이 연구는 NP 국립 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC, 발견 부여) 및 대학교 드 몽 튼에서 교부 금에 의해 투자 되었다. LHB 건강 연구 (CIHR), 뉴 브 런 즈 윅 혁신 재단 (NBIF) 및 대학교 드 몽 튼의 캐나다 연구소에서 자금 지원을 하 고 싶습니다. EHC의 작품은 캐나다, 뇌 캐나다, NSERC, 캐나다 유방암 재단, 뉴 브 런 즈 윅 혁신 재단, 뉴브런즈윅 건강 연구 재단의 알 츠 하이 사회와 대학교 드 몽 튼에 의해 지원 됩니다.

1. 시 약 준비
<ol><li>해 부 및 조직의 permeabilization에 대 한 다음 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>보존 솔루션 준비: 2.77 m m 케이크2EGTA, 7.23 m K m2EGTA, 5.77 m m 나2ATP, 6.56 m m MgCl2, 황소자리, 20 mM 15 mM 나2phosphocreatine, 이미 20 m m, 0.5 m m dithiothreitol, 그리고 50mm K-MES, pH 7.1 (저장 될 수 있다 -20 ° C).</li>
		<li>사포닌 솔루션 준비: 보존 솔루션의 1 mL에 사포닌의 5 밀리 그램 (신선한 매일 준비).</li>
	</ol>
</li>
	<li>호흡의 측정에 대 한 다음 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>호흡 매체 준비: 120 m m KCl, 5mm KH2포4, 3 mM HEPES, 1mm EGTA, 1 mM MgCl2및 0.2 %BSA (w/v), pH 7.2.</li>
		<li>기판, uncoupler, 억제제를 준비 합니다. H2O, 모든 기질을 녹이 고 에탄올 (malonate는 H2O 희석)를 제외 하 고 절대에 억제제로 서 uncoupler FCCP 해산. 기판으로 malonate ( 재료의 표참조)의 대부분을 무력화. 프로토콜에 주어진 모든 농도 2 mL 챔버 내부 최종 농도.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 준비와 고해상도 Respirometer의 교정.
<ol><li>챔버, 모자, 그리고 세 번 70% 에탄올과 세 번 증류수 respirometer의 마 개를 세척.</li>
	<li>제로 산소 농도에서 보정: 피펫으로 실에서 호흡 매체의 2.3 mL 10 밀리 그램의 나트륨 dithionite 추가. 챔버의 최대 볼륨은 2 mL, 비록 2.3 mL 챔버를 닫을 때 아무 기포 마 개에서 유지 하기 위해 추가 됩니다. 챔버는 마 개를 닫고 결과 산소 소비 속도와 제로 산소 농도에서 전극 10-20 분 보정에 대 한 산소 농도 측정 합니다.</li>
	<li>Distillated 물 챔버를 세척 하 고 10 분, 절대 에탄올에 품 어 다음 증류수로 씻어.</li>
	<li>공기 채도에서 보정: 피펫으로 실에서 호흡 매체의 2.3 mL는 stoppers, stoppers, 위에 초과 중간 발음 넣은 다음 공백 요소와 stoppers 리프트. 초과 호흡 매체는 챔버를 닫은 후 공기 방울의 존재를 피하기 위해 실 (2 mL 전체 볼륨)에서 pipetted입니다.</li>
	<li>한 시간, 산소 농도 (블루 추적) 250 주위 안정 될 때까지 45 분에 대 한 산소 소비량을 모니터링 24 ° c.에 nM</li>
</ol>3. 파리와 조직 Permeabilization의 해 부
<ol><li>얼음에 모든 단계를 수행 되었는지 확인 합니다.</li>
	<li>6 남성 파리 같은 스트레인의 anaesthetize, 같은 나이 (야생-타입 w1118, 15 일 cornmeal 매체에 먹이) 파리의 해 부를 촉진 하기 위하여 얼음에 같은 다이어트에 제기.</li>
	<li>Using 메스와 뾰족한 집게, 비행 근육을 포함 하는 직업적인만 계속 (머리 및 인체 제거) 파리를 해 부. 이 단계는 육안으로 할 수 있습니다. 뾰족한 집게와 결과 직업적인 처리 합니다.</li>
	<li>25 mm 페 트리 접시는 집게를 사용 하 여 차가운 보존 솔루션의 2 개 mL를 포함 하는 3 개의 해 부 직업적인 전송.</li>
	<li>뾰족한 집게는 직업적인은 집게의 끝을 삽입 하 여 기계적으로 직업적인을 permeabilize와 반복적으로 찢 어 떨어져 느슨하게 연결 된 네트워크를 조직.</li>
	<li>24-잘 접시에 두 개의 우물을 12.5 µ L의 사포닌 솔루션 및 사포닌의 62.5 µ g/mL의 최종 농도를 보존 솔루션의 1 mL 채우십시오. 호흡 매체의 1 mL로 두 개의 인접 한 우물을 채우십시오.</li>
	<li>뾰족한 집게 3 permeabilized 직업적인 희석된 사포닌 솔루션에 전송 하 고는 궤도 셰이 커, 얼음에 20 분 동안에 온화한 동요와 함께 품 어.</li>
	<li>후자의 부 화 후 씻어 내는 사포닌을 5 분 동안 얼음에 약한 동요와 함께 호흡 중간으로 가득 인접 한 우물에 섬유를 전송 합니다.</li>
</ol>4입니다. 건조 중량의 결정
<ol><li>흡수 성 표면에 permeabilized 직업적인 건조 하 고 3-4 회 뾰족한 집게를 사용 하 여 모든 습기가 제거 되도록 플립.</li>
	<li>3 직업적인을는 중량에 무게. Note 획득된 무게 미토 콘 드 리아 산소 소비 속도 정상화 하는 데 사용할 것입니다.</li>
	<li>얼음에 조직 호흡 매체의 한 방울에 즉시 전송 합니다.</li>
</ol>5. 산소 소비 속도 결정
<ol><li>respirometer의 챔버를 열고 (제거는 stoppers) 각 챔버에 10 mM pyruvate의와 malate의 2 mM를 추가.</li>
	<li>Permeabilized 조직 호흡 매체와 채워진 챔버에 직접 추가 합니다.</li>
	<li>마 개는 스페이서를 사용 하 여 교체 합니다.</li>
	<li>60 mL 주사기는 산소 탱크에서 직접 산소를 수집 하 고 조직을 통해 산소 유포 산소 소비를 제한 하지 것입니다 있는지 확인 하려면 각 챔버의 스 토퍼 모 세관을 통해 산소의 2 ~ 5 mL를 주입 합니다.</li>
	<li>해밀턴 주사기를 직업적인 챔버에 남아 있는지 확인 하려면 각 스 토퍼의 모 세관에 넣습니다.</li>
	<li>산소 농도 약 400 때 챔버를 완전히 닫습니다 nM, 공기 채도 위에 산소 레벨 달성 (약 160% 공기 포화) 약 실 내부.</li>
	<li>중지 하 고 약 실에서 공기 방울에 대 한 확인을 교 반기.</li>
	<li>조직 질량 특정 산소 소비 pmol O2 consumed.s-1.mg-1 조직의 표시 질량 (mg), 조직의 호흡 속도 정상화 이전 무게의 질량을 입력 합니다.</li>
	<li>일단 산소 소비 (빨간색 추적) 안정화는, 5mm ADP 해밀턴 주사기를 추가 합니다.</li>
	<li>각 주입 후 증류수, 70% 에탄올으로 주사기를 헹 구 고 다시 증류수.</li>
	<li>산소 소비는 다시 안정, 일단 5 µ L 시 토 크롬 c의 4 m m의 주사.</li>
	<li>ETS의 다른 단계에서 미토 콘 드리 아 산소 소비를 평가 하기 위해 다음 기판의 순차 주사 하십시오.<ol>
<li>2 M 프롤린의 5 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>1 M 호박의 10 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>1 M 글리세롤-3-인산의 30 µ L를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.5-1의 단계에 의해 적정 방식에서 uncoupler FCCP 주입 최적 농도까지 µ M (1 m m 솔루션의 2 µ L)는에 도달, 즉, 금지 없이 가능한 높은 산소 소비를 달성 하기 위해 집중 (주의: 테이블 참조 재료의).</li>
	<li>전적으로 잔여 산소 소비 (ROX)을 측정 하기 위하여 ETS에 전자 플럭스를 억제 하기 위해 순차적으로 다음 억제제를 주입 다른 사람의 사이에서 oxygenase 반응 등 즉 비 호흡 반응:<ol>
<li>1 m m로 테 논의 1 µ L 추가 (주의: 재료의 표참조).</li>
		<li>5 µ L 2 M malonate의 추가 (주의: 재료의 표참조).</li>
		<li>5 mM antimycin A의 1 µ L 추가 (주의: 재료의 표참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>추가 하는데 0.2 m m와 0.5 m m TMPD 순차적으로 실로 복잡 한 4에 의해 산소 소비량을 측정 하는데부터 시작 합니다.</li>
	<li>추가 복잡 한 IV를 억제 하기 위해 나트륨 아 지 드의 20 mM (주의: 재료의 표참조).</li>
	<li>신호는 안정, 일단 챔버는 스페이서와 함께, 다시 순수한 산소의 2 개 mL를 주입 하 여 챔버 산소 개폐 실 때 농도 250-300 nmol.mL-1.</li>
	<li>10-15 분에 대 한 신호를 측정 하 고 계산 화학 배경, 즉, TMPD의 autoxidation 때문에 산소 소비.</li>
</ol>6. 청소는 Respirometer의
<ol><li>측정 후 증류수와 챔버를 한번 씻어 하 고 린스 70% 에탄올에 세 번 약 실.</li>
	<li>10 분에 억제제를 비활성화에 대 한 절대 에탄올에 품 어.</li>
	<li>증류수로 세 번 씻어, 약 실 70% 에탄올를 다음 사용률까지는 마 개 및 뚜껑 교체.</li>
</ol>

