We thank our colleagues for cDNA plasmids for template generation. The authors' work is supported by the Swedish Cancer Foundation (CAN 2010/553), the Swedish Foundation for International Cooperation in Research and Higher Education (IG2011-2042) and the Knut and Alice Wallenberg Foundation (KAW2012.0058).

시험 관내 전사에 의해 RNA 프로브 1. 라벨링 <ol><li> 의 RNase가없는 조건에서 1.5 ml의 마이크로 튜브에 시험 관내 전사 반응을 조립 : 10.5 μL DEPC 처리 된 H 2 O, 4.0 μL 배 전사 버퍼, 1.0 μL DEPC 처리 된 H 2 O (1 μg의) 선형화, 정제 주형 DNA, 1.3 μL NTP 믹스, 0.7 μL의 합텐 표지 된 UTP, 0.5 μL의 RNA RiboLock 저해제 2.0 ㎕의 RNA 폴리머 라제. 주 : 최종 반응 부피가 20 μL이다. </li><li> 템플릿의 프로모터 서열 사용 T7에 따라, 시험 관내 전사를위한 T3 또는 SP6 RNA 폴리머 라 아제 (17 항목 참조). </li><li> RNA 프로브에 대한 레이블로 제닌-11 UTP, 비오틴-16 UTP, 또는 형광-12 UTP를 선택합니다. 자세한 내용은 토론에서 합텐 - 라벨 및 프로브 농도의 설명을 참조하십시오. </li><li> 전사 반응을 혼합하고 곧 스핀 다운. </li><li> 전사하자37 ℃에서 3 시간 동안. </li><li> , 주형 DNA의 제거를위한 전사 반응에 1 μL RNA 분해 효소가없는 DNase의 I 추가 잘 혼합하고, 37 ℃에서 15 분 동안 품어. </li><li> DEPC 처리 된 H 2 O에 200 μL 샘플 량으로 조정한다. </li><li> 라벨 RNA 프로브를 침전 100 μL (0.5 권) 7.5 M 초산 암모늄 600 μL (3 권) 에탄올을 추가합니다. 실온에서 30 분 동안 품어. <ol><li> 이 비법 인 뉴클레오티드의 원치 않는 침전으로 이어질 수 있으므로, 얼음처럼 차가운 에탄올을 사용하지 마십시오. </li></ol></li><li> 20 ℃에서 30 분 동안 최대 속도 (20,800 XG)에서 온도 조절 원심 분리기의 전사 RNA를 스핀 다운. 조심스럽게 뜨는을 대기음. </li><li> 20 ℃에서 10 분 동안 20,800 XG에 70 % 실온에서 에탄올과 원심 분리기와 그 결과 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 상층 액을 제거하고 실수 느슨한 펠렛을 대기음하지 않도록주의. 실온에서 몇 분 동안 열린 뚜껑 마이크로 튜브에 펠릿 건조 공기를 보자. </li><li> 지DEPC 처리 된 H 2 O. 100 ㎕에서 얻어진 펠릿을 해결 </li><li> -20 ° C에서 300 μL 사전 하이브리드 버퍼를 추가 (50 % 부피 / 부피 탈 포름 아미드, 5 배 SSC, 50 μg의 / ㎖ 헤파린 나트륨 소금, 0.1 % 부피 / 부피 트윈 20, 5 ㎎ / ㎖ torula RNA) 및 저장 . 프로브는 -20 ° C에서 저장 장기 수있다. 주 : 100 ㎕의 혼성화 완충액 새롭게 전사 프로브 묽은 3 μL 합텐 표지 된 RNA 프로브의 제 시험용 WISH 실험의 최종 농도를 얻었다. </li></ol> 삽입을 사용하여 배아 샘플 2. 처리 주의 : 다른 배양 단계 배아를 처리하기위한 모세관 또는 멀티 웰 플레이트를 사용하여 용액의 실수 교환 중에 이들 흡입하여 배아 상당량의 손실 위험을 맺는다. 이러한 손실을 방지하기 위해, 절차를 통해 배아 샘플을 실시하기위한 (예 Netwe​​ll 인서트 등) 바구니를 사용하는 것이 도움이 될 수있다. 이들은에서 폴리스티렌 있습니다배아 처리 동안 휴식하는 저면 (도 2A)에서의 폴리 에스테르 메쉬와 탑승자가 앉아. <ol><li> 위시 절차에서 배아를 처리, 12 웰 플레이트 (그림 2B)의 삽입을 조립하고 각 웰에 적합한 솔루션 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> 블루 팁을 사용하여 삽입으로 배아를 피펫. 모든 배아가 액체에 빠져들되어 있는지 확인합니다. </li><li> 배양 시간은 도처 다음 단계에 대한 솔루션으로 가득 다른 12- 웰 플레이트에서 태아 - 함유 삽입되면. <ol><li> (그림 2C)이 다른 (그림 2D)에 하나의 솔루션에서 한 번에 최대 12 개의 시료 전송 사업자와 핸들을 사용합니다. 참고 : 필요한 볼륨을 감소 염색 반응 (단계 6.2)에 대한 사전 하이브리드 / 하이브리드 단계 (단계 4.1 참조) 24 웰 플레이트 2.0 ML의 모세관을 사용합니다. 하이브리드 및 염색 반응은 100 권으로 수행1, L은 각각 400 μL. </li></ol></li></ol> 교잡 배아 3. 준비 <ol><li> , dechorionate 수집, 수정 및 표준 절차 (14, 18)를 사용하여 배아를 devitellinize. 제조 된 배아는 정기적으로 -20 ° C에서 메탄올에 저장됩니다. </li><li> 이식란 RT로 계내 혼성화에 사용하고 웰 당 2 ml의 메탄올로 채워진 12 웰 플레이트의 인서트에 분배한다. </li><li> 실온에서 감소 메탄올 시리즈를 통해 배아를 재수. (I) 1X PBS에서 1X PBS (Ⅱ)의 50 % 메탄올 중의 75 % 메탄올, 트윈 -20 (III) 1X PBS 내의 25 % 메탄올, 0.1 % 트윈 -20 (IV, 0.1 %, 3 분의 배아 매번 부화 ) 1X PBS, 0.1 % 트윈 -20 (V)를 1 배 PBS, 0.1 % 트윈 -20. </li><li> 실온에서 20 분 동안 1X PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드의 배아를 사전 해결. </li><li> RT에서 1X PBS에서 3 분, 0.1 % 트윈 20 (4) 세척하여 정착액을 제거합니다. 한편 해동 및 단백질 분해 효소 K와 글리신 작업 솔루션을 준비합니다. </li><li&gt; 신선한 테 K에서 Permeabilize 하시려면 배아 1X PBS에서, RT에서 0.1 % 트윈 -20 3 분 (50 μg의 / ㎖ 내지 10 μg의 / ㎖). 참고 : 단백질 분해 효소 K 처리가 배아 고정의 강도에 균형이다. 미리 고정 단계 (3.4)가 생략 된 경우, 예를 들어, 부드럽고 테 K 처리는 적용될 수있다. </li><li> 0.1 % 트윈 -20 RT에서 2 밀리그램 / 1X PBS 용액에 글리신, 두 개의 1 분간 린스하여 반응을 정지. </li><li> 실온에서 20 분 동안 1X PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드의 배아를 포스트 - 수정. </li><li> 그 후, 실온에서 1X PBS에서 3 분, 0.1 % 트윈 20 세척하여 네 번 파라 포름 알데히드 정착액을 제거합니다. </li><li> 전송 후 고정 배아는 사전 하이브리드 화하는 버퍼. 사전 하이브리드 버퍼에 저장 배아 -20 ° C에서 직접 프로브의 하이브리드를 진행합니다. </li></ol> 프로브 4. 하이브리드 <ol><li> 이식란 RT로 예비 혼성화 완충액에 -20 ℃에서 보관. 2.0 ml의 microtub에 사전 하이브리드 버퍼의 배아를 배포ES. </li><li> 최소한 30 분 동안 예비 혼성화 완충액에 65 ° C에서 배아 샘플을 예비 혼성화. 참고 : 사전 하이브리드와 하이브리드를 들어 수조를 사용하는 단계를 반복합니다. 사전 하이브리드 동안 세 안티센스 RNA 프로브, 각각 다른 유전자 성적 증명서에 대한 구체적이고 다른 합텐으로 표시까지 결합하여 프로브 믹스를 준비 할 시간이있다. </li><li> 프로브 혼합을 얻기 위해, 100 ㎕의 혼성화 완충액 (50 % 부피 / 부피의 탈 포름 아미드, 5 배 SSC, 50 ㎍ / ml의 각 소망 원래 합텐 표지 된 안티센스 RNA 프로브 (일반적으로 1 μL μL 내지 6 사이에서) 함께 적당량 추가 헤파린 나트륨 염, 0.1 % 부피 / 부피 트윈 -20, 5 ㎎ / ㎖ torula RNA, 5 % 중량 / 부피 덱스 트란 설페이트). 주 : 덱스 트란 설페이트 첨가는 선택적이다. </li><li> 5 분 동안 80 ℃에서 가열 블럭에서 안티센스 RNA 프로브 믹스 변성. 이어서 65 ° C까지 직접 변성 프로브 믹스 옮긴다. </li><li> 사전 하이브리드의 대부분을 제거배아 샘플에서 버퍼와 변성 프로브 믹스를 추가합니다. </li><li> 배아 샘플을 65 ℃에서 혼합 O / N을 조사하기 위해 하이브리드 보자. 주 : 55 ° C와 65 ° C 사이의 온도 범위는 정기적으로 하이브리드, 사전 및 사후 하이브리드 단계에 사용됩니다. 65 ° C에서 하이브리드는 가장 엄격한 조건을 제공하고 낮은 온도를 사용할 때 배경의 문제가있는 경우에 권장합니다. 