The author thanks Drs. Mingjian Lu and Morris Birnbaum for helpful advice and funding support from NIDDK (R21DK089391).

1. Preparazione di Fly alimentari contenenti radioattivo metaboliche Substrati <ol><li> In una provetta per microcentrifuga, mescolare 1 - 2 pCi substrato radioattivo (D- [6- 14 C]-glucosio, D [1- 14 C]-glucosio o acido -palmitic [1- 14 C], 40 - 60 mCi / mmol) con 15 microlitri FD &amp; C No. 1 blu colorante alimentare e H 2 O di eguagliare un volume totale di 25 microlitri. ATTENZIONE: Carbonio-14 è un beta emettitore a bassa energia ed ha un breve intervallo in aria. Tuttavia, fare attenzione per evitare fuoriuscita di molecole radioattivi o ingestione accidentale dallo sperimentatore. Vola fiale alimentari ribaltano facilmente; essere sicuri di ospitarli in un contenitore che li impediscono di ribaltamento, soprattutto quando radiomarcato è in forma liquida (punto 1.2) o in alimenti solidificata (passo 1,4). Le mosche che vengono alimentati o sono stati alimentati substrati radioattivi inizierà a espirare piccole quantità di CO 2 radioattivo. Queste mosche devono essere conservati in scatole acriliche in cappe di aspirazione, e un piccolo piatto di KOH can essere impostato nella casella per uso come scrubber CO 2. </li><li> Pipettare tutto il substrato radiomarcato e miscela colorante blu sul fondo di una fiala cibo mosca vuoto (altezza: 9.4 cm, larghezza: 2,2 cm). </li><li> standard di calore volare cibo in un forno a microonde fino a quando il cibo è solo liquefatto (15 - 20 secondi a livello di potenza alto per un flaconcino contenente 10 ml di cibo). </li><li> Aggiungere alimentare 975 ml fuso al substrato radiomarcato / blu mix colorante e rapidamente turbinare, il monitoraggio uniformità del colore blu, per garantire la completa miscelazione. </li><li> Lasciare cibo per raffreddare e solidificare completamente a temperatura ambiente per 20 - 30 min. </li></ol> 2. alimentazione Substrati marcata radioattivamente metabolico per mosche adulte di frutta <ol><li> Anestetizzare mosche adulte utilizzando un&#39;apparecchiatura anestetizzante CO 2 composto da polietilene porosa fusa a base acrilica e collegato ad un serbatoio di CO 2 con un regolatore di pressione. Flusso di CO 2 nell&#39;apparecchio anestetizzante a 5 l / min. <ol><li> Trasferimento anestetizzared vola a flaconi contenenti radioattivi, alimentare blu-tinto (n = 15 - 30 mosche per flaconcino). fiale Cap con un tappo di gomma piuma, e riposare orizzontalmente fino mosche svegliano. fiale trasferirla in un contenitore con coperchio in acrilico (180 cm x 180 cm x 240 cm di altezza). </li></ol></li><li> Per l&#39;alimentazione a breve termine, di fame mosche per 18 - 24 ore prima di trasferire le mosche al cibo radioattivo per un 2 -. Step di alimentazione 3 ore T ha fame passaggio è importante perché le mosche Fed non mangiano in modo affidabile una nuova fonte di cibo presentato a loro . Per l&#39;alimentazione a lungo termine nel corso di 5 - 7 giorni mosche non devono essere fame, ma lo sperimentatore devono monitorare il contenuto di acqua del cibo radiomarcato nei flaconcini mosche sono alloggiati e utilizzare un ago e siringa per aggiungere acqua per fiale con cibo secco. </li><li> Trasferimento vola al cibo senza etichetta &quot;battere&quot; loro in un nuovo flacone. Un periodo di caccia iniziale di 2 - 4 ore permette mosche per pulire le particelle di cibo radioattivi dalle loro cuticole e permette la digestione di radiomarcatocibo ed restante nell&#39;intestino. Monitorare i progressi del cibo attraverso l&#39;intestino mediante ispezione visiva delle mosche per cercare addome blu. </li><li> Successivamente, il trasferimento vola a diversi tipi di alimenti (12 - 24 ore sul cibo standard o 1% agar per la misurazione degli effetti di nutriti rispetto digiuno sulla respirazione) o temperatura ambiente (12-96 ore a 18 C o C per 30 genetica manipolazioni utilizzando GAL80 sensibile alla temperatura (GAL80 ts), per esempio). Nota: La durata di questo periodo di chase varierà con l&#39;essere eseguito l&#39;esperimento. Per esempio, può essere necessario un inseguimento a 96 ore a 30 C in esperimenti usando GAL80 ts al fine di attivare completamente l&#39;espressione del transgene GAL4-dipendente. </li></ol> 3. Preparazione della CO 2 -Collection Apparatus <ol><li> Assemblare materiali per la costruzione di &quot;volare baccelli&quot;, tubi di maglia-capped che conterranno le mosche etichettati con acido e tha C-palmitico 14 C-glucosio o 14t rimarrà aperto all&#39;atmosfera. Tagliare la parte superiore di 50 mm