The author thanks Drs. Mingjian Lu and Morris Birnbaum for helpful advice and funding support from NIDDK (R21DK089391).

放射性標識代謝基質を含有するフライ食品の調製<ol><li> 2μCiの放射性標識された基質（D- -グルコース[6- 14 C] -グルコース、D- [1- 14 C]または[1- 14 C] -パルミチン酸、40 - - 60 mCiの/マイクロチューブでは、1を混ぜます総容量25μlと等しくなるように15μlのFD＆C第1の青色食用色素及びH 2 Oとのミリモル）。 注意：カーボン-14は、低エネルギーβ放射体であり、空気中の短距離を持っています。しかし、実験者によって、放射性標識分子または誤飲のこぼれを防止するために注意してください。食品のバイアルが簡単にひっくり返るフライ。放射性標識は、液体の形態（ステップ1.2）で、または未固化の食品（ステップ1.4）である場合は特に、転倒からそれらを防ぐことができますコンテナでそれらを収容するようにしてください。供給されているか、放射性標識された基質を供給してきたハエが、放射性標識CO 2の少量を吐き出すために開始されます。これらのハエは、ヒュームフードにアクリルボックスに保管し、KOH CAの小皿する必要がありますnはCO 2スクラバーとして使用するためのボックスで設定すること。 </li><li>ピペットで空のフライ食品のバイアルの底に放射性標識された基板と青色色素ミックスのすべて（高さ9.4センチ、幅2.2センチ）。 </li><li> （ - 食品10 mlを含む1つのバイアルのための高電力レベルで20秒15）食品が単に液化するまで加熱標準は、電子レンジで食品を飛びます。 </li><li>青色の均一性を監視することは、完全な混合を確実にするために、旋回迅速に放射性標識された基板/青色色素ミックスに975μlの溶融食品を追加します。 </li><li> 30分 - 食品を冷却し、20室温で完全に固化することができます。 </li></ol>大人のショウジョウバエに放射性標識代謝基質を餌2 <ol><li>大人が多孔性ポリエチレンアクリルベースに融合し、圧力調整器とCO 2タンクに接続からなるCO 2麻酔装置を使用して飛ぶ麻酔。 5L /分で麻酔装置に流入CO 2。 <ol><li>転送麻酔（ - 1バイアルあたり30ハエのn = 15）dは、放射性標識、青染め食品を含むバイアルに飛びます。キャップフォームストッパー付きバイアル、およびハエが目を覚ますまで水平に置きます。蓋付きのアクリル容器に移すバイアル（180センチメートルのx 180センチメートル×240センチの高さ）。 </li></ol></li><li> 2のための放射性標識された食品にハエを転送する前に24時間- -短期給餌のために、18のためのハエを飢えさせる。3時間の供給工程T彼飢餓ステップが重要です給餌ハエは確実に彼らに提示食品の新しいソースを食べていますので、 。 5にわたって長期的な給餌のために - 7日、ハエが飢餓状態にする必要はないが、実験者はハエが内に収納されているバイアル中の放射性標識された食品の水分含有量を監視し、バイアルに水を追加するために、針と注射器を使用する必要があります乾燥食品と。 </li><li>転送は、新しいバイアルにそれらを「タップ」することによって標識されていない食品に飛びます。 2の最初の追跡期間 - 4時間はハエが彼らのキューティクルから放射性標識された食物粒子をきれいにすることを可能にし、放射性標識の消化を可能にします腸内に残っ編食品。青色の腹部を探すためにハエの目視検査により、腸を通る食物の進行状況を監視します。 </li><li> 18 Cまたは遺伝30℃で96時間 - または周囲温度 - （呼吸に摂食状態対絶食状態の効果を測定するための標準的な食品または1％寒天上で24時間12）（12続いて、転送が異なる食品の種類に飛びます操作のために、例えば 、温度感受性GAL80（GAL80 TS）を使用して）。 注：このチェイス期間の長さは、実行される実験に応じて変化します。 例えばのために、30℃で96時間の追跡が順にGAL80 TSを用いた実験で必要になる場合があり、完全にGAL4依存導入遺伝子の発現を活性化します。 </li></ol> CO 2 -コレクション装置の調製<ol><li> 14 C-グルコースまたは14 C-パルミチン酸および股関節で標識されたハエが含まれています&quot;飛ぶポッド」、メッシュキャップチューブを構築するために材料を組み立てますトンは大気に開いたままになります。 25ミリメートル長、丸底チューブを残し、12ミリメートル×75ミリメートルのポリプロピレンチューブのトップ50ミリメートルをカット。 130μmのナイロンメッシュ35ミリメートル×35ミリメートルの正方形を準備します。また、テープディスペンサーに透明テープを得ます。 </li><li> CO 2 -collection装置のための材料を組み立てます。各ポッドを飛ぶために、20mlガラスシンチレーションバイアル、オフセンターホールを有するゴムトップストッパー、よくトップ栓に穴を通って挿入される中心、グレードGF / Bガラスマイクロファイバー濾紙（2.1センチメートル直径を組み立てます円、1μmの孔）。 GF / Bフィルター紙は、その高い湿潤強度、高負荷容量が使用されています。 </li><li>使用日に5％のKOHの新鮮を準備します。ただ、ステップ3.4前に、中央に円形のGF / Bフィルター紙を折ると置くだけでなく、それはゴム製のトップ栓の穴に通され、5％KOHの100μlで、それを飽和します。 図1を参照してください。 </li><li>標識されていない培地上でのインキュベーション（複数可）以下、Anesthetizeは、CO 2を飛びます。ブラシは、カットオフポリプロピレンチューブに飛ぶナイロンメッシュ付きキャップ、およびチューブにメッシュを接着する透明テープを使用しています。ハエが目を覚ますと、メッシュがしっかりチューブに貼付されている前にエスケープ回避するために、迅速に作業。ハエの等しい数は、特定の実験のためのポッドフライそれぞれに使用すべきです。 10 -フライポッドあたり20ハエはシンチレーション計数（下記ステップ4.1）による測定のために十分な放射性標識し-CO 2を生成します 。 </li><li> 20mlのガラスシンチレーションバイアルにフライポッドを転送します。キャップよくKOH飽和GF / B濾紙を含む中心保持ラバートップストッパー付きガラスバイアル。ガラスシンチレーションバイアルの唇の上にゴム製の上部ストッパーの広い上部を折ります。 図1を参照してください。 </li><li>セットガラス蓋付き、アクリル容器にハエを含有するバイアル、および時間（2〜12時間がうまく動作します）の様々な期間インキュベートします。 </li></ol>結果の4.分析<ol><li>に4 mlのシンチレーションカクテルを含む6 mLのプラスチックシンチレーションバイアルにインキュベーション、キャップを取るガラスバイアル、および転送KOH飽和GF / B濾紙の終わり。 </li><li>必要な場合は、凍結保存された基板の後の決意のために-80℃のドライアイスや店舗のフライポッドで飛びます。これらのサンプルは放射性であり、従って、記憶されなければならないことに注意してください。 </li><li>追加のシンチレーションバイアルを準備します。背景と0.1を含む2人に1として機能するように、未使用のGF / B濾紙を含む1 - CPM /μCiのを決定するために、0.5μCiの放射性標識された基質を。 </li><li>製造業者のプロトコルに従ってシンチレーションカウンターを用いて各サンプルのCPMを測定します。 </li><li>時間当たりフライ当たりピコモル14 CO 2 / CPMとピコモル14 CO 2を計算します。各サンプルのCPM値からバックグラウンドのcpmを引きます。きちんとした放射性標識された基板のデータから、バックグラウンド補正されたcpm /サンプルのμCiのがカウント計算します。 <ol><li>使用メーカー提供の比活性および放射性標識された基質の放射化学濃度（例えば、50μCiの/マイクロモルおよび0.1μCiの/μlで、それぞれ）ピコモル/ CPMを計算します。ピコモル14 CO 2 /サンプルに14 CO 2 /サンプルのcpmからバックグラウンド補正されたフライポッドデータを変換するために、この係数を使用します。その後、ハエの数とフライポッド内の時間の数で割ます。 </li></ol></li></ol>

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The author declares no competing financial interests.