배경 아무런 문제 향상된 신호 강도 및 개선 된 배아의 무결성의 이점을 제공한다 55 ℃에서 혼성화 추천은,이없는 경우. </li><li> 다음날 아침에는 먼저 그들이 시간에 정확한 온도로 가열되어 있는지 확인하기 위해, 65 ° C에 엄격 세척 솔루션을 전송합니다. </li><li> 2ml를 미리 예열 혼성화 세척 완충액 함유 12- 웰 플레이트의 삽입에 2.0 ml의 마이크로 튜브에서 배아와 전사 혼성화 프로브 믹스 (2 × SSC 중 50 % 포름 아미드를, 0.1 % 트윈 -20). 그들을 함유하는 12 웰 플레이트를 배치오븐에 bryo 샘플 및 65 ℃에서 20 분 동안 품어. </li><li> 2 ml의 새로운 하이브리드 세척 버퍼로 전송 배아 샘플 및 65 ℃에서 20 분 동안 품어. 다시 한 번이 단계를 반복합니다. </li><li> 2 × SSC에 한 번, 65 ℃에서 20 분 세척에 의해 초과 프로브를 제거, 0.1 % 트윈 20, 0.2 × SSC에 세 번, 0.1 % 트윈 20. </li><li> PBS, 트윈 20 실온에서 0.1 %를 1 배 배아 샘플을 전송합니다. </li><li> 실온에서 적어도 30 분 동안 차단 버퍼 (1X PBS, 0.1 % 트윈 20에서 8 % 양 혈청)에서 배아를 품어. </li></ol> 합텐 표지 프로브 5. 항체 검출 주 : 모든 세 다르게 표지 프로브의 혼성화 동시 대조적으로, 각각의 프로브와 인큐베이션 항체 염색 별도 라운드에서 잇달아 검출된다. 따라서 각 검출 라운드에서 단 하나의 항체가 사용된다 (안티 - 디그 옥시 제닌 AP 또는 안티 플루 오레 신 - AP 또는 안티 - 비오틴 - AP 중). <ol><li> 단계 중에서 선택5.1.1 5.1.3 검출 될 합텐 라벨에 따라 적절한 항체 희석을 준비하려면. 참고 : 다른 레이블 프로브의 순차적 검출을 위해, 다른 항 합텐 항체는 각 검색 사이클에 적용됩니다. <ol><li> 버퍼를 차단에서 4,000 : 형광 표지 된 프로브의 검출이 희석 안티 형광을-AP는 1 공액. </li><li> 버퍼를 차단에서 4,000 : 제닌 - 표지 된 프로브의 검출이 희석 안티 제닌을-AP는 1 공액. </li><li> 블로킹 완충액에 희석 4,000 : 바이오틴 - 표지 된 프로브의 검출을 위해 하나의 안티 비오틴 AP 접합체 용액을 제조 하였다. </li></ol></li><li> 실온에서 3 시간 4의 선택 항 합텐-AP 솔루션의 배아를 품어. 또한, O / N 4 ° C에서 품어. 동시에 세 개의 항체를 사용하지 마십시오. </li><li> 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 PBS 1X, RT에서 0.1 % 트윈 -20 시간 (4)에 대한 15 분으로 배아 씻는다. </li><li> 버퍼 시스템을 변경했다TNT에 RT에서 H 두 번, 15 분 (8.0, 0.1 M 트리스 -HCl pH를 0.1 M의 NaCl, 0.1 % 트윈 -20). </li></ol> 6. 알카라인 포스파타제 원체 염색 <ol><li> 항체의 검출에 후속하여 (표 1 참조) 단계 6.1.4 6.1.1 중에서 선택하고, 원하는 색상 신호를 얻기 위해 알칼리성 포스파타제 염색 발색 반응의 진행 하나. 검출의 각 라운드마다 다른 발색 기질 반응은 다른 색상 각 성적 패턴을 강조하기 위해인가된다. <ol><li> 빠른 레드 염색 <ol><li> TT8.2 15 분 (0.1 M 트리스 - 염산의 pH 8.2, 0.1 % 트윈 20)에 대한 배아 두 번 씻으십시오. </li><li> 배아를 세척하면서, 패스트 레드 TR / NAMP 알칼리성 포스파타제 기질 정제 세트로부터 패스트 레드 염색 용액을 제조 하였다. </li><li> 증류수 1ml를 설정할 정제 버퍼 정제를 용해하고, 0.1 M 트리스 -HCl pH가 8.2을 수득 텍싱하여 혼합한다. </li><li> 준비된 T에 고속 레드 TR / NAMP 태블릿을 드롭RIS 버퍼 패스트 레드 염색 용액을 얻었다 텍싱하여 녹인다. </li><li> 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 용해되지 않은 입자가 클리어 패스트 레드 염색 액. </li></ol></li><li> 빠른 블루 염색 <ol><li> 신선한 SB8.2 염색 완충액을 15 분 동안 배아 두 번 씻어 (0.1 M 트리스 -HCl pH가 8.2, 0.1 M의 NaCl, 0.05 M의 MgCl 2, 0.1 % 트윈 -20). </li><li> 배아를 세척하면서, 50 밀리그램 / (DMF)에서 용액 패스트 블루 BB 및 (DMSO)에 50 ㎎ / ㎖ 나프톨 포스페이트 스톡 용액으로부터 패스트 블루 염색 액을 준비한다. </li><li> 갓 SB8.2 0.5 ㎎ / ㎖에서 빠른 블루 BB 솔루션을 준비합니다. </li><li> 갓 SB8.2 0.5 ㎎ / ㎖에서 별도의 나프톨 인산 용액을 제조. </li><li> 소용돌이와 일정한 혼합에서 빠른 블루 BB 솔루션에 준비된 나프톨 인산 솔루션을 추가 적가. 생성 된 최종 농도는 작업 모두 기판 구성 요소 용액 0.25 밀리그램 /이다. 참고 : 다른 빠른 블루 / 나프톨 phosp을증오 조합은 상이한 색조 (표 1 참조)를 초래한다. </li></ol></li><li> BCIP / NBT 염색 <ol><li> 신선한 SB9.5 염색 완충액을 15 분 동안 배아 두 번 씻어 (0.1 M 트리스 -HCl pH가 9.5, 0.1 M의 NaCl, 0.05 M의 MgCl 2, 0.1 % 트윈 -20). </li><li> purpleblue 발색 신호에 대해, 신선 1 μL의 레바 미솔, 3.5 μL의 BCIP 및 SB9.5 염색 완충액 1 ㎖ 당 4.5 μL의 NBT를 추가하여 BCIP / NBT 염색 용액을 제조하고 잘 혼합한다. </li></ol></li><li> INT 염색 <ol><li> 신선한 SB9.5 염색 버퍼에 15 분 동안 배아 두 번 씻으십시오. </li><li> yellowbrown 발색 신호를 들어, 갓 1 μL의 레바 미솔, 5 μL 마젠타 - PHOS 및 SB9.5 염색 버퍼 1 ㎖ 당 5 μL의 INT를 추가하여 INT 염색 용액을 제조하고 잘 섞는다. 참고 : 또는 7.5 μL / ㎖ BCIP / INT 즉시 사용 가능한 염색 액을 사용한다. </li></ol></li></ol></li><li> 염색 반응 전송 배아 샘플24 웰 플레이트에. 어둠 속에서 선택한 염색 액 400 μL의 각 샘플을 품어. </li><li> 실체 현미경 하에서 개발 신호 가끔 모니터링합니다. 원하는 신호 강도가 얻어 상당한 배경 신호가 관찰되기 전에 때 염색 반응을 정지. </li><li> , 발색 반응을 중지 아니라 당 2 ml의 TNT를 포함하는 12 웰 플레이트의 삽입에 스테인드 배아를 전송합니다. TNT의 스테인드 배아 두 번 씻어. </li><li> 1 × PBS에 10 분 동안 배아 두 번 씻고, 실온에서 0.1 % 트윈 20 잔류 기판을 제거합니다. </li></ol> 7. 항체 제거 / 알칼리성 인산 가수 분해 효소 불 활성화 <ol><li> 항체를 제거하고 실온에서 10 분 동안 낮은 pH 정지 용액 (0.1 M 글리신 - 염산 pH를 2.2, 0.1 % 트윈 -20) 2 ㎖로 배양 알칼리성 포스파타제 불활. </li><li> RT에서 1 × PBS 중 2 ㎖, 0.1 % 트윈 -20로 1 분 동안 헹구고. </li><li> 1 × PBS로 3 분 동안 3 회 반복, 0.1 % 트윈 20 실온에서. </li></ol> 8. 제 2 검출 라운드 <ol><li> 제 사체의 분포 패턴을 검출하는 제 합텐 레이블에 대해 타겟 AP 항체 접합체를 사용하여 합텐 표지 된 프로브 (STEP 5.1-5.4) 항체의 검출을 진행. </li><li> 알칼리성 포스파타제 염색 발색 (STEP 6.1-6.5) (가능한 색상 표 1 참조) 제 1 검출 원에서 사용되는 것과 대조되는 색을 생성하는 기판 조합을인가를 수행한다. </li><li> 7.3 단계 7.1에 설명 된대로 두 번째 항체-AP 복합체를 제거합니다. </li></ol> 9. 제 3 검출 라운드 <ol><li> 제 사체의 분포 패턴을 검출하기 위해서, 항체가 AP 셋째 합텐 표지를 사용하여 특정 공액 합텐 표지 된 프로브의 검출 항체 (STEP 5.1-5.4)로 진행. </li><li> 알칼리 포스 파타 아제 발색 염색 (단계 6.1-6.5) AP 아니었다 기판의 조합을 적용 수행이전 검출 라운드에서 먹었. 색 검출 이전 두 라운드의 것과 구별하기 쉽게 침전 생성 발색 반응을 선택 (색상 선택은 표 1 참조). </li></ol> 10. 설치 및 영상 <ol><li> PBS에서 30 % 글리세롤로 적절히 이동시켜 염색 배아 배아 완전히 글리세롤 용액에 침지 될 때까지 배양한다. 그들은 바닥에 가라 앉을 때 잘 평형있다. </li><li> H 2 O 70 % 글리세롤로 전송 배아 및 실온에서 평형 수 있습니다. 염색 배아는 4 ° C에서 70 % 글리세린에 저장 될 수있다. </li><li> 장착, 피펫은 객체의 슬라이드에 슬라이드 (그림 3)에 붙어 스페이서를 건드리지 않고 70 % 글리세롤 방울의 배아를 스테인드. 커버 슬립을 적용합니다. </li><li> 보기 해부 현미경 배아를 탑재. 배아가 원하는 방향으로 회전 할 수 있도록, 적용 커버 슬립을 이동합니다. </li><li> 제대로 관찰미분 간섭 대비 광학와 복합 현미경 높은 해상도 (20X, 40X 목적)에서 지향 배아. </li><li> 디지털 컬러 카메라로 이미지를 캡처 및 디지털 저장 장치에 저장한다. </li></ol>