da 12 mm tubi di polipropilene x 75 mm, lasciando, tubi tondi fondo 25 mm a lungo. Preparare 35 mm x 35 mm piazze di 130 micron rete di nylon. Inoltre, ottenere nastro trasparente in un erogatore del nastro. </li><li> Assemblare materiali per i CO 2 apparati -Collection. Per ogni pod volano, montare un flaconcino da 20 ml di vetro scintillazione, un tappo superiore in gomma con foro eccentrico, un centro ben essere inserito attraverso il foro nel tappo superiore, grado GF / carta da filtro in microfibra di vetro B (diametro 2,1 centimetri cerchio, 1 pori micron). carta da filtro GF / B viene utilizzato per la sua elevata resistenza a umido e capacità di carico. </li><li> Preparare 5% KOH fresco il giorno di utilizzo. Appena prima del punto 3.4, piegare e posizionare la carta circolare filtro GF / B verso il centro e che è filettata attraverso il foro del tappo di gomma superiore e saturare con 100 ml di 5% KOH. Fare riferimento alla Figura 1. </li><li> Dopo l&#39;incubazione (s) su supporti senza etichetta, unanesthetize vola con CO 2. Spazzola vola nel tubo di taglio in polipropilene, tappo con rete di nylon, e utilizzare il nastro trasparente per aderire mesh tubo. Lavorare velocemente per evitare di mosche risveglio e fuggire prima che la rete è stata apposta in modo sicuro al tubo. Un numero uguale di linea dovrebbe essere usato in ogni pod fly per un particolare esperimento; 10 - 20 mosche per volare pod producono sufficiente radiomarcato-CO 2 per la misura dal conteggio per scintillazione (passo 4.1 sotto). </li><li> Trasferire il pod volo per un 20 ml in vetro scintillazione flaconcino. Tappare la fiala di vetro con il tappo superiore di gomma in possesso di un centro ben contenente carta da filtro GF / B KOH-saturo. Piegare la larghezza superiore del tappo superiore in gomma sul bordo della fiala di vetro scintillazione. Fare riferimento alla Figura 1. </li><li> fiale di vetro set contenente le mosche in un coperchio, il contenitore acrilico, e incubare per periodi di tempo variabili (da 2 a 12 ore funziona bene). </li></ol> 4. Analisi dei risultati <ol><li> AAlla fine dell&#39;incubazione, fiale di vetro Uncap e carta da filtro GF / B KOH satura trasferimento ad una plastica fiala di scintillazione 6 ml contenente 4 ml di scintillazione cocktail. </li><li> Se necessario, bloccare mosche in baccelli volare sul ghiaccio secco e conservare a -80 ° C per la determinazione successiva di substrati memorizzati. Si noti che questi campioni sono radioattivi e devono essere memorizzati conseguenza. </li><li> Preparare ulteriori fiale di scintillazione: uno contenente carta da filtro / B GF non utilizzati per servire come sfondo e uno a due altri contenenti 0,1 - 0,5 pCi substrato radioattivo per determinare cpm / uCi. </li><li> Misurare CPM per ogni campione utilizzando un contatore a scintillazione secondo il protocollo del produttore. </li><li> Calcolare pmol 14 CO 2 / cpm e 14 pmol di CO 2 per volare all&#39;ora. Sottrarre il CPM di fondo dal valore CPM per ogni campione. Dai dati substrato radioattivi pulito, calcolare il cpm / pCi di campione di fondo corretta contato. <ol><li> Usa ilfornito dal produttore attività specifica e concentrazione radiochimica del substrato radiomarcata (per esempio, 50 pCi / mol e 0,1 pCi / ml, rispettivamente) per calcolare pmol / cpm. Utilizzare questo fattore per convertire i dati fly pod sfondo con correzione da cpm 14 CO 2 / campione pmol 14 CO 2 / campione. Poi dividere per il numero di mosche e il numero di ore nel contenitore mosca. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruit+flies+in+biomedical+research.">Fruit flies in biomedical research.</a> Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+the+golden+bug,+emerges+as+a+tool+for+human+genetics.">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat Rev Genet. 6 (1), 9-23 (2005).</li><li>Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metabolic+homeostasis+and+nutrient+sensing+in+Drosophila:+implications+for+aging+and+metabolic+diseases.">Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases.</a> Dis Model Mech. 7 (3), 343-350 (2014).</li><li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila.">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li><li>Deshpande, S. A., Carvalho, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Drosophila+food+intake:+comparative+analysis+of+current+methodology.">Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology.</a> Nat methods. 11 (5), 535-540 (2014).