<ol>
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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+implications+of+mitochondrial+genetic+variation:+mitochondrial+genetic+effects+on+OXPHOS+respiration+and+mitochondrial+quantity+change+with+age+and+sex+in+fruit+flies.">Evolutionary implications of mitochondrial genetic variation: mitochondrial genetic effects on OXPHOS respiration and mitochondrial quantity change with age and sex in fruit flies.</a> Journal of Evolutionary Biology. 29 (4), 736-747 (2016).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle.">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).</li><li>Phang, J. M., Donald, S. P., Pandhare, J., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolism+of+proline,+a+stress+substrate,+modulates+carcinogenic+pathways.">The metabolism of proline, a stress substrate, modulates carcinogenic pathways.</a> Amino Acids. 35 (4), 681-690 (2008).</li><li>Bender, T., Martinou, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+pyruvate+carrier+in+health+and+disease:+To+carry+or+not+to+carry?.">The mitochondrial pyruvate carrier in health and disease: To carry or not to carry?.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (10), 2436-2442 (2016).</li><li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinediones+are+acute,+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier.">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).</li><li>McCommis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ancestral+role+for+the+mitochondrial+pyruvate+carrier+in+glucose-stimulated+insulin+secretion.">An ancestral role for the mitochondrial pyruvate carrier in glucose-stimulated insulin secretion.</a> Molecular Metabolism. 5 (8), 602-614 (2016).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 연구에서는 초파리에서 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 측정 전에 샘플 준비 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 기간 및 필요한 개인의 수의 점에서 특히 미토 콘 드리 아 격리를 사용 하 여 프로토콜에 관련 된 다른 문제를 극복 하기 위해 개발 되었다. 일반적으로 조직의 여러 개인에 게 서 얻은 큰 금액을 요구 하는 미토 콘 드 리아 격리 사용 대신,이 실험에서 몇 초파리의 직업적인 permeab...