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Application to immunoassays.</a> J Immunol Methods. 125 (1-2), 279-285 (1989).</li><li>Hauptmann, G., Gerster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+whole-mount+in+situ+hybridization.">Multicolor whole-mount in situ hybridization.</a> Methods Mol Biol. 137, 139-148 (2000).</li><li>S&#246;ll, I., Hauptmann, G., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+and+automated+whole-mount+in+situ+hybridization+for+systematic+gene+expression+analysis+in+embryonic+zebrafish+forebrain.">Manual and automated whole-mount in situ hybridization for systematic gene expression analysis in embryonic zebrafish forebrain.</a> Neuromethods. 99, In situ hybridization methods, 171-206 (2015).</li><li>Bergalet, J., et al., Hauptmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+transcript+localization+in+Drosophila+embryos+and+tissues+visualized+by+multiplex+FISH.">Subcellular transcript localization in Drosophila embryos and tissues visualized by multiplex FISH.</a> Neuromethods. 99, In situ hybridization methods, 369-391 (2015).</li><li>Walldorf, U., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empty+spiracles,+a+gap+gene+containing+a+homeobox+involved+in+Drosophila+head+development.">Empty spiracles, a gap gene containing a homeobox involved in Drosophila head development.</a> Embo J. 11 (6), 2247-2259 (1992).</li><li>Hafen, E., Kuroiwa, A., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distribution+of+transcripts+from+the+segmentation+gene+fushi+tarazu+during+Drosophila+embryonic+development.">Spatial distribution of transcripts from the segmentation gene fushi tarazu during Drosophila embryonic development.</a> Cell. 37 (3), 833-841 (1984).</li><li>Grossniklaus, U., Pearson, R. K., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+sloppy+paired+locus+encodes+two+proteins+involved+in+segmentation+that+show+homology+to+mammalian+transcription+factors.">The Drosophila sloppy paired locus encodes two proteins involved in segmentation that show homology to mammalian transcription factors.</a> Genes Dev. 6 (6), 1030-1051 (1992).</li><li>Hauptmann, G., Gerster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+gene+expression+patterns+reveal+transverse+and+longitudinal+subdivisions+of+the+embryonic+zebrafish+forebrain.">Regulatory gene expression patterns reveal transverse and longitudinal subdivisions of the embryonic zebrafish forebrain.</a> Mech Dev. 91 (1-2), 108-118 (2000).</li><li>Long, S., Rebagliati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+two-color+whole-mount+in+situ+hybridizations+using+digoxygenin-+and+dinitrophenol-labeled+RNA+probes.">Sensitive two-color whole-mount in situ hybridizations using digoxygenin- and dinitrophenol-labeled RNA probes.</a> Biotechniques. 32 (3), 494-500 (2002).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescent+in+situ+hybridization+to+define+abutting+and+overlapping+gene+expression+in+the+embryonic+zebrafish+brain.">Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain.</a> Neural Dev. 6 (1), 10 (2011).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+whole-mount+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+using+enhanced+tyramide+signal+amplification.">Sensitive whole-mount fluorescent in situ hybridization in zebrafish using enhanced tyramide signal amplification.</a> Methods Mol Biol. 1082, 175-185 (2014).</li><li>Chen, J., Laramore, C., Shifman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-labeling+whole-mount+in+situ+hybridization+method+for+analysis+of+overlapping+gene+expression+in+brain+tissue+with+high+level+of+autofluorescence.">Triple-labeling whole-mount in situ hybridization method for analysis of overlapping gene expression in brain tissue with high level of autofluorescence.</a> J Cytol Histol. , S3-S011 (2015).</li><li>Murdoch, A., Jenkinson, E. J., Johnson, G. D., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+phosphatase-fast+red,+a+new+fluorescent+label.+Application+in+double+labelling+for+cell+cycle+analysis.">Alkaline phosphatase-fast red, a new fluorescent label. Application in double labelling for cell cycle analysis.</a> J Immunol Methods. 132 (1), 45-49 (1990).</li><li>Hauptmann, G., Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+alkaline+phosphatase-mediated+azo+dye+staining+for+dual+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish.">Application of alkaline phosphatase-mediated azo dye staining for dual fluorescent in situ hybridization in zebrafish.</a> Neuromethods. 99, In situ hybridization methods, 393-404 (2015).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems.">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev Biol. 11, 43 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