</li><li>Bland, M. L., Lee, R. J., Magallanes, J. M., Foskett, J. K., Birnbaum, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+supports+growth+in+Drosophila+by+regulating+muscle+activity+and+nutrient+uptake+in+the+gut.">AMPK supports growth in Drosophila by regulating muscle activity and nutrient uptake in the gut.</a> Dev biol. 344 (1), 293-303 (2010).</li><li>Hulbert, A. J., Clancy, D. J., Mair, W., Braeckman, B. P., Gems, D., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+rate+is+not+reduced+by+dietary-restriction+or+by+lowered+insulin/IGF-1+signalling+and+is+not+correlated+with+individual+lifespan+in+Drosophila+melanogaster.">Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster.</a> Exp Geront. 39 (8), 1137-1143 (2004).</li><li>Van Voorhies, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+function+in+Drosophila+melanogaster+in+response+to+hypoxia+and+pure+oxygen.">Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen.</a> J. Exp. Biol. 212 (19), 3132-3141 (2009).</li><li>Montooth, K. L., Marden, J. H., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+determinants+of+variation+in+energy+metabolism,+respiration+and+flight+in+Drosophila.">Mapping determinants of variation in energy metabolism, respiration and flight in Drosophila.</a> Genetics. 165 (2), 623-635 (2003).</li><li>Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+metabolic+rate+in+Drosophila+using+respirometry.">Measurement of metabolic rate in Drosophila using respirometry.</a> JoVE. (88), e51681 (2014).</li><li>Icreverzi, A., de la Cruz, A. F., Van Voorhies, W. A., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+cyclin+D/Cdk4+regulates+mitochondrial+biogenesis+and+aging+and+sensitizes+animals+to+hypoxic+stress.">Drosophila cyclin D/Cdk4 regulates mitochondrial biogenesis and aging and sensitizes animals to hypoxic stress.</a> Cell cycle. 11 (3), 554-568 (2012).</li><li>Tuttle, S., Muschel, R., Bernhard, E., McKenna, W. G., Biaglow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+ability+of+cells+overexpressing+MYC+proteins+to+reduce+peroxide+and+hydroperoxides.">Decreased ability of cells overexpressing MYC proteins to reduce peroxide and hydroperoxides.</a> Br J Cancer. 27, 140-144 (1996).</li><li>Ontko, J. A., Jackson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+rate+of+oxidation+of+fatty+acids+in+animal+tissues.+Effect+of+substrate+concentration,+pH,+and+coenzyme+a+in+rat+liver+preparations.">Factors affecting the rate of oxidation of fatty acids in animal tissues. Effect of substrate concentration, pH, and coenzyme a in rat liver preparations.</a> J Biol Chem. 239, 3674-3682 (1964).</li><li>Vincent, A., Briggs, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=parkin-induced+defects+in+neurophysiology+and+locomotion+are+generated+by+metabolic+dysfunction+and+not+oxidative+stress.">parkin-induced defects in neurophysiology and locomotion are generated by metabolic dysfunction and not oxidative stress.</a> Hum Mol Gen. 21 (8), 1760-1769 (2012).</li><li>Katz, J., Abraham, S., Hill, R., Chaikoff, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+occurrence+and+mechanism+of+the+hexose+monophosphate+shunt+in+rat+liver+slices.">The occurrence and mechanism of the hexose monophosphate shunt in rat liver slices.</a> J Biol Chem. 214 (2), 853-868 (1955).</li><li>Katz, J., Wood, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+glucose-C14+for+the+evaluation+of+the+pathways+of+glucose+metabolism.">The use of glucose-C14 for the evaluation of the pathways of glucose metabolism.</a> J Biol Chem. 235 (8), 2165-2177 (1960).</li><li>Piper, M. D. W., Blanc, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+holidic+medium+for+Drosophila+melanogaster.">A holidic medium for Drosophila melanogaster.</a> Nat methods. 11 (1), 100-105 (2014).</li><li>Sang, J. H., King, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+Requirements+of+Axenically+Cultured+Drosophila+Melanogaster+Adults.">Nutritional Requirements of Axenically Cultured Drosophila Melanogaster Adults.</a> J Exp Biol. , (1961).</li><li>Chernick, S. S., Chaikoff, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+and+hepatic+utilization+of+glucose+for+lipogenesis.">Insulin and hepatic utilization of glucose for lipogenesis.</a> J Biol Chem. 186 (2), 535-542 (1950).</li><li>Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+"rate+of+living"+model:+further+evidence+that+longevity+and+metabolic+rate+are+not+inversely+correlated+in+Drosophila+melanogaster.">Testing the "rate of living" model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster.</a> J Appl Phys. 97 (5), 1915-1922 (2004).</li></ol>