과일 파리, 초파리 melanogaster 사용 되었습니다 모델 생물으로 서 유전자 연구에 대 한1세기 이상. 이 유 기체의 연구만 sex-linked 상속2, 돌연변이 속도3, 신경 시스템의 개발 및 세포 운명 결정4에 대 한 중요 한 기초 지식을 주도 하지 않은 하지만 또한 최근 등장으로 Alzheimer와 Parkinson의5,6등 여러 질병에 고유의 메커니즘을 연구를 유용한 도구입니다. 또한, 그들은 시간의 짧은 기간 동안 많은 수에서 올려질 수 있고 짧은 수명으로 노화 과정을 공부 하는 인기 있는 모델입니다. 그들은 또한 인간의 장기는 심장, oenocytes (hepatocyte 같은 셀), 지방 기관 (간 및 백색 지방 조직으로 유사 하 게 작동), 인슐린 생산 세포 (췌 장 β 세포에 해당), 동종 구조를가지고 뿐만 아니라 hemolymph 수송 대사 산물 (척추 동물의 혈액과 유사)7. 또한, 중앙 통로 중간 대사 (인슐린/인슐린 같은 성장 인자와 같은 신호 통로 및 대상의 Rapamycin-토르 경로 포함)의 높은 보존된7있습니다. 이러한 이유로 초파리 최근 당뇨병8등 인간의 신진 대사 질환에 병 적인 조건에서 특히 신진 대사를 제어 하는 기본 메커니즘을 설명 하기 위해 개발 되었습니다. 물질 대사의 주요 구성 요소는 mitochondrion 여러 경로 통합 하 고 생활의 가장 중요 한 생물 학적 기능 중 하나를 수행 하는 (OXPHOS) 산화 인 산화 과정을 통해 ATP 생산. 생물의 물질 대사에 있는 그들의 중추적인 역할을 고려 하면 그것은 놀라운 미토 콘 드 리아 장애 루 경화 증 뿐만 아니라 파 킨 슨 병9 , Alzheimer 질병10, 같은 많은 질병에 관련 된 11 , 12. 그들은 또한 노화 과정의 근본적인 결정 요인. 실제로, 그들은 산화 손상11높은 농도에서 세포에 해로운 수 셀 반응성 산소 종 (선생님)의 주요 생산자. 노화 또한 미토 콘 드리 아 속16의 손상 뿐만 아니라 손상 된 돌연변이 미토 콘 드리 아 DNA13, mitophagy 장애14,15 의 축적에 연결 되었습니다. 미토 콘 드리 아는 또한 세포의 항상성의 주요 결정 요인 그들은 풍부 또는 부족 macronutrients17,18의 여러 세포 기능을 조정 하려면 다른 기질을 이용할 수 있다.
실제로, 다른 영양소 (탄수화물, 지질 및 단백질) 다이어트에는 소화, 흡수와 세포에 수송. 그들은 다음, cytosol에 변화 그리고 파생된 기판 그들이 있는 줄이는 해당 하는 NADH와 FADH219를 생산 하는 미토 콘 드 리아 매트릭스로 이송 됩니다. 이러한 감소 등가물은 다음 전자 교통 시스템 (ETS)의 다른 효소 복합물에 의해 산화 된다. 이 단지는 복잡 한 같은 미토 콘 드리 아 내 막에 포함 된 복잡 한 제. 또한, 미토 콘 드리 아 글리세롤 3 인산 염 효소, 프롤린 효소 등 효소 다른 단지 ETS20,21에 전자의 항목에 대 한 대체 경로 나타냅니다. '대안'이 단지는 곤충, 특히 중요 한으로 종에 따라 그들은 적극적으로 참여할 수 호흡20,,2223,21증가 하. 전자 시스템을 먹이이 ETS에서 마지막 수락자 분자 산소까지는 ubiquinone 및 이후 복잡 한 iii, 그리고 복잡 한 4, 전송 됩니다. 이 전자 전송 안 미토 콘 드리 아 막 복잡 한 V (그림 1)에서 ATP를 ADP의 인 산화를 운전에 걸쳐 양성자 동기 힘을 생성 합니다. 세포의 항상성, 미토 콘 드리 아 대사 관련 모델 D. melanogaster 대표를 사용 하 여 공부에 미토 콘 드리 아의 역할의 다양 한 기본 메커니즘의 윤곽을 그리 다 수 있는 강력한 도구 pathophysiological 고려 조건 또는 셀룰러 및 환경 스트레스. 그러나 의외로, 소수의 연구만 실제로 측정 초파리24,,2526에서 미토 콘 드리 아 호흡. 실제로, 미토 콘 드 리아 산소 소비를 평가 하는 것을 목표로 실험 미토 콘 드리 아의 격리가 필요 합니다. 다른 미토 콘 드리 아 기능 (예: 선생님 생산 또는 미토 콘 드 리아 효율27,28의 표식으로 P/O 비율)의 측정에 대 한 유리, 이러한 격리는 일반적으로 오히려 다량 필요 조직의 여러 개인24,29에서. 조직과 개인의 높은 금액에 대 한이 요구는 중요 한 제한 요소, 특히 모든 개인이 같은 나이 이어야 한다 고려 하 고 가급적 실험에 대 한 동일한 성의 다른 시간에 호흡 측정을 만들기 최상의 힘 드는 포인트. 또한, 미토 콘 드 리아 격리 미토 콘 드리 아 대사를 경 세 하는 기본적인 기계 장치에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다, 하는 동안 미토 콘 드리 아를 격리 하는 데 사용 하는 방법 복제 하기 어려움 등 여러 단점을가지고 미토 콘 드리 아 네트워크, 그리고 미토 콘 드리 아 구조와 기능29,,3031의 변경의.
이 연구의 목적은 최소한의 양의 아주 몇몇 개인에서 조직만을 사용 하 여 초파리에 미토 콘 드리 아 산소 소비량을 측정 하는 강력한 프로토콜을 제시 하는 것입니다. 이 프로토콜의 미토 콘 드리 아 산소 소비에서 제자리에 고해상도 respirometry32,33, 와 함께에서 permeabilized 근육 섬유29 초파리 직업적인에서를 사용 하 여 측정 구성 34 , 35.이 메서드는 또한 추가적인 장점 때문에 셀의 다른 구성 요소와 상호 작용으로 잘으로 미토 콘 드리 아의 구조와 기능에 더 보존 permeabilized 고전적인 미토 콘 드 리아 격리 방법에 비해 섬유29,,3136,이 접근을 더 순수 관련 시키는. 이 프로토콜, 미토 콘 드 리아 기능 수 있습니다 정확 하 게 평가 초파리의 3 개의 직업적인 ETS의 몇 가지 다른 단계에서 산소 소비의 결심을 허용 하는 기판으로 고해상도 respirometry를 사용 하 여. 따라서,이 프로토콜은 초파리 모델을 활용 하 여 많은 환경 또는 병 태 생리 조건에서 대사를 제어 하는 기본 메커니즘에 대 한 주요 질문에 답변을 도울 수 있었다.
하는 ETS의 몇 가지 다른 단계에서 산소 소비량을 측정 하 고 어떻게 다른 기판 평가 호흡, 다른 기판 (그림 1), uncoupler을 그리고 억제제 사용된30 의 permeabilization 후에 조직입니다. 특히, 다른 기판의 순차적 추가 자극 하는 ETS의 다른 단지를 통해 전자의 항목을 수행 됩니다. uncoupler 생성 시안 화물 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), 비 결합 호흡을 측정 하기 위해 최적의 농도에 추가, 즉, phosphorylating 비 호흡 극대 산소 소비를 자극. I, II, 및 III 다음 비 ETS 산화 반응으로 인해 잔여 산소 소비를 모니터링을 수행 하는 단지의 순차적 임무 N, N, N의 주입에 의해 복잡 한 IV 최대한 호흡 능력을 평가 하는 마지막으로,', N-Tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD)는 인공 전자 업체, 그리고 하는데. 그것은 그것 이기 때문에 파리는 발생 하는 온도 실험 24 °C에서 실시 하는 것을 주의 하는 것이 중요.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>High-resolution respirometer Oxygraph O2K</td>
			<td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td>
			<td>10022-02</td>