방사능 표지 된 핵산 프로브를 원위치 혼성화 (ISH)에서 종종 조직 섹션에 RNA의 현지화를 검출하는데 사용된다. 방사성 ISH 방법은, 그러나, 덜 민감 시간 소모하며, 전체 마운트에서 전체 성적 분포 패턴의 감사를 허용하지 않습니다. 대조적으로, 본원에 기재된 MC-WISH 방법은 그대로 배아 내의 색 대조에서 여러 유전자의 발현 도메인의 직접적인 비교를 허용한다. MC-소원은 조직 학적 상황을 즉시 알 수있다 표준 시야 현미경으로 간단하게 시각화 장점이있다. 이는 가능성이 높은 정확도로 서로에 대해 지형적 유전자 발현과 관련된 도메인을 신속하고 신뢰할 수있는 방법에 고유하고 중복 발현 부위를 정의하기 위해 제공한다. 한편, 멀티 플렉스 형광 ISH (FISH)는 감도 및 해상도에 대해 더 강력하며, 바람직하다면 셀룰러 또는 셀룰러 서브 재 사용되고mRNA의 검출의 용액이 필요하다. MC-위시하여 매핑 된 성적 증명서의 넓은 스펙트럼은 거의 모든 증명서는 배아에서뿐만 아니라 애벌레 및 성인 조직과 초파리가 아닌 다른 종에서뿐만 아니라 분석 할 수 있음을 시사한다. 실제로, 초파리 여기 자세한 설명 절차는 제브라 피쉬 배아 11,16,22와 마찬가지로 효율적으로 작동합니다. 또, MC-WISH 방법은 무척추 동물과 척추 동물 배아 조직 표본의 다양한 적응 될 수있다. 합텐 - 라벨 및 프로브 농도 우리는 일상적으로 RNA 프로브의 합텐 레이블로 형광, 제닌, 및 비오틴을 사용합니다. 또한, 디 니트로 페놀 표지 된 프로브를 적용 할 수 있고, 제브라 피쉬 WISH 실험 23-25에 도입되어있다. 그 형광 가장 F를 사용하므로 형광 표지 된 프로브는 다른 햅텐 라벨에 비해 낮은 감도를 표시풍부한 성적 증명서 또는 검출. 각 새로 전사 프로브는 먼저 성능이 기판으로 BCIP / NBT 또는 고속 레드를 사용하거나 평가되는 단일 위시 실험에서 시험한다. 배경 개발없이 강한 신호가 몇 시간에 분 이내에 달성 될 때 프로브 농도를 최적으로 간주됩니다. 관심의 표현 영역이 MC-위시하여 자신의 전체 범위에서 발견되었는지 확인하기 위해, 가장 민감한 기판 조합, BCIP / NBT를 사용하여 단일 레이블 위시 실험에 의해 각각의 성적 패턴을 시각화하는 것이 필수적이다. 이것은 약한 발현 도메인이 멀티 타겟 실험에서 간과하지 않는 것을 보장한다. 다른 기판 조합의 적은 민감도를 보상하기 위해 그 표준 BCIP / NBT 염색에 비해 프로브 농도 (세배로) 배로 사용하는 것이 필수적이다. 낮은 pH 불 활성화 낮은 pH 불 활성화 단계로 이어질 수두 번째 및 세 번째 라운드에서 염색 감소 신호 검출 결과 안티센스 합텐 표지 된 RNA 프로브 / 센스 mRNA의 하이브리드의 부분 분해. 감도의 손실을 최소화하기 위해, 불 활성화 단계는 가능한 한 짧다. 우리는 낮은 pH에서 10 분 배양 시간은 AP-활동의 제거를위한 충분하다는 것을 경험했다. 많은 양의 후속 빠른 세척은 언 바운드 항체-AP 복합체의 신속한 희석을 보장하고 haptenized 프로브에 다시 결합을 방지 할 수 있습니다. 대체 절차는 파라 포름 알데히드 고정 및 열 불 활성화를 포함한다. 그러나, 컬러 석출물의 일부는 안정되지 않고, 가열 파라 포름 알데히드 고정은 AP의 완전한 불 활성화하기에 충분하지 않을 수있다. 첫 번째 적용 항체-AP 복합체의 불완전 불 활성화는 다음 검출 라운드 검출 할 두 번째 mRNA의 종 식 가양 중복으로 이어지는에서 mRNA의 패턴의 시각화를 다시 발생할 수 있습니다. 따라서, 대조 실험에서 번째전자 배아는 처음 적용된 항체-AP 복합체의 불 활성화 후 2 분획으로 분할됩니다. 제 항체-AP 복합체는 제어 부분에서 생략되고 제 2 색에 반응하는 신호를 생성 할 것이다. 제 2 색 반응이 처음에 대응하는 신호의 분포 패턴을 생성하는 경우 비활성화 절차는 비효율적이었다. 이 경우에, 낮은 pH 정지 용액에서 배양 시간은 다음 실험에 대해 연장한다. AP 기판 애플리케이션의 오더 감도가 검출 이후의 각 라운드로 떨어 때문에, 이전에 더 풍부 성적에 덜 풍부한 mRNA를 검출하는 것이 좋습니다. 고속 염료가 바람직 강한 발현 사체 검출 용 제 염색 라운드에서 적용되도록 또한, 패스트 레드 및 블루 빠른 기판의 조합은 상당히 purpleblue의 BCIP / NBT 얼룩보다 덜 민감하다. 이 또한 시간후속 BCIP / NBT 염색 모니터링 및 purpleblue 신호 라이터 고속 염료 관련 너무 어두워지기 전에 시간에 정지 될 수있는 장점이있다. 따라서 표준 2 색 실험에서는 제 mRNA의 강한 발현은 패스트 레드에 의해 검출되고, 두 번째 약한 BCIP / NBT 의해. 그러나 잠시 후 확산 될 석출물을 생성 황색 INT 기판 조합이 적용될 수있다 고속 염료에 대한 대안으로서,. 따라서 BCIP / INT는 독점적으로 마지막 염색 라운드에서 적용된다. 따라서 세 가지 컬러 실험에서 우리는 종종 첫 번째 빠른 레드, 두 번째 BCIP / NBT (또는 고속 블루)와 세 번째 INT 기판의 조합을 사용합니다. 이 INT를 적용 할 때 가능한 한 빨리 스테인드 배아를 촬영하는 것이 좋습니다 있습니다. 아조 염료의 형광 검출 이는 어두운 색 침전물 라이터 하나 섀도우 때 중첩 발현 패턴을 인식하는 것이 때로는 어렵다. 에프또는 예를 들어, 강력한 개발 BCIP / NBT의 침전물 가벼운 빠른 염료 신호를 마스크 할 수 있습니다. 이 문제를 극복하는 한가지 방법은 각각의 염색 직후에 이미지를 캡쳐하고, 다음 검출 라운드 전에인가 색 침전물을 제거하는 것이다. 이 경우, 알코올 가용성 아조 염료 (패스트 레드) 및 INT 침전물을 각각 제 1 및 제 2 검출 발사 후 에탄올 세척에 의해 제거되고, BCIP / NBT 염색은 마지막 AP-기판 (26)으로인가된다. 또 다른 가능성은 아조 염료의 형광 특성을 활용할 수있다. 패스트 블루 원적외선 필터 (28, 29)에 의해 관찰 될 수있는 반면 패스트 레드 27 세트 로다 민 필터를 사용하여 가시화 될 수있다. 너무 조밀되고 아조 염료의 형광 신호를 급냉 않도록 비교 또는 발색 및 형광 화상의 중첩은, 시간에 정지되어야 공동 distribution.Using이 방법을, BCIP / NBT 신호 개발 사이트를 밝힐 수 반응 생성물.