The author declares no competing financial interests.

Questo protocollo descrive un metodo per misurare l&#39;ossidazione di substrati specifici radiomarcati in adulti Drosophila melanogaster. Questa tecnica è semplice, quantitativa, riproducibile e sensibile, e integra metodi esistenti che misurano produzione totale di CO 2 e il consumo di O 2 in quanto può essere utilizzato per identificare la sostanza nutriente (s) essendo ossidato per la produzione di ATP. Misurazione della CO 2 liberata dalla ossidazione di substrati specifici radiomarcati utilizzando il metodo qui descritto è complementare a tecniche che misurano produzione totale di CO 2. Totale produzione di CO 2 (V CO2) permette di stimare il tasso metabolico e, quando è noto consumo totale O 2 (V O2), il tasso metabolico può essere calcolato e la fonte di combustibile per l&#39;ossidazione può essere stimato sulla base del rapporto di scambio respiratorio (V CO2 / V O2 = RER). quandoi carboidrati sono il substrato esclusiva, RER = 1, ma quando gli acidi grassi sono la fonte esclusiva, RER = 0.7, a causa della stechiometria delle reazioni di glucosio e ossidazione dei lipidi. In assenza di apparecchiature per misurare il consumo di ossigeno in Drosophila 14, il combustibile ossidativo non può essere identificato. Tuttavia, mediante l&#39;etichettatura vola con tracce di un substrato radioattivo o l&#39;altro e tassi di misura di radioattivo produzione di CO 2, si possono trarre conclusioni circa la capacità delle mosche di ossidare un determinato substrato in diversi momenti durante uno stimolo o sugli effetti di un data mutazione sul ossidazione del combustibile. Ci sono un certo numero di passaggi critici in questo protocollo. In primo luogo, si deve prestare attenzione quando si usano materiali radioattivi per evitare fuoriuscite e la contaminazione delle aree di ricerca. In secondo luogo, quando anestetizzare le mosche durante le fasi 2.1 e 3.4, lo sperimentatore dovrebbe lavorare velocemente per evitare gli effetti di una prolungata CO 2l&#39;esposizione sul metabolismo e sul comportamento. Un gruppo di 20 mosche può essere anestetizzato e trasferito in un nuovo flacone o in un baccello mosca in 20 secondi o meno. Quando trasferito da un apparecchio di anestesia in una fiala di cibo, il flaconcino deve essere riposato su un lato per evitare che le mosche anestetizzati di rimanere bloccati sulla superficie alimentare. Quando mosche sono cibo radioattivo nutriti nel corso di diversi giorni come al punto 2.2, lo sperimentatore deve assicurare che il cibo non si secchi in linea sono sensibili alla disidratazione. La FED o digiuno prima dell&#39;etichettatura, la scelta dell&#39;etichetta, la lunghezza del tempo di etichettatura, il periodo di tempo nel contenitore mosca, e il metodo di anestesia sono parametri che possono essere sottoposti a guasti e modifica quando si utilizza questa tecnica. In primo luogo, vola sottoposti a periodi di etichettatura brevi (2-3 hr) è improbabile che consumano quantità significative di cibo radioattivo a meno sottoposto ad un periodo di digiuno in anticipo. In secondo luogo, la scelta dell&#39;etichetta cun effetto le conclusioni si è in grado di disegnare su fenotipi metabolici. Ad esempio, la produzione di CO 2 radioattivo da D- [1- 14 C]-glucosio può riflettere ossidazione attraverso il ciclo dell&#39;acido citrico o lo shunt del fosfato pentoso, mentre radioattivo produzione di CO 2 da D- [6- 14 C]-glucosio riflette l&#39;ossidazione attraverso il ciclo dell&#39;acido citrico solo 12,15,16. Alimentazione mosche con un tracciante radiomarcato per un amminoacido essenziale 17,18 sarebbe una buona strategia per valutare ossidazione degli aminoacidi