			<td>Startup O2K respirometer kit 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K-Titration Set&#160;</td>
			<td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td>
			<td>20820-03</td>
			<td>Hamilton syringes with different volumes 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Datlab software</td>
			<td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td>
			<td>20700</td>
			<td>Software for data acquisition and analysis 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped antimagnetic forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-400</td>
			<td> 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secura225D-1S-DQE</td>
			<td>Sartorius AG, Goettingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Semi-micro balance (distributed by several companies)&#160; 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster wild-type w1118</td>
			<td>Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA</td>
			<td></td>
			<td> 
			Storage Condition: 24 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>EGTA 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767</td>
			<td>CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity. 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4830</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td> 
			Storage Condition: -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td> 
			Storage Condition: -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td> 
			Storage Condition: 2-8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin from quillaja bark</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7900</td>
			<td>Saponin 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05470</td>
			<td> 
			Storage Condition: 2-8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2S2O4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157953</td>
			<td>Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity. 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Pyruvate 
			Storage Condition: 2-8 &#176;C 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(-)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1000</td>
			<td>Malate 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-diphosphate monopotassium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5285</td>
			<td>ADP 
			Storage Condition: -20 &#176;C 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c from equine heart</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7752</td>
			<td>Cytochrome c 
			Storage Condition: -20 &#176;C 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td>Proline 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2378</td>
			<td>Succinate 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7886</td>
			<td>Glycerol-3-phosphate 
			Storage Condition: -20 &#176;C 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td>FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity. 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. 
			Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1296</td>
			<td>Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage. 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from Streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. 
			Storage Condition: -20 &#176;C 
			Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7394</td>
			<td>TMPD 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at&#160; -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4034</td>
			<td>Ascorbate 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at&#160; -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity.&#160; 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mitochondrial oxygen consumption in permeabilized fibers of drosophila using minimal amounts of tissue