현장 하이브리드 (ISH)에서 세포, 조직 및 생물 (1) 내의 형태 학적 맥락에서 감지 및 RNA 전 사체의 현지화에 대한 표준 방법입니다. ISH 절차에 의해 생성 된 신호는 일반적으로, 형광 및 발색 방사성 검출 시스템에 의해 가시화된다. 최근에는 형광 ISH에 상당한 기술적 진보 (물고기)의 2는 단일 분자 3,4 .WHILE까지 단일 셀 및 하위 세포 수준과 RNA를 시각화의 검출 및 RNA 발현의 정량을 허용 크게 향상 감도와 해상도를 결과 정교한 단일 분자 FISH 방법은보다 전문적인 응용 프로그램에 사용되는, 발색 ISH 연구 및 임상 진단의 현장 검출 방법의 일상적인 RNA로 널리 퍼져있다. 발색 검출을 위해 효소 침전 반응은 사이트에서 색상을 대조에 표시 제품을 생성하는 데 사용됩니다하이브리드 5. 이것은 RNA 시각화는 루틴 조직학 얼룩 및 형태학 컨텍스트와 결합 될 수있는 이점이 표준 명 시야 현미경으로 즉시 분명 갖는다. 또한,인가 색 기판은 다수의 영구 샘플 제제 5 얻어 지도록, 유기 및 / 또는 수성 매질에서 안정한 장착되어 석출물을 생성한다. 초파리에서 초기 ISH 프로토콜은 단면 한 재료 (6)에 성적 증명서 검출을 위해 방사성 동위 원소 표지 된 프로브를 적용했다. 이 조직 절편에서 전체 배아 또는 기관 시스템의 전체 전사 패턴을 재구성하는 것은 곤란하지만, 비 - 방사능 표지 된 프로브와 발색 ISH 절차의 적용은 가능한 전체 마운트 7 RNA 분포를 검출 전체적으로 할 수있다. 발색 ISH의 많은 변형이 존재하지만, 일반적인에서 현장 하이브리드 (위시) 프로토콜 HYB에서 전체 마운트ridized 합텐 표지 프로브는 항 합텐 항체 기자 효소에 결합하고 mRNA의 성적이 침전 발색에 의해 시각화에 의해 감지됩니다. 기자에 의해 생산 다르게 색 침전물의 팔레트는 알칼리성 포스파타제 (AP), 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (POD) 및 베타 - 갈 락토시다 (GAL) 하나에서 여러 대상의 특징 검출과 동일한 샘플 8-14을 허용 효소. 그러나, POD 효소 활성은 제한된 시간 기간 동안 지속하고 추가 (tyramide)는 신호 증폭 15 덜 풍부한 사체의 검출이 효소 어려울 수없이되도록 GAL 비색 반응은 다소 덜 민감하다. 이와는 대조적으로, AP의 지속적인 활성을 오랫동안 지속 기판 회전율 및 높은 신호 대 잡음 비율을 허용한다. 따라서, 다른 색 기판과 AP 기자 효소를 사용하여 순차적 검출이 유효에서 성공 입증하고단일 배아 10-12,16 최대 세 가지 성적 증명서의 특징 검출. 이 멀티 타겟 발색 위시 (MC-WISH) 방법 (그림 1) (14)의 경우, 표시 안티센스 RNA 프로브는 시험 관내 전사에 의해 생성하고 사용할 수 합텐 - 라벨 중 하나를 표시했다. 배아는 포름 알데히드 및​​ 메탄올 고정 처리 및 프로 테이나 제 K에 의해 투과성이 분해된다. 배아의 하이브리드 동시에 최대 세 다르게 표시 안티센스 RNA 프로브 다른 유전자에 대한 각각의 특정과 함께 실시한다. 엄격 세척하여 언 바운드 프로브를 제거한 후 각 합텐 - 레이블 검출 별도 라운드에서 시각화된다. 단일 검출 라운드 지역화 안정적인 색 침전물을 생성하는 AP-기판의 응용 프로그램에서 AP와 RNA를 시각화에 결합 된 항 합텐 항체와 배아의 배양으로 구성되어 있습니다. 항체의 검출 및 염색, 적용 항체-AP의 conju 후게이트는 낮은 pH 세척에 의해 제거된다. 다색 실험에서 검출 각 라운드는 다른 햅텐 레이블에 대해 표적 항체를 채용하고, 각 전사 패턴이 다른 색 기판 (표 1)에 의해 가시화된다. 배아는 글리세롤에 장착 및 미분 간섭 대비 (DIC)를 사용하여 광학 고해상도 화합물 현미경으로 이미지화된다.