derivati ​​dalle proteine. Infine, i periodi di etichettatura lunghi con glucosio radioattivo anche aumentare la possibilità di costituzione di questo precursore in altre classi di molecole, come i trigliceridi 19 e aminoacidi come alanina, che interconverts facilmente con piruvato. Questo può essere valutata misurando la radioattività incorporata in queste diverse classi di molecole 6. rad Infatti, coorti separate di mosche possono essere alimentatisubstrati iolabeled nello stesso modo e poi utilizzato per esperimenti di volo POD o misurazione del radiomarcato che viene memorizzato e rimane in glicogeno e trigliceridi nel nutriti e digiunato condizioni 6, per esempio. Un&#39;altra strategia è quella di utilizzare i periodi di breve etichettatura che potrebbero rivelare l&#39;ossidazione delle sostanze nutrienti nella dieta radiomarcati se stessi e non le forme di questi nutrienti di stoccaggio. In terzo luogo, è anche possibile che due gruppi di mosche potrebbero avere tassi identici di 14 CO 2 produzione di un determinato periodo di tempo, ma velocità molto diverse inizialmente. Pertanto, variando la quantità di tempo che vola passare nel contenitore volo può essere un parametro importante per alterare nel valutare variazione fenotipica. Infine, questo protocollo prevede l&#39;utilizzo di un breve periodo di CO 2 anestesia quando mettendo linea nell&#39;apparato fly pod. È possibile che le anestesia CO 2 possono influenzare la funzione metabolica nel corso dell&#39;esperimento fly pod. Un supplente unAPPROCCIO è quello di utilizzare l&#39;anestesia azoto che non influenza il tasso metabolico 20. Come con qualsiasi tecnica che misura un sistema complesso come l&#39;ossidazione del combustibile e il ritmo metabolico, il metodo qui descritto ha limitazioni. Innanzitutto, è possibile che vola in diversi gruppi potrebbero consumare diverse quantità di cibo radiomarcato e quindi sarebbe entrare nella fase di raccolta CO 2 del test con diverse quantità di partenza di substrato. Questo può essere controllato per qualche misura eseguendo l&#39;esperimento con campioni di grandi dimensioni e alimentando mosche in massa. Per periodi brevi di etichettatura, mosche con simili coraggio di colore blu avranno consumato radiomarcato e può essere portato avanti alla porzione caccia dell&#39;esperimento. La quantità di prodotto radiomarcato rimanente in un gruppo di mosche può essere misurato al termine dell&#39;esperimento e in coorti separate di mosche dopo la fine del periodo di alimentazione e chase iniziale. In secondo luogo, i livelli di attività tragruppi di mosche in baccelli mosca possono essere diverse. Questo dovrà essere determinato sperimentalmente e presi in considerazione quando si interpretano i dati. Terzo, questa tecnica non misura CO 2 produzione totale, solo la produzione di uno specifico elemento nutritivo o il modulo di memorizzazione (s) di tale nutriente. Questo protocollo non è un sostituto per ma invece è complementare alle misure di VCO 2 perché fornisce informazioni diverse e supplementari. Il metodo qui descritto misure espirata, CO 2 radioattivo che è un prodotto di ossidazione di tracce di specifici substrati metabolici. Variando l&#39;etichetta utilizzata - glucosio, acidi grassi, o aminoacidi - si può progettare esperimenti sempre più sofisticati per valutare i contributi di diversi substrati per il metabolismo in diverse condizioni fisiologiche, come la fame e su diversi background genetico. Le future applicazioni di questa tecnica includono la misurazione di metabolism negli stadi larvali e pupe di sviluppo, due fasi del ciclo di vita Drosophila che sono caratterizzate da estremi rispettivamente stoccaggio nutrienti e ripartizione,.