과일 파리, 초파리 melanogaster, 물질 대사 연구에 대 한 새로운 모델을 나타냅니다. 실제로, 초파리 인간의 장기에 동종 구조, 높은 보존된 대사 경로가지고 있고 시간의 짧은 기간에 다른 근본적인 메커니즘의 연구를 수 있는 비교적 짧은 수명을. 그러나 그것은,, 그 세포 신진 대사, 미토 콘 드리 아 호흡에 필수적인 메커니즘 중 하나는 되어 철저 하 게 조사 하지이 모델에 놀라운. 초파리에서 미토 콘 드리 아 호흡의 측정 일반적으로 개인의 매우 많은 수를 요구 하 고 얻은 결과 매우 재현할 수 있기 때문에 가능성이 높습니다. 여기, 조직 초파리에서의 최소한의 금액을 사용 하 여 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 정확한 측정을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 직업적인 해 부 이며 모두 기계적으로 날카로운 집게와 화학적 사포닌, 교차 하는 세포 막, 미토 콘 드리 아 호흡을 조절 하는 다른 화합물을 수 있도록 permeabilized. Permeabilization, 후 프로토콜 여러 억제제에는 uncoupler에 그들의 응답에 뿐만 아니라 다른 기판 산화 전자 교통 시스템 (ETS)의 다른 단지의 용량을 평가 하기 위해 수행 됩니다. 이 메서드는 미토 콘 드리 아 아직 다른 세포질 구성 요소와 상호 작용 하기 때문에 미토 콘 드 리아 형태 보존 더 순수 관련으로 미토 콘 드 리아 격리를 사용 하 여 방법에 비해 많은 장점을 제공 합니다. 또한, 샘플 준비는 빠르게, 그리고 얻은 결과 매우 재현. 미토 콘 드리 아 호흡의 평가와 물질 대사 연구에 대 한 모델 초파리의 장점을 결합 하 여 새로운 통찰력 공개, 될 수 있는 중요 한 특히 때 파리 발생 하는 다른 환경 또는 병 태 생리 조건입니다.