<table><tbody><tr><td>Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0603</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0111</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0101</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0131</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>DNase I, RNase-free&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>NTP Set</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-UTP</td><td>Roche</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-12-UTP</td><td>Roche</td><td>11427857910</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-16-UTP</td><td>Roche</td><td>11388908910</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium acetate</td><td>Applichem</td><td>A2936</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, absolute&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>di-Sodium hydrogen phosphate</td><td>Scharlau</td><td>SO0339</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dihydrogen phosphate</td><td>Scharlau</td><td>SO0331</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>tri-Sodium citrate</td><td>Scharlau</td><td>SO0200</td><td></td></tr><tr><td>deionized formamide</td><td>Applichem</td><td>A2156</td><td></td></tr><tr><td>RNA type VI from torula yeast</td><td>Sigma</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Applichem</td><td>A3004</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfate sodium salt</td><td>Sigma</td><td>D6001</td><td></td></tr><tr><td>Sheep serum</td><td>Sigma</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>Sheep anti-biotin-AP Fab fragments&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11426303001</td><td></td></tr><tr><td>Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11426303001</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody</td><td>Vector laboratories</td><td>MB-3100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane</td><td>Scharlau</td><td>TR04241000</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Scharlau</td><td>MA0036</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Scharlau</td><td>SO0227</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Applichem</td><td>A3006</td><td></td></tr><tr><td>Fast Red tablet set</td><td>Sigma</td><td>F4648</td><td></td></tr><tr><td>Fast Blue BB salt</td><td>Sigma</td><td>F3378</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol-AS-MX-phosphate</td><td>Sigma</td><td>N5000</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol-AS-GR-phosphate</td><td>Sigma</td><td>N3625</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol-AS-BI-phosphate</td><td>Sigma</td><td>N2250</td><td></td></tr><tr><td>Magenta-Phos</td><td>Biosynth</td><td>B7550</td><td></td></tr><tr><td>INT</td><td>Sigma</td><td>I8377</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Applichem</td><td>A1243</td><td></td></tr><tr><td>BCIP</td><td>Applichem</td><td>A1117</td><td></td></tr><tr><td>INT/BCIP solution</td><td>Roche</td><td>11681460001</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol 86-88%</td><td>Scharlau</td><td>GL0023</td><td></td></tr><tr><td>Universal incubator</td><td>Memmert</td><td>BE400</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Memmert</td><td>WB14</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>Grant</td><td>QBT2</td><td></td></tr><tr><td>Netwell&amp;nbsp; inserts 15 mm</td><td>Corning</td><td>3477</td><td></td></tr><tr><td>Netwell carrier kit 15 mm</td><td>Corning</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>12-well cell culture plate</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microtube</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml microtube</td><td>Sarstedt</td><td>72.691</td><td></td></tr></tbody></table>

multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization for comparing gene expression domains in drosophila embryos