Il lavoro nella organismo modello Drosophila melanogaster ha contribuito notevolmente alla comprensione dei principi genetici, processi di sviluppo, la crescita, l&#39;invecchiamento, il comportamento, l&#39;immunità e malattia umana 1,2. Una miriade di approcci biologici genetici e cellulari in Drosophila ha guidato i progressi in questi settori. Tuttavia, lo studio del metabolismo in drosofila ha sviluppato più lentamente, dovuto in gran parte alla difficoltà nel misurare parametri metabolici in un piccolo animale simile. L&#39;interesse ad utilizzare Drosophila come modello per lo studio di malattie umane come il diabete e per la comprensione dei contributi del metabolismo alla crescita e varie patologie ha spinto il settore a sviluppare e adattare le tecniche metabolici per questo organismo 3,4. metodi affidabili sono ora disponibili per la misurazione di una serie di parametri metabolici nel mosca della frutta. Ad esempio, è semplice valutare l&#39;assunzione di cibo <sup&gt; 5, i livelli di trigliceridi immagazzinati e glicogeno, così come i livelli circolanti emolinfa di glucosio e il principale zucchero circolante nel fly, trealosio, che è un disaccaride composto da due molecole di glucosio 4. Uso di traccianti metabolici ha consentito lo studio di assorbimento dei nutrienti dalla dieta e la conversione dei nutrienti assorbiti come il glucosio alle forme accumulo di glicogeno e trigliceridi 6. Tassi metabolici possono essere valutati nel frutto volare attraverso la misurazione del consumo di ossigeno 7,8 e anidride carbonica (CO 2) di produzione. Il ciclo dell&#39;acido citrico ossida unità a due atomi di carbonio che possono entrare nel ciclo come coenzima A (CoA), che è derivato dal metabolismo dei carboidrati alimentari e immagazzinati ed acidi grassi. Ogni giro del ciclo genera una molecola ciascuno di GTP (o ATP) e il donatore di elettroni FADH2, tre molecole di NADH e due molecole del prodotto di scarto CO 2. Produzione di CO 2 puòessere utilizzato per stimare il metabolismo basale. Produzione totale di CO 2 può essere quantificato in Drosophila attraverso l&#39;uso di respirometri disponibili in commercio o artigianali 9-10,11. La misurazione della produzione totale di CO 2, soprattutto quando accoppiato con la misurazione del consumo di O 2, fornisce informazioni preziose metabolismo energetico di tutto il corpo. Tuttavia, questa misura non identificare la sostanza nutritiva viene ossidato per l&#39;adenosina trifosfato (ATP) di produzione. Tre classi principali di nutrienti possono entrare nel ciclo dell&#39;acido citrico a seguito della conversione di acetil-CoA: carboidrati, acidi grassi e proteine. Glucosio-6-fosfato, derivato dal glucosio dietetico o glicogeno immagazzinato, può essere convertito in piruvato che è decarbossilata dal piruvato deidrogenasi per formare acetil CoA. Ripartizione degli acidi grassi derivati ​​dalla dieta o da trigliceridi memorizzati da rendimenti ß-ossidazione acetil-CoA che poi entra nel ciclo dell&#39;acido citrico. Finalmente, Una maggioranza di aminoacidi può entrare nel ciclo dell&#39;acido citrico seguente conversione piruvato, acetil CoA o acido citrico intermedi del ciclo come alfa-chetoglutarato. contributo specifico-Nutrient al metabolismo energetico durante condizioni basali e stimolate può essere monitorato mediante l&#39;uso di traccianti radioattivi. Il protocollo presentato qui è adattato per l&#39;uso in Drosophila da un protocollo utilizzato per valutare l&#39;ossidazione nelle cellule in coltura 12,13. In questo approccio, i moscerini della frutta sono alimentati 14 substrati C-radioattivo metaboliche (carboidrati, acidi grassi, o aminoacidi) nella dieta per un breve (ore) o lunghe (giorni) di impulso, inseguiti sul cibo senza etichetta, e quindi esposti a un camera contenente idrossido di potassio (KOH) carta da filtro saturi per intrappolare CO espirata 2 come bicarbonato. bicarbonato radioattivo può essere quantificato dal conteggio a scintillazione. Le differenze di radiomarcato-produzione di CO 2 tra esperimentoAl gruppi di linea possono riflettere uso di combustibili diversi per la produzione di ATP nel corso di un prolungato differenze veloci o intrinseche nel metabolismo di carburante tra genotipi, per esempio.