위에 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 미토 콘 드리 아 산소 소비의 대표 추적 그림 2에 제공 됩니다. Pyruvate와 malate permeabilized 근육 섬유 함께 챔버에 주입 이라고 CI 누출 호흡, 즉, 복잡 한 ETS의은 의해 자극 하는 경우는 NADH 생산 pyruvate와 통해 malate의 산화는 tricarboxylic 산 주기 (CI)입니다. 이 호흡 속도 동안 미토 콘 드 리아 산소 주로 ATP synthase ?...

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Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

이 논문에서 초파리의 permeabilized 직업적인의 고해상도 respirometry를 사용 하 여 산소 소비량을 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 조직의 고전적인 미토 콘 드 리아 격리 기술에 비해 최소한의 금액을 요구 하 고 얻은 결과 더 순수 관련.

조직의 최소 금액을 사용 하 여 초파리의 Permeabilized 섬유에 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 측정

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

measurement-mitochondrial-oxygen-consumption-permeabilized-fibers

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JoVE Journal

Biochemistry

11.8K 조회수.  Université de Moncton. 이 논문에서 초파리의 permeabilized 직업적인의 고해상도 respirometry를 사용 하 여 산소 소비량을 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 조직의 고전적인 미토 콘 드 리아 격리 기술에 비해 최소한의 금액을 요구 하 고 얻은 결과 더 순수 관련.

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Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

연구

생화학

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include flavin-dependent respiratory complexes and dehydrogenases that produce a mixture of superoxide (O2&#9679;-) and hydrogen peroxide (H2O2). Accurate quantification of the ROS-producing potential of individual sites in isolated mitochondria can be challenging due to the presence of antioxidant defense systems&#160;and side reactions that also form O2&#9679;-/H2O2. Use&#160;of nonspecific inhibitors that can disrupt mitochondrial bioenergetics can also compromise measurements by altering&#160;ROS release from other sites of production. Here, we present an easy method for the simultaneous measurement of H2O2 release and nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) production by purified flavin-linked dehydrogenases. For our purposes here, we have used purified pyruvate dehydrogenase complex (PDHC) and &#945;-ketoglutarate dehydrogenase complex (KGDHC) of porcine heart origin as examples. This method allows for an accurate measure of native H2O2 release rates by individual sites of production by eliminating other potential sources of ROS and antioxidant systems. In addition, this method allows for a direct comparison of the relationship between H2O2 release and enzyme activity and the screening of the effectiveness and selectivity of inhibitors for ROS production. Overall, this approach can allow for the in-depth assessment of native rates of ROS release for individual enzymes prior to conducting more sophisticated experiments with isolated mitochondria or permeabilized muscle fiber.

Mitochondria contain several flavin-dependent enzymes that can produce reactive oxygen species (ROS). Monitoring ROS release from individual sites in mitochondria is challenging due to unwanted side reactions. We present an easy, inexpensive method for direct assessment of native rates for ROS release using purified flavoenzymes and microplate fluorometry.

초과/수소 과산화 수소와 NADH 생산 미토 콘 드리 아 Dehydrogenases 플 라빈을 포함 하 여 동시 측정

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ability to accurately measure the influx and efflux of Ca2+ from mitochondria is important for determining the role of mitochondrial Ca2+ handling in these processes. In this report, we present two methods for the measurement of mitochondrial Ca2+ handling in both isolated mitochondria and cultured cells. We first detail a plate reader-based platform for measuring mitochondrial Ca2+ uptake using the Ca2+ sensitive dye calcium green-5N. The plate reader-based format circumvents the need for specialized equipment, and the calcium green-5N dye is ideally suited for measuring Ca2+ from isolated tissue mitochondria. For our application, we describe the measurement of mitochondrial Ca2+ uptake in mitochondria isolated from mouse heart tissue; however, this procedure can be applied to measure mitochondrial Ca2+ uptake in mitochondria isolated from other tissues such as liver, skeletal muscle, and brain. Secondly, we describe a confocal microscopy-based assay for measurement of mitochondrial Ca2+ in permeabilized cells using the Ca2+ sensitive dye Rhod-2/AM and imaging using 2-dimensional laser-scanning microscopy. This permeabilization protocol eliminates cytosolic dye contamination, allowing for specific recording of changes in mitochondrial Ca2+. Moreover, laser-scanning microscopy allows for high frame rates to capture rapid changes in mitochondrial Ca2+ in response to various drugs or reagents applied in the external solution. This protocol can be applied to measure mitochondrial Ca2+ uptake in many cell types including primary cells such as cardiac myocytes and neurons, and immortalized cell lines.

Here, we present two protocols for the measurement of mitochondrial Ca2+ influx in isolated mitochondria and cultured cells. For isolated mitochondria, we detail a plate reader-based Ca2+ import assay using the Ca2+ sensitive dye calcium green-5N. For cultured cells, we describe a confocal microscopy method using the Ca2+ dye Rhod-2/AM.