このプロトコルは、大人のキイロショウジョウバエにおける特定の放射性標識された基質の酸化を測定する方法を説明します。この手法は、簡単な定量的、再現可能かつ高感度であり、そしてATP産生のために酸化される栄養素（単数または複数）を同定するために使用することができるので、総CO 2産生およびO 2消費量を測定する既存の方法を補完します。 ここに記載された方法を用いて特定の放射性標識基質の酸化から遊離したCO 2の測定は、総CO 2産生を測定する技術に相補的です。総CO 2生成（VのCO2）は代謝率の推定を可能にし、合計O 2消費（V O2）が既知である場合、代謝率を算出することができ、酸化のための燃料源は、呼吸交換比（Vに基づいて推定することができますCO2 / V O2 = RER）。いつ炭水化物は排他的な基板、RER = 1であるが、脂肪酸は、グルコースと脂質酸化の反応の化学量論により、排他的なソース、RER = 0.7であるとき。 ショウジョウバエ 14内の酸素消費量を測定するための装置の不存在下で、酸化性燃料源を特定することができません。しかし、標識により1放射性基質または他の微量で飛ぶと、放射性標識CO 2生産の速度を測定、1は、刺激の間に異なる時点で与えられた基板を酸化するハエの能力について、またはAの効果について結論を出すことができます燃料酸化に変異を与えられました。 このプロトコルにおける重要なステップの数があります。流出および研究領域の汚染を避けるために、放射性物質を使用する場合、最初に注意を払うべきです。ステップ2.1と3.4の間にハエを麻酔ときに、第2、実験者は長期のCO 2の影響を避けるために迅速に取り組むべきです代謝や行動に暴露。 20ハエのグループは、麻酔をかけ、新しいバイアルに、または20秒以下でフライポッドに移すことができます。食品バイアルに麻酔装置から転送された場合、バイアルは、食品の表面に立ち往生から麻酔をかけたハエを防ぐために、その側に載置されるべきです。ハエは、ステップ2.2のように、数日間にわたって放射性標識された食品を供給している場合、実験者はハエが脱水に敏感であるとして、食品が乾燥しないようにしてください。 摂食または絶食状態標識前に、標識の選択、ラベリング時間の長さ、フライポッド内の時間の長さ、および麻酔の方法は、この技術を使用している場合、トラブルシューティングおよび修正を施すことができるパラメータです。まず、短い標識期間にさらさハエ（2から3時間）は、事前に絶食期間に供されない限り、放射性標識食品のかなりの量を消費する可能性は低いです。ラベルcの第二に、選択一つは、代謝表現型について描画することが可能である結論に影響を与えます。 D-からの放射性標識CO 2生産[6- 14 C] -グルコースが酸化を反映しているのに対し、例えばD-から、放射性標識されたCO 2の生産[1- 14 C] -グルコースは、クエン酸サイクルまたはペントースリン酸シャントを介して酸化を反映することができますクエン酸サイクルを通じてのみ12,15,16。必須アミノ酸17,18のための放射性標識トレーサーとハエを供給してタンパク質に由来するアミノ酸の酸化を評価するための良い戦略でしょう。