배아 발달하고 정확하게 상이한 유전자 시츄 서로 공간적 관계로 표현하는 방법을 정의하는 것이 필수적이다 형성기 중에 활성 유전자 조절 네트워크를 분석. 멀티 타겟 발색 전체 마운트 계내 혼성화 (MC-WISH)가 동일한 샘플 표본에 색 대조 상이한 mRNA의 종 특유의 시각화를 허용하기 때문에 크게 유전자 발현 패턴의 인스턴트 비교를 용이하게한다. 이는 가능성이 높은 정확도로 서로에 대해 지형적 유전자 발현 도메인을 관련시키는 독특한 발현과 겹치는 위치를 정의하기 위해 제공한다. 제시된 프로토콜에서는 초파리 배아에서 다른 유전자의 mRNA 발현 패턴을 비교하기 위해 MC-WISH 절차를 설명한다. 세 RNA 프로브, 각각 다른 유전자에 특이하고 다른 합텐으로 표시까지, 배아 샘플에 동시에 혼성이어서 알칼리에 의해 감지북동 비색 면역 조직 화학 염색을 포스 파타 아제는 기반. 설명 절차는 여기에 초파리에 대한 자세한하지만, 제브라 피쉬의 배아와 동일하게 작동합니다.

설명 프로토콜은 서로 다른 색상의 여러 사본 패턴의 동시 시각화 할 수 있습니다. MC-WISH 직접 배아 같은 상이한 유전자의 발현 양상을 비교할 수있는 이점을 제공한다. 예를 들어, 빈 spiracles의 발현 패턴 (EMS) (19), 부사 tarazu (FTZ) (20)와 단 정치 못한 쌍 1 (slp1) (21)가 직접 초파리 melanogaster의의 배반 엽 단계의 배아에서 비교 및 색상 색조의 다양한 시각입니다 (그림 4) . 다른 AP 기질 조합이 색 침전물 (표 1)의 대조 패널을 얻는 것이 가능하다. 패스트 레드 BCIP / NBT에 의해 생성 된 침전물 제조 보라색 적색 침전물을 쉽게 구별 할 수 있고, 따라서 일반적인 사용2 색 실험 LY (도 4A). 빠른 붉은 색이 성적 증명서의 일부 공동 분배의 경우에는 위장되도록 그러나, BCIP / NBT 얼룩 신속하게, 다소 어두운 색으로 설정할 수 있습니다. 따라서, 빠른 블루의 응용 프로그램은 NAMP, NAGP 및 NABP, 각각 (표 1)과 함께, 녹색, 파란색과 보라색의 제품을 생성하는 장점이 될 수 있습니다. NAMP와 빠른 블루의 조합은 EMS 각각 빨간색과 파란색으로 시각화 slp1 표현 사이트 (그림 4B)에 대해 다음과 같이 인접한 또는 중복 표현 영역에서 빠른 레드 제품을 쉽게 식별 할 수있는 밝은 파란색 색상을 제공합니다. 녹색 EMS 도메인이 명확하게 빨간 slp1 발현 사이트 (그림 4C)에서 독특한되도록 빠른 블루 NAGP 조합, 빠른 붉은 얼룩과 비슷한 강한 대비를 제공합니다. 그러나, EMS 및 slp1 식 사이트 드 않으면빠른 블루 NABP 및 고속 레드에 의해 tected, 각각 결과 보라색과 붉은 색의 침전물 (그림 4D) 이하 식별 할 수 있습니다. 위에서 언급 한 바와 같이 빨간색과 녹색, 각각 (그림 4D)에 slp1과 자유 무역 식으로 같이 빠른 빨간색과 빠른 블루 NAGP 구별하기 쉽다. INT와 함께 MagentaPhos은 자유 무역 지역의 분절 표현 (그림 4C, E)를 나타 내기 위해 사용되는 노란색 침전물을 생성한다. 노란 색의 침전물을 빨리 블루 NAMP 각각 (그림 4E) MAG / INT와 slp1과 자유 무역의 검출에 의해 예시 된 바와 같이 푸른 색 기판에 좋은 대조를 생성합니다. 그러나, 황색 침전물이 패스트 레드 생성물로부터 쉽게 식별 이하이다. EMS의 노란색 스테인드 표현 도메인은 거의 disti 될 수 있습니다<html> 빨간색 (그림 4 층)에 표시된 slp1의 주동이의 표현에서 nguished. 따라서, 색상의 기판 조합이 각각의 실험에 대해 신중하게 선택되어야한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig1.jpg" /> 그림 MC-위시 1. 순서도. 세 가지 독특한 성적 증명서 패턴의 여러 가지 빛깔의 시각화를 들어, 각 검색 사이클 다른 항체 AP 접합체 및 색상 기판 조합 사이에 선택합니다. 약어 : AP, 알칼리 포스 파타 아제; 바이오, 비오틴, DIG, 디그 옥시 제닌; FLUO, 형광. 다른 약어 전설 4 및 표 1을 참조하십시오. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53830/53830fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> S / ftp_upload / 53830 / 53830fig2.jpg &quot;/&gt; 배아 캐리어로서도 2 삽입한다. (A) 15mm 직경 및 74 ㎛의 메쉬 크기의 폴리 에스테르 막과 하단에 장착 인서트 초파리 배아 담체로서 사용된다. (나) 삽입은 다양한 솔루션을위한 저수지 트레이의 기능을 12 웰 플레이트에 조립된다. (C) 사용 가능한 사업자 및 핸들 (12) 삽입 / 배아 샘플을 동시에. (D)의 처리가 가능 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53830/53830fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig3.jpg" /> 스테인드 배아 그림 3. 장착. 태아는 스페이서로 작동 된 커버의 두 스택 사이에 70 % 글리세롤의 드롭에 장착되어있다. 응용 프로그램의 부드러운 이동거짓말 큰 coverslip에 관찰과 사진의 원하는 방향에 탑재 된 배아를 회전하는 데 도움이됩니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53830/53830fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig4.jpg" /> 그림 4. 초파리 배아에서 mRNA의 성적 증명서의 여러 가지 빛깔의 시각화. 초파리 배아에서 MC-위시 실험의 예는 측면보기에서 표시됩니다. 빈 spiracles의 mRNA 발현 패턴 (EMS), 부사 tarazu (FTZ)와 실수 페어링 1 (slp1)은 각 패널에 표시되는 다른 AP 색상 기판의 조합에 의해 시각입니다. 성적 증명서는 (A) 자유 무역 FLUO 및 EMS DIG, (가 검출되었다 <stroNG&gt; B)는 FLUO, EMS 바이오 및 자유 무역 지역 DIG, (C) EMS 바이오, FLUO이 slp1 및 자유 무역 지역 DIG, (D) 자유 무역 바이오, FLUO이 slp1 및 EMS DIG, (E) slp1 FLUO, EMS DIG를 slp1하고, 자유 무역 지역 바이오, (F) 자유 무역 바이오, FLUO을 slp1 및 EMS DIG는 프로브를 표시. 합텐 표지 프로브는 면역 나열된 수주 잇달아 검출되었다. 요약 : FB 빠른 블루; FR, 빠른 레드 태블릿. 다른 약어 전설 1 및 표 1을 참조하십시오. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53830/53830fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 기판 조합 </td><td> 1 ml의 AP 버퍼에 추가 </td><td> 집중하고기 [μg의 / ㎖] </td><td> AP 버퍼 </td><td> 색 </td><td> 신호 감도 </td></tr><tr><td> BCIP NBT </td><td> 3.5 μL 4.5 μL </td><td> (175) 337.5 </td><td> SB9.5 </td><td> 보라색 </td><td> +++ </td></tr><tr><td> MAG의 INT </td><td> 5 μL 5 μL </td><td> (250) (250) </td><td> SB9.5 </td><td> 황색 </td><td> + </td></tr><tr><td> BCIP / INT 원액 </td><td> 7.5 μL </td><td> (250) (250) </td><td> SB9.5 </td><td> 황색 </td><td> + </td></tr><tr><td> 빠른 블루 NAMP </td><td> 5 μL 5 μL </td><td> (250) (250) </td><td> SB8.2 </td><td> 파랑 </td><td> ++ </td></tr><tr><td> 빠른 블루 NABP </td><td> 20 μL 10 μL </td><td> 1,000 (500) </td><td> SB8.2 </td><td> 제비꽃 </td><td> ++ </td></tr><tr><td> 빠른 블루 NAGP </td><td> 10 μL 10 μL </td><td> (500) (500) </td><td> TT8.2 </td><td> 녹색 </td><td> + </td></tr><tr><td> 빠른 레드 NA​​MP </td><td> 1 태블릿 </td><td> 1,000 (400) </td><td> TT8.2 </td><td> 빨간 </td><td> ++ </td></tr></tbody></table> 표 1. 기판 조합 약어 : +++, 강한,. ++ 매체; +, 약한 NBT, 4- 니트로 블루 테트라 졸륨 클로라이드; BCIP, 5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌 릴 포스페이트; INT, 2- (4- 요오도 페닐) -3- (4- 니트로 페닐) -5- 페닐 테트라 졸륨 클로라이드; MAG, 마젠타 PHOS, 5- 브로 모 -6- 클로로 -3- 인돌 릴 포스페이트, NAMP, 나프톨 AS-MX 인산; NABP, 나프톨 AS-BI 포스페이트; NAGP, 나프톨 AS-GR-인산; SB9.5, pH가 9.5에서 염색 버퍼; SB8.2, pH가 8.2에서 염색 버퍼; TT8.2, pH가 8.2에서 트리스 - 트윈 버퍼.