고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 칼슘 유입의 분석

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert NADH and FADH into ATP. Since mitochondria are also the primary site for oxygen use and nutrient oxidation to carbon dioxide and water, how efficiently they use oxygen and produce ATP directly relates to the efficiency of nutrient metabolism, nutrient requirements of the animal, and health of the animal. The purpose of this method is to examine mitochondrial respiration, which can be used to examine the effects of different drugs, diets and environmental effects on mitochondrial metabolism. Results include oxygen consumption measured as proton dependent respiration (State 3) and proton leak dependent respiration (State 4). The ratio of State 3 / State 4 respiration is defined as respiratory control ratio (RCR) and can represent mitochondrial energetic efficiency. Mitochondrial proton leak is a process that allows dissipation of mitochondrial membrane potential (MMP) by uncoupling oxidative phosphorylation from ADP decreasing the efficiency of ATP synthesis. Oxygen and TRMP+ sensitive electrodes with mitochondrial substrates and electron transport chain inhibitors are used to measure State 3 and State 4 respiration, mitochondrial membrane PMF (or the potential to produce ATP) and proton leak. Limitations to this method are that liver tissue must be as fresh as possible and all biopsies and assays must be performed in less than 10 h. This limits the number of samples that can be collected and processed by a single person in a day to approximately 5. However, only 1 g of liver tissue is needed, so in large animals, such as dairy cattle, the amount of sample needed is small relative to liver size and there is little recovery time needed.

Here, we share methods for measuring mitochondrial oxygen consumption, a defining concept of nutritional energetics, and proton leak, the primary cause of inefficiency in mitochondrial generation of ATP. These results can account for 30% of the energy lost in nutrient utilization to help evaluate mitochondrial function.

홀스타인 젖소에서 미토 콘 드리 아 호흡 추정 간 미토 콘 드리 아 산소 소비와 양성자 누출 속도 론 측정

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the progression of cancer, diabetes, neurodegeneration, and aging to name a few. For instance, changes in mitochondrial activity, the cell&#39;s metabolic powerhouse, have been characterized in many such diseases. Generally, the oxygen consumption rates of mitochondria were considered a reliable readout of mitochondrial activity and measurements in some of these studies were based on isolated mitochondria or cells. However, such conditions may not represent the complexity of a whole tissue. Recently, we have developed a novel method that enables the dynamic measurement of oxygen consumption rates from whole isolated fly heads. By utilizing this method, we have recorded lower oxygen consumption rates of the whole head segment in young versus aged flies. Secondly, we have discovered that lysine deacetylase inhibitors rapidly alter the oxygen consumption in the whole head. Our novel technique may therefore aid in uncovering new properties of various drugs, which may impact metabolic rates. Furthermore, our method may give a better understanding of metabolic behavior in an experimental setup that more closely resembles physiological states.

Measuring alterations in metabolic rates is central to understanding the progression of various diseases and aging. Here, we present a novel technique to measure whole head oxygen consumption that more closely resembles the physiological state and may aid in revealing novel drugs that modify mitochondrial activity.

측정 및 해석의 전체 산소 소비 속도 비행 머리 세그먼트

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the interpretation of the biological activity of any compound in drug development or in basic research projects. In epigenetics, target engagement is most often assessed by the analysis of proxy markers instead of measuring the union of the compound to the target. Downstream biological readouts that have been analyzed include the histone mark modulation or gene expression changes. KDM1A is a lysine demethylase that removes methyl groups from mono- and dimethylated H3K4, a modification associated with the silencing of gene expression. Modulation of the proxy markers is dependent on the cell type and function of the genetic make-up of the cells investigated, which can make interpretation and cross-case comparison quite difficult. To circumvent these problems, a versatile protocol is presented to assess the dose effects and dynamics of the direct KDM1A target engagement. The assay described makes use of a KDM1A chemoprobe to capture and quantify uninhibited enzyme, can be broadly applied to cells or tissue samples without the need for genetic modification, has an excellent window of detection, and can be used both for basic research and analysis of clinical samples.

Here, we present a protocol to measure KDM1A target engagement in a human or animal cell, tissue or blood samples treated with KDM1A inhibitors. The protocol employs chemoprobe tagging of the free KDM1A enzyme and direct quantification of the target occupation using chemoprobe-based immunoassays and can be used in preclinical and clinical studies.

화학 프로브 기반 면역 분석제사용 KDM1A 표적 결합의 직접 측정

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective denaturation of proteins from RNA, 3) ribonuclease inactivation, and 4) removal of contamination from DNA, proteins, and carbohydrates. However, it is very laborious to maintain the integrity of RNA when there are high levels of RNase in the tissue. Spontaneous autolysis makes it very difficult to extract RNA from pancreatic tissue without damaging it. Thus, a practical RNA extraction method is needed to maintain the integrity of pancreatic tissues during the extraction process. An experimental and comparative study of existing protocols was carried out by obtaining 20-30 mg of rat pancreatic tissues in less than 2 minutes and extracting the RNA. The results were assessed by electrophoresis. The experiments were carried out three times for generalization of the results. Immersing pancreatic tissue in RNA stabilization reagent at -80 &#176;C for 24 h yielded high integrity RNA, when the RNA extraction reagent was used as the reagent. The results obtained were comparable to the results obtained from commercial kits with spin column bindings.