最後に、放射性標識されたグルコースとの長い標識期間はまた、トリグリセリド19と、このような容易にピルビン酸と相互変換するアラニンなどのアミノ酸などの分子の他のクラスにこの前駆体の取り込みの可能性を提起します。これは、分子6のこれらの異なるクラスに組み込まれた放射能を測定することによって評価することができます。確かに、ハエの独立したコホートは、ラジアンを供給することができます。同様にして基板をiolabeledし、次いで、例えば、条件6を保存し、摂食中のグリコーゲン及びトリグリセリドのままであり、絶食されたフライポッド実験または放射性標識の測定に使用しました。別の戦略は、放射性標識された食事の栄養素自体ではなく、これらの栄養素の貯蔵形態の酸化を明らかにする可能性がある短い標識期間を使用することです。第三に、ハエの二つのグループが最初に一定時間以上14 CO 2生産の同一速度が、非常に異なる速度を有し得ることも可能です。したがって、フライポッドに費やす飛行時間の量を変化させることは、表現型の変化を評価する際に変更するための重要なパラメータです。最後に、このプロトコルは、フライポッド装置にハエを入れ、CO 2麻酔の短期間の使用を呼び出します。 CO 2麻酔フライポッド実験の過程で代謝機能に影響を与える可能性があります。代替Approachは代謝率20に影響を与えない窒素麻酔を使用することです。 燃料の酸化および代謝率のような複雑なシステムを測定する任意の技術と同様に、ここで説明した方法には限界があります。まず、基板の異なる出発量の分析のCO 2回収段階に入るであろう、従って、放射性標識、食品の様々な量を消費することができ、異なるグループに飛んでいる可能性があります。これは、大きなサンプルサイズとし、一括ハエを供給することにより、実験を行うことにより、ある程度のために制御することができます。短い標識期間については、同様の青色の根性が放射性標識を消費しているだろうし、実験のチェース部に繰り越すことができて飛びます。ハエのグループ内に残っている放射性標識の量はまた、実験の終了時および摂食初期追跡期間の終了後にハエの別々のコホートにおいて測定することができます。間の第2、活動レベルフライポッド内のハエのグループが異なる場合があります。これは、実験的に決定し、データを解釈するときに考慮されなければなりません。第三に、この技術は、特定の食物栄養またはその栄養素の貯蔵形態（複数可）からのみの生産を合計CO 2産生を測定しません。このプロトコルはに代わるものではありませんが、代わりに、それは別の、追加情報を提供するため、VCO 2の測定に相補的です。 方法ここに記載されている対策は、特定の代謝基質の微量の酸化物である放射性標識されたCO 2を吐き出さ。グルコース、脂肪酸、またはアミノ酸 - - 使用されるラベルを変えることによって一つは、飢餓などの異なる生理的条件下で、異なる遺伝的背景の代謝に異なる基質の寄与を評価するために、ますます洗練された実験を設計することができます。この技術の将来のアプリケーションは、metabolisの測定を含みます開発の幼虫と蛹の段階、それぞれの栄養貯蔵及び故障、極端なことを特徴とするショウジョウバエのライフサイクルの2段階でメートル。