<table><tbody><tr><td>PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 &amp;micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC075H050UC</td><td></td></tr><tr><td>GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50 &amp;micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC045X050UC</td><td></td></tr><tr><td>Glucose, D-[1-14C]-, 50&amp;micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC043X050UC</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116</td><td></td></tr><tr><td>Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12 x 75 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959AA</td><td></td></tr><tr><td>Mesh, nitex nylon, 120 &amp;micro;m</td><td>Genesee Scientific</td><td>57-102</td><td></td></tr><tr><td>20 ml borosilicate glass scintillation vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-15</td><td></td></tr><tr><td>Flask top stopper with off-center hole</td><td>Fisher Scientific</td><td>K882310-0000</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene center well</td><td>Fisher Scientific</td><td>K882320-0000</td><td></td></tr><tr><td>Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-874-20</td><td></td></tr><tr><td>Ecoscint A</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-273</td><td></td></tr><tr><td>6 ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps</td><td>National Diagnostics</td><td>SVC-06</td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of carbon dioxide production from radiolabeled substrates in drosophila melanogaster

Il potere della genetica Drosophila viene sempre applicato a problemi di segnalazione ormonale e il metabolismo e allo sviluppo di modelli di malattie umane in questo organismo. metodi sensibili per la misurazione di parametri quali i tassi metabolici sono necessari per guidare la comprensione della fisiologia e malattie in piccoli animali come la mosca della frutta. Il metodo descritto qui valuta l&#39;ossidazione del combustibile in un piccolo numero di mosche adulte alimentati alimenti contenenti tracce di 14 substrati C-etichettato come il glucosio o acidi grassi. Dopo il periodo di alimentazione ed eventuali manipolazioni sperimentali aggiuntivi, mosche vengono trasferiti tubi corti ricoperte con rete, che vengono poi inseriti in flaconcini di vetro contenenti carta da filtro KOH-saturo che trappole esalato, radiomarcato CO 2 generato dalla ossidazione di substrati radiomarcati come bicarbonato di potassio, KHCO 3. Questo bicarbonato radiomarcato è misurato mediante conteggio a scintillazione. Questo è aqapproccio quantitative, riproducibile e semplice per lo studio dell&#39;ossidazione del carburante. L&#39;utilizzo del glucosio radioattivo, acidi grassi, o aminoacidi permette di determinare il contributo di queste diverse fonti di combustibile per il metabolismo energetico, in condizioni diverse, come l&#39;alimentazione e il digiuno e in diversi background genetico. Ciò integra altri approcci utilizzati per misurare in vivo il metabolismo energetico e dovrebbe favorire la comprensione della regolazione metabolica.

La quantità di esalato e intrappolati CO 2 radiomarcato che viene prodotto dal metabolismo di un substrato radioattivo dovrebbe correlare con il numero di mosche in un baccello mosca così come la quantità di tempo gli animali trascorrono nell&#39;apparato raccolta CO 2. Per verificare ciò, le mosche che sono stati a digiuno per 18 ore sono stati alimentati con acido palmitico radioattivo (0,02 pCi / cibo ml) per 2 ore e poi testato per radioattivo produzione di CO 2 in gruppi di 12 o 25 animali per 3 o 6 incubazione hr. La quantità di CO 2 prodotta da 25 mosche era quasi il doppio della quantità prodotta da 12 mosche, e l&#39;importo per ogni gruppo ha raddoppiato quando il tempo di incubazione è stata aumentata da 3 ore a 6 ore (Figura 2A). Il pmol 14 CO 2 / fly / ora era quasi equivalente in ciascun gruppo. Il digiuno stimola la ripartizione degli acidi grassi per ß Ossidazione; quindi produzione di CO 2 da ossidazione degli acidi grassi dovrebbe essere elevata in animali a digiuno rispetto agli animali alimentati. Per determinare se questo fosse il caso, a 18 ore a digiuno mosche sono stati alimentati con acido palmitico radioattivo per 2 ore. Seguendo questo impulso alimentazione breve, mosche sono stati divisi in due gruppi e trasferiti al cibo fly non marcato o 1% agar per 3 ore e poi trasferite per volare cialde per 2 ore. In due esperimenti separati, le mosche inseguito su agar prodotta CO significativamente più radioattivo 2 rispetto alle mosche inseguito sul cibo (Figura 2B), indicando che l&#39;ossidazione ß è stata aumentata negli animali a digiuno. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig1.jpg" /> Figura 1. L&#39;apparecchio per la raccolta espirato radiomarcata CO 2. Mosche che hanno consumato substrati metabolici radioattivi sonoinseriti in un &quot;fly pod&quot; (FP), un tubo di cutoff centrifuga ridotta con rete (M). Il pod mosca viene inserito in un 20 ml di vetro scintillazione fiala e ricoperto con un tappo superiore in gomma (S) contenente un foro eccentrico, attraverso il quale è posto un pozzetto centrale (CW) che contiene carta da filtro GF / B saturato con 100 microlitri 5% KOH. Espirato CO 2 reagisce con il KOH ed è intrappolato sulla carta filtro come bicarbonato. Intrappolato, CO 2 radioattivo può essere quantificata mediante conteggio a scintillazione della carta da filtro saturo. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54045/54045fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig2.jpg" /> Figura 2. 14 CO 2 Correlates di produzione con il tempo e il numero di mosche in unFly Pod e risponde a Fed e digiunato condizioni. (A) La quantità di 14 CO 2 prodotta in mosche alimentato palmitato radiomarcato è correlato al numero di mosche testati (n = 12 (bar aperto) o 25 (bar chiusi)) e il tempo trascorso in un baccello mosca (3 o 6 ore ). Su una base per-fly, mosche prodotte 0.99, 1.13, 1.10 e 1.01 pmol 14 CO 2 / h (dati elencati nello stesso ordine da sinistra a destra come dati del grafico). (B) le mosche che sono stati cacciati su agar ossidata più radioattivo palmitato di mosche che sono stati cacciati sul cibo. I dati provengono da due esperimenti e sono segnalati come mezzi deviazione standard, n = 16 - 17 mosche / gruppo (esperimento 1); n = 10 mosche / gruppo (esperimento 2). * P = 0.017, test t. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54045/54045fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