The purity and integrity of the isolated RNA is a vital step in RNA dependent assays. Here, we present a practical, rapid, and inexpensive method to extract RNA from a small quantity of undamaged pancreatic tissue.

쥐 췌장 조직의 신속하고 비용 효율적인 RNA 추출

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis proposed and tested was that a regular maternal exercise of a sow during pregnancy would increase the mitochondrial efficiency of offspring heart bioenergetics. This hypothesis was tested by isolating mitochondria using a mild-isolation procedure to assess mitochondrial ETC and supercomplex profiles. The procedure described here allowed for the processing of previously frozen archived heart tissues and eliminated the necessity of fresh mitochondria preparation for the assessment of mitochondrial ETC complexes, supercomplexes, and ETC complex activity profiles. This protocol describes the optimal ETC protein complex measurement in multiplexed antibody-based immunoblotting and super complex assessment using blue-native gel electrophoresis.

Preparation of mitochondria-enriched samples from previously frozen archived solid tissues allowed the investigators to perform both functional and analytical assessments of mitochondria in various experimental modalities. This study demonstrates how to prepare mitochondria-enriched preparations from frozen heart tissue and perform analytical assessments of mitochondria.

소우의 자손에서 이전에 냉동 된 심장 조직에서 미토콘드리아 전자 전송 복합체 측정 : 운동 유발 미토콘드리아 생물 에너지 변화를 평가하는 모델

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This enables quantifications of ultrastructural aspects such as volume fractions, surface area to volume ratios, morphometry, and physical contact sites of different subcellular structures. In the 1970s, a protocol for enhanced staining of glycogen in cells was developed and paved the way for a string of studies on the subcellular localization of glycogen and glycogen particle size using transmission electron microscopy. While most analyses interpret glycogen as if it is homogeneously distributed within the muscle fibers, providing only a single value (e.g., an average concentration), transmission electron microscopy has revealed that glycogen is stored as discrete glycogen particles located in distinct subcellular compartments. Here, the step-by-step protocol from tissue collection to the quantitative determination of the volume fraction and particle diameter of glycogen in the distinct subcellular compartments of individual skeletal muscle fibers is described. Considerations on how to 1) collect and stain tissue specimens, 2) perform image analyses and data handling, 3) evaluate the precision of estimates, 4) discriminate between muscle fiber types, and 5) methodological pitfalls and limitations are included.

A modified post-fixation procedure increases the contrast of glycogen particles in tissue. This paper provides a step-by-step protocol describing how to handle the tissue, conduct the imaging, and use stereological methods to obtain unbiased and quantitative data on fiber type-specific subcellular glycogen distribution in skeletal muscle.

투과 전자 현미경을 이용한 골격근섬유의 세포하 글리코겐 분포의 정량화

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Generation of Tissue Spheroids via a 3D Printed Stamp-Like Device

Advances in 3D cell culture have developed more physiologically relevant in vitro models, such as tissue spheroids. Cells cultivated as spheroids have more realistic biological responses that resemble the in vivo environment. Due to their advantages, tissue spheroids represent an emerging trend toward superior, more reliable, and more predictive study models with a broad range of biotechnological applicability. However, reproducible platforms that can achieve large-scale production of tissue spheroids have become an unmet need in fully exploring and boosting their potential. Herein, the large-scale production of homogeneous tissue spheroids is reported using a low-cost and time-effective methodology. A 3D printed stamp-like device is developed to generate up to 4,716 spheroids per 6-well plate. The device is fabricated by the stereolithography method using a photocurable resin. The final device is composed of cylindrical micropins, with a height of 1.3 mm and a width of 650 &#181;m. This approach allows the fast generation of homogeneous spheroids and co-cultured spheroids with uniform shape and size and &gt;95% cell viability. Moreover, the stamp-like device is tunable for different sizes of well plates and Petri dishes. It is easily sterilized and can be reused for long periods. The efficient large-scale production of homogeneous tissue spheroids is essential to leverage their translation for multiple areas of industry, such as tissue engineering, drug development, disease modeling, and on-demand personalized medicine.

<meta charset="utf8"></head><body>3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 통한 조직 스페로이드 생성

The present protocol describes a technique to produce tissue spheroids on a large scale cost-effectively using a 3D printed stamp-like device.

3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 통한 조직 스페로이드 생성

Advances in 3D cell culture have developed more physiologically relevant in vitro models, such as tissue spheroids. Cells cultivated as spheroids have ...