モデル生物キイロショウジョウバエでの作業は、遺伝的原則、発生過程、成長、老化、行動、免疫およびヒト疾患1,2の理解に大きく貢献しています。 ショウジョウバエの遺伝的および細胞生物学的ア ​​プローチの無数のは、これらの分野での進歩を牽引してきました。しかし、ショウジョウバエにおける代謝の研究は、このような小動物で代謝パラメーターを測定することの困難に大部分起因し、よりゆっくりと開発しました。糖尿病などのヒト疾患を研究するための成長と様々な病理への代謝の貢献を理解するためのモデルとしてショウジョウバエを用いての関心は、この生物3,4のための代謝技術を開発し、適応するためのフィールドをプッシュしています。 信頼性の高い方法は、今ショウジョウバエにおける代謝パラメータの数を測定するために利用可能です。例えば、食物摂取量を評価することは簡単です<s&gt; 5まで、保存されたトリグリセリドおよびグリコーゲン、ならびにグルコースの循環血リンパレベルとグルコース4の2分子からなる二糖であるフライ、トレハロース、中の主要な循環砂糖のレベル。代謝トレーサーの使用は、このようなストレージ・フォームグリコーゲンやトリグリセリド6にグルコースなどの食事と吸収された栄養素の変換からの栄養吸収の研究を可能にしました。代謝率は、果実において評価することができる酸素消費7,8及び二酸化炭素（CO 2）産生の測定を飛びます。クエン酸サイクルは、食事および格納された炭水化物及び脂肪酸の代謝に由来するアセチル補酵素A（COA）としてサイクルに入ることができる2つの炭素単位を酸化します。サイクルの各ターンは、一分子GTP（またはATP）の各々と電子供与体FADH 2、NADHの3分子、及び廃棄物CO 2の二つの分子を生成します。 CO 2産生することができます基礎代謝率を推定するために使用することができます。総CO 2生成は、市販又は手製呼吸計9-10,11の使用により、ショウジョウバエで定量化することができます。 特にO 2消費の測定に結合された総CO 2産生の測定は、全身のエネルギー代謝に貴重な洞察を提供します。しかし、この尺度は、アデノシン三リン酸（ATP）の生産のために酸化される栄養素を特定するものではありません。炭水化物、脂肪酸、およびタンパク質：栄養素の三つの主要なクラスは、アセチルCoAへの変換以下のクエン酸サイクルに入ることができます。食事グルコースまたは保存されたグリコーゲン由来のグルコース-6-リン酸は、アセチルCoAを形成するピルビン酸デヒドロゲナーゼによって脱炭酸されてピルビン酸に変換することができます。その後、クエン酸サイクルに入るアセチルCoAのβ-酸化利回りによって食事から、または保存されたトリグリセリドから誘導される脂肪酸の​​内訳。最後に、アミノ酸の大部分は、例えばα-ケトグルタル酸などのCoAまたはクエン酸サイクル中間体アセチル、ピルビン酸への変換以下のクエン酸サイクルに入ることができます。 基礎および刺激条件時のエネルギー代謝に栄養固有の貢献は、放射性トレーサーの使用を介して監視することができます。ここに提示プロトコルは、培養12,13で増殖させた細胞における酸化を評価するために使用されるプロトコルからショウジョウバエにおける使用のために適合されています。このアプローチでは、ショウジョウバエは、標識されていない食品に追わ（時間）または長い（日）短パルスのための食事中の14 C放射標識代謝基質（炭水化物、脂肪酸、またはアミノ酸）、供給され、その後にさらさチャンバ重炭酸塩としての呼気CO 2を捕捉するための水酸化カリウム（KOH） -飽和濾紙を含みます。放射性標識重炭酸塩は、シンチレーション計数によって定量することができます。実験の間、放射性標識-CO 2産生の違いハエのAl基は、例えば、遺伝子型との間の燃料代謝の長期高速または内因性の違いにわたってATP産生のための異なる燃料の使用を反映することができます。