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Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

우리는 색의 침전물을 대조하여 세 가지 다른 mRNA의 분포 패턴의 동시 특정 검출을 허용 그대로 초파리 배아에서 멀티 타겟 발색 전체 마운트 현장 하이브리드에 (MC-WISH) 절차를 설명합니다.

멀티 타겟 원체 전체 마운트<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드에서 유전자 발현의 도메인을 비교<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

11.4K 조회수.  Stockholm University.  우리는 색의 침전물을 대조하여 세 가지 다른 mRNA의 분포 패턴의 동시 특정 검출을 허용 그대로 초파리 배아에서 멀티 타겟 발색 전체 마운트 현장 하이브리드에 (MC-WISH) 절차를 설명합니다. 

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High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

높은 해상도 교 잡 형광 제자리에 초파리 태아와 Tyramide 신호 증폭을 사용 하 여 조직에서

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

연구

유전학

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

단단히 준비 초기 초파리 배아에서 게놈 넓은 Chromatin 구조 캡처 라이브러리의 생성

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

생물학

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of embryogenesis, these organelles undergo dramatic movements powered by actin-based cytoplasmic streaming and motor-driven trafficking along microtubules. The development of a multitude of small, organelle-specific fluorescent probes (FPs) makes it possible to visualize a wide range of different lipid-containing structures in any genotype, allowing live imaging without requiring a genetically encoded fluorophore. This protocol shows how to inject vital dyes and molecular probes into Drosophila embryos to monitor the trafficking of specific organelles by live imaging. This approach is demonstrated by labeling lipid droplets (LDs) and following their bulk movement by particle image velocimetry (PIV). This protocol provides a strategy amenable to the study of other organelles, including lysosomes, mitochondria, yolk vesicles, and the ER, and for tracking the motion of individual LDs along microtubules. Using commercially available dyes brings the benefits of separation into the violet/blue and far-red regions of the spectrum. By multiplex co-labeling of organelles and/or cytoskeletal elements via microinjection, all the genetic resources in Drosophila are available for trafficking studies without the need to introduce fluorescently tagged proteins. Unlike genetically encoded fluorophores, which have low quantum yields and bleach easily, many of the available dyes allow for rapid and simultaneous capture of several channels with high photon yields.

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

In the early Drosophila embryo, many organelles are motile. In principle, they can be imaged live via specific fluorescent probes, but the eggshell prevents direct application to the embryo. This protocol describes how to introduce such probes via microinjection, and then analyze bulk organelle motion via particle image velocimetry.

초파리 배아에서 지질 함유 소기관의 세포 골격 의존성 밀매 시각화

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

발생학

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

전체 산<em&gt; 현장에서</emE11.5 마우스 태아에 E8.5의&gt; 하이브리드

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

의 양적 비교 CIS</em트렌스 제닉에서> - 규제 요소 (CRE) 활동 Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

사용 염색질 Immunoprecipitation (CHIP) Drosophila 조직

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Multiplex Detection of Gene Expression in the Intact Drosophila Brain Using Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ within a given tissue remain limited. The EASI-FISH protocol described here has been adapted to detect the expression of dozens of genes in the intact adult Drosophila central nervous system (CNS) using commercially available reagents. This protocol includes a new gel formulation that enhances gel robustness, enabling multiple rounds of hybridization and allowing the embedding of multiple brains per gel. This improvement increases throughput, facilitates optimal comparison of experimental conditions, and reduces reagent costs. Additionally, by employing the GAL4-UAS system for co-detection of green fluorescent protein (GFP), gene expression can be visualized in specific neuronal or glial cell types. Notably, the high resolution achieved through expansion microscopy, combined with the sensitivity of the method, allows for the detection of single RNA transcripts. This approach effectively integrates high image quality with high throughput, making it a powerful tool for studying gene expression throughout the intact fly brain.

Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) is a robust technique that combines expansion microscopy with fluorescence in situ hybridization (FISH) to detect the expression of multiple genes in thick tissue. This protocol outlines recent advancements in the method and its adaptation for labeling the intact Drosophila central nervous system..

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ ...

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