, important new insights can be unveiled, especially when the flies are experiencing different environmental or pathophysiological conditions.

In this paper, a method to measure oxygen consumption using high-resolution respirometry in permeabilized thoraxes of Drosophila is described. This technique requires a minimal amount of tissue compared to the classic mitochondrial isolation technique and the results obtained are more physiologically relevant.

조직의 최소 금액을 사용 하 여 초파리의 Permeabilized 섬유에 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 측정

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

생화학

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

성인 Drosophila Melanogaster의 로코의 고해상도 비디오 추적

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

애벌레의 모니터링 심장​​ 기능 Drosophila melanogaster 생리 연구

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

성인에서 Oenocytes의 해부 Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

의 분리 Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

초파리 melanogaster Larval 및 성인 두뇌의 변화 분석

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

신경과학

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

대사율의 측정에<em&gt; 초파리</em&gt; Respirometry를 사용하여

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

초파리에 대한 미세호흡계 적응 - CASK 돌연변이 대사에 대한 통찰력

Measuring O2 Consumption in Drosophila melanogaster Using Coulometric Microrespirometry

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable environment. A coulometric microrespirometer consists of an airtight chamber in which O2 is consumed and the CO2 produced by the organism is removed by an absorbent medium. The resulting pressure decrease triggers electrolytic O2 production, and the amount of O2 produced is measured by recording the amount of charge used to generate it. In the present study, the method has been adapted to Drosophila melanogaster tested in small groups, with the sensitivity of the apparatus and the environmental conditions optimized for high stability. The amount of O2 consumed by wildtype flies in this apparatus is consistent with that measured by previous studies. Mass-specific O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and known to be less active, was not different from congenic controls. However, the small size of CASK mutants resulted in a significant reduction in O2 consumption on a per-fly basis. Therefore, the microrespirometer is capable of measuring O2 consumption in D. melanogaster, can distinguish modest differences between genotypes, and adds a versatile tool for measuring metabolic rates.

저자 스포트라이트: Drosophila melanogaster 및 사막 적응 딱정벌레에 대한 온도의 영향 

Coulometric respirometry is ideal for measuring the metabolic rate of small organisms. When adapted for Drosophila melanogaster in the present study, measured O2 consumption was within the range reported for wildtype D. melanogaster by previous studies. Per-fly O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and less active, was significantly lower than the wildtype.

전기량 미세호흡계를 사용한 초파리 멜라노가스터의O2 소비량 측정

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable ...

방사성 표지 된 기판에서 이산화탄소 생산에서의 측정

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

Drosophila Melanogaster에서 애벌레 CNS의 해부

조직의 최소 금액을 사용 하 여 초파리의 Permeabilized 섬유에 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 측정

성인 Drosophila Melanogaster의 로코의 고해상도 비디오 추적

애벌레의 모니터링 심장 기능 Drosophila melanogaster 생리 연구

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

성인에서 Oenocytes의 해부 Drosophila melanogaster

의 분리 Drosophila melanogaster Testes

초파리 melanogaster Larval 및 성인 두뇌의 변화 분석

대사율의 측정에

전기량 미세호흡계를 사용한 초파리 멜라노가스터의_O2 소비량 측정

방사성 표지 된 기판에서 이산화탄소 생산에서의 측정

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조직의 최소 금액을 사용 하 여 초파리의 Permeabilized 섬유에 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 측정

성인 Drosophila Melanogaster의 로코의 고해상도 비디오 추적

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의 분리 Drosophila melanogaster Testes

초파리 melanogaster Larval 및 성인 두뇌의 변화 분석

대사율의 측정에

전기량 미세호흡계를 사용한 초파리 멜라노가스터의O2 소비량 측정

애벌레의 모니터링 심장 기능 Drosophila melanogaster 생리 연구

전기량 미세호흡계를 사용한 초파리 멜라노가스터의_O2 소비량 측정