<table><tbody><tr><td>PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 &amp;micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC075H050UC</td><td></td></tr><tr><td>GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50 &amp;micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC045X050UC</td><td></td></tr><tr><td>Glucose, D-[1-14C]-, 50&amp;micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC043X050UC</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116</td><td></td></tr><tr><td>Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12 x 75 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959AA</td><td></td></tr><tr><td>Mesh, nitex nylon, 120 &amp;micro;m</td><td>Genesee Scientific</td><td>57-102</td><td></td></tr><tr><td>20 ml borosilicate glass scintillation vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-15</td><td></td></tr><tr><td>Flask top stopper with off-center hole</td><td>Fisher Scientific</td><td>K882310-0000</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene center well</td><td>Fisher Scientific</td><td>K882320-0000</td><td></td></tr><tr><td>Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-874-20</td><td></td></tr><tr><td>Ecoscint A</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-273</td><td></td></tr><tr><td>6 ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps</td><td>National Diagnostics</td><td>SVC-06</td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of carbon dioxide production from radiolabeled substrates in drosophila melanogaster

ショウジョウバエ遺伝学の力はますますホルモンシグナル伝達および代謝の質問およびこの生物においてヒト疾患のモデルの開発に適用されています。このような代謝率などのパラメータの測定のための感度の高い方法は、ショウジョウバエなどの小動物に生理学や病気の理解を駆動するために必要とされています。ここで説明する方法は、グルコースまたは脂肪酸のような14 C標識基質の微量を含有する食品を給餌成体ハエの少数の燃料酸化を評価します。給餌期間及び追加の実験操作後、ハエは、放射性標識CO 2が炭酸水素カリウムのような放射性標識基質の酸化から生成された場合、トラップは呼気KOH飽和濾紙を含むガラスバイアルに配置されたメッシュでキャップ短いチューブに転送されますKHCO 3。この放射性標識された重炭酸塩をシンチレーション計数によって測定されます。これは水溶液であり、燃料酸化の研究のため、uantitative再現性、および簡単な方法。放射性標識グルコース、脂肪酸、またはアミノ酸の使用は、摂食および絶食等の異なる遺伝的背景における異なる条件下でのエネルギー代謝にこれらの異なる燃料源の寄与の決意を可能にします。これは、 生体内エネルギー代謝に測定するために使用される他のアプローチを補完し、代謝調節をさらに理解すべきです。

放射性基質の代謝から生成される呼気および捕捉された放射性標識されたCO 2の量は、フライポッド内のハエの数だけでなく、動物はCO 2回収装置で過ごす時間の量と相関するはずです。これをテストするには、18時間絶食させたハエは2時間の放射性標識パルミチン酸（0.02μCiの/μlの食べ物）を与えた後、3または6時間のインキュベーションのために12または25匹の動物の群における放射性標識されたCO 2産生について試験しました。 25ハエによって生成したCO 2の量は12ハエによって生成ほぼ倍の量があって、各グループの量は、インキュベーション時間は、6時間（ 図2A）に3時間から増加したときに倍増しました。ピコモル14 CO 2 /フライ/ hrでは、各グループでほぼ同等でした。 断食がSS Oによって脂肪酸の分解を刺激しますxidation;したがって、脂肪酸の酸化からのCO 2の生産は、供給された動物と比較して絶食動物において上昇する必要があります。これが事実であったかどうかを判断するには、18-hrがハエは2時間、放射性標識パルミチン酸を供給した絶食しました。この短い給電パルス以下、ハエは2つのグループに分けた後、3時間の未標識のフライ食品または1％寒天に移し、次いで、2時間ポッドを飛ぶに移しました。二つの別々の実験では、ハエがß酸化は絶食動物で増加したことを示す、食品（図2B）に追わハエと比較して有意に多くの放射性標識産寒天CO 2に追わ。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig1.jpg" /> 図1. 呼気採取するための装置であって、放射性標識CO 2。 ある放射性標識された代謝基質を消費しているハエ「フライポッド」（FP）、メッシュ（M）でキャップされたカットオフ遠心管に入れました。フライポッドは、100μlの飽和GF / B濾紙を含有する中心ウェル（CW）に配置され、それを通して偏心孔を含むゴム上部ストッパ（S）で20mlガラスシンチレーションバイアルに入れ、蓋をされています5％KOH。吐き出されたCO 2は、KOHと反応し、重炭酸塩などの濾紙上に捕捉されます。追い込まれた、放射性標識されたCO 2は飽和濾紙のシンチレーション計数によって定量することができる。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54045/54045fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig2.jpg" /> 図2. 14 CO 2 生産時間と相関し、ハエの数連邦および絶食条件にフライポッドと応答します。 （A）ハエ2で製造供給された放射性標識したパルミチン酸は、試験したハエの数（N = 12（オープンバー）または25（クローズドバー））とフライポッド（3または6時間に費やされる時間と相関する14 COの量）。あたりオンザフライ基づき、ハエは0.99、1.13、1.10および1.01ピコモル14 CO 2 /時間（グラフデータとして右の順に同じ左に記載されているデータ）を生成しました。 （B）食品に追われたハエよりも、パルミチン酸より放射性標識された酸化寒天上で追跡したハエ。データは、2つの実験からであり、標準偏差として報告され、N = 16から17ハエ/グループ（実験1）。 N = 10ハエ/グループ（実験2）。 * P = 0.017、スチューデントのt検定。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54045/54045fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

放射性標識基質からの二酸化炭素生成での測定<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...