Misura della produzione di anidride carbonica da marcata radioattivamente Substrati in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...

measurement-carbon-dioxide-production-from-radiolabeled-substrates

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

9.1K Views.  University of Virginia. This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

Video: Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissezione del sistema nervoso centrale larvali in Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Ricerca

Biologia

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human organs, possess highly conserved metabolic pathways and have a relatively short lifespan that allows the study of different fundamental mechanisms in a short period of time. It is, however, surprising that one of the mechanisms essential for cellular metabolism, the mitochondrial respiration, has not been thoroughly investigated in this model. It is likely because the measure of the mitochondrial respiration in Drosophila usually requires a very large number of individuals and the results obtained are not highly reproducible. Here, a method allowing the precise measurement of mitochondrial oxygen consumption using minimal amounts of tissue from Drosophila is described. In this method, the thoraxes are dissected and permeabilized both mechanically with sharp forceps and chemically with saponin, allowing different compounds to cross the cell membrane and modulate the mitochondrial respiration. After permeabilization, a protocol is performed to evaluate the capacity of the different complexes of the electron transport system (ETS) to oxidize different substrates, as well as their response to an uncoupler and to several inhibitors. This method presents many advantages compared to methods using mitochondrial isolations, as it is more physiologically relevant because the mitochondria are still interacting with the other cellular components and the mitochondrial morphology is conserved. Moreover, sample preparations are faster, and the results obtained are highly reproducible. By combining the advantages of Drosophila as a model for the study of metabolism with the evaluation of mitochondrial respiration, important new insights can be unveiled, especially when the flies are experiencing different environmental or pathophysiological conditions.

In this paper, a method to measure oxygen consumption using high-resolution respirometry in permeabilized thoraxes of Drosophila is described. This technique requires a minimal amount of tissue compared to the classic mitochondrial isolation technique and the results obtained are more physiologically relevant.

Misura del consumo di ossigeno mitocondriale nelle fibre Permeabilized di Drosophila utilizzando la minima quantità di tessuto

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Biochimica

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Monitoraggio ad alta risoluzione video di locomozione per adulti in Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

Il monitoraggio delle funzioni cardiaca in larvali Drosophila melanogaster Per gli Studi fisiologici

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Immagini dal vivo di Drosophila melanogaster Migrazioni Hemocyte embrionali

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Dissezione di Oenocytes da adulti Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolamento di Drosophila melanogaster Testicoli

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Analisi metabolica di Drosophila melanogaster Larval e cervello adulto

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Neuroscienze

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Misurazione del tasso metabolico in<em&gt; Drosophila</em&gt; Utilizzando respirometria

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Adattamento della microrespirometria per la Drosophila - Approfondimenti sul metabolismo dei mutanti CASK

Measuring O2 Consumption in Drosophila melanogaster Using Coulometric Microrespirometry

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable environment. A coulometric microrespirometer consists of an airtight chamber in which O2 is consumed and the CO2 produced by the organism is removed by an absorbent medium. The resulting pressure decrease triggers electrolytic O2 production, and the amount of O2 produced is measured by recording the amount of charge used to generate it. In the present study, the method has been adapted to Drosophila melanogaster tested in small groups, with the sensitivity of the apparatus and the environmental conditions optimized for high stability. The amount of O2 consumed by wildtype flies in this apparatus is consistent with that measured by previous studies. Mass-specific O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and known to be less active, was not different from congenic controls. However, the small size of CASK mutants resulted in a significant reduction in O2 consumption on a per-fly basis. Therefore, the microrespirometer is capable of measuring O2 consumption in D. melanogaster, can distinguish modest differences between genotypes, and adds a versatile tool for measuring metabolic rates.

Autore in primo piano: Influenza della temperatura su Drosophila melanogaster e coleotteri adattati al deserto 

Coulometric respirometry is ideal for measuring the metabolic rate of small organisms. When adapted for Drosophila melanogaster in the present study, measured O2 consumption was within the range reported for wildtype D. melanogaster by previous studies. Per-fly O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and less active, was significantly lower than the wildtype.

Misurazione del consumo di O2 in Drosophila melanogaster mediante microrespirometria coulometrica

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable ...

Misura della produzione di anidride carbonica da marcata radioattivamente Substrati in

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video