measurement-carbon-dioxide-production-from-radiolabeled-substrates

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

9.1K ビュー.  University of Virginia. This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

ビデオ: Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

キイロショウジョウバエの幼虫中枢神経系の解剖

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

生物学

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human organs, possess highly conserved metabolic pathways and have a relatively short lifespan that allows the study of different fundamental mechanisms in a short period of time. It is, however, surprising that one of the mechanisms essential for cellular metabolism, the mitochondrial respiration, has not been thoroughly investigated in this model. It is likely because the measure of the mitochondrial respiration in Drosophila usually requires a very large number of individuals and the results obtained are not highly reproducible. Here, a method allowing the precise measurement of mitochondrial oxygen consumption using minimal amounts of tissue from Drosophila is described. In this method, the thoraxes are dissected and permeabilized both mechanically with sharp forceps and chemically with saponin, allowing different compounds to cross the cell membrane and modulate the mitochondrial respiration. After permeabilization, a protocol is performed to evaluate the capacity of the different complexes of the electron transport system (ETS) to oxidize different substrates, as well as their response to an uncoupler and to several inhibitors. This method presents many advantages compared to methods using mitochondrial isolations, as it is more physiologically relevant because the mitochondria are still interacting with the other cellular components and the mitochondrial morphology is conserved. Moreover, sample preparations are faster, and the results obtained are highly reproducible. By combining the advantages of Drosophila as a model for the study of metabolism with the evaluation of mitochondrial respiration, important new insights can be unveiled, especially when the flies are experiencing different environmental or pathophysiological conditions.

In this paper, a method to measure oxygen consumption using high-resolution respirometry in permeabilized thoraxes of Drosophila is described. This technique requires a minimal amount of tissue compared to the classic mitochondrial isolation technique and the results obtained are more physiologically relevant.

ショウジョウバエのティッシュの最小限の量を使用してのグリセリンの繊維でミトコンドリアの酸素消費量の測定

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

生化学

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

アダルトキイロショウジョウバエのロコモーションの高解像度のビデオトラッキング

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

幼虫のモニタリングの心機能キイロショウジョウバエ生理学的研究のための

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

大人からOenocytesの解剖キイロショウジョウバエ</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

の分離キイロショウジョウバエ精巣

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

キイロショウジョウバエ幼虫と大人の脳の代謝解析

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

神経科学

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

代謝率の測定に<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;呼吸計測を使用した

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

ショウジョウバエの微小呼吸器測定法の適応 - CASK変異体代謝への洞察

Measuring O2 Consumption in Drosophila melanogaster Using Coulometric Microrespirometry

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable environment. A coulometric microrespirometer consists of an airtight chamber in which O2 is consumed and the CO2 produced by the organism is removed by an absorbent medium. The resulting pressure decrease triggers electrolytic O2 production, and the amount of O2 produced is measured by recording the amount of charge used to generate it. In the present study, the method has been adapted to Drosophila melanogaster tested in small groups, with the sensitivity of the apparatus and the environmental conditions optimized for high stability. The amount of O2 consumed by wildtype flies in this apparatus is consistent with that measured by previous studies. Mass-specific O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and known to be less active, was not different from congenic controls. However, the small size of CASK mutants resulted in a significant reduction in O2 consumption on a per-fly basis. Therefore, the microrespirometer is capable of measuring O2 consumption in D. melanogaster, can distinguish modest differences between genotypes, and adds a versatile tool for measuring metabolic rates.

著者スポットライト:ショウジョウバエのメラノガスターと砂漠に適応したカブトムシに対する温度の影響 

Coulometric respirometry is ideal for measuring the metabolic rate of small organisms. When adapted for Drosophila melanogaster in the present study, measured O2 consumption was within the range reported for wildtype D. melanogaster by previous studies. Per-fly O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and less active, was significantly lower than the wildtype.

電量マイクロレスピロメトリーを用いたショウジョウバエのメラノガスターにおけるO2消費量の測定

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable ...

放射性標識基質からの二酸化炭素生成での測定

要約

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