Name: multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization for comparing gene expression domains in drosophila embryos
Uploaded: 2016-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos at JoVE.com

We thank our colleagues for cDNA plasmids for template generation. The authors' work is supported by the Swedish Cancer Foundation (CAN 2010/553), the Swedish Foundation for International Cooperation in Research and Higher Education (IG2011-2042) and the Knut and Alice Wallenberg Foundation (KAW2012.0058).

1. Etiquetado de sondas de ARN in vitro de transcripción <ol><li> Montar reacción de transcripción in vitro en un microtubo de 1,5 ml bajo-RNasa libre de condiciones: 10,5 l tratada con DEPC H 2 O, 4,0 l de 5x tampón de transcripción, 1,0 l (1 g) linealizado, plantilla de ADN purificado en tratada con DEPC H 2 O, 1,3 l de mezcla NTP, 0,7 l UTP marcado con hapteno, 0,5 l inhibidor de RNA RiboLock, 2,0 l ARN polimerasa. Nota: El volumen final de reacción es de 20 l. </li><li> Dependiendo de secuencia del promotor T7 uso de la plantilla, T3 o SP6 RNA polimerasa para la transcripción in vitro (véase la referencia 17). </li><li> Seleccione digoxigenina-11-UTP, biotina-16-UTP o fluoresceína-12-UTP como etiqueta para la sonda de ARN. Para más detalles, véase el análisis de hapteno etiquetas y concentraciones de sonda en la Discusión. </li><li> Mezclar reacción de transcripción y de girar en breve. </li><li> Deje transcribirdurante 3 horas a 37 ° C. </li><li> Añadir 1 l de DNasa libre de RNasa I de la reacción de transcripción para la eliminación de ADN molde, mezclar bien, y se incuba durante 15 min a 37 ° C. </li><li> Ajuste con tratada con DEPC H2O el volumen de muestra de 200 l. </li><li> Añadir 100 ml (0,5 vol) de acetato de amonio 7,5 M y 600 l (3 vol) de etanol para precipitar la sonda de ARN marcada. Incubar durante 30 min a TA. <ol><li> No use etanol helado, ya que esto puede conducir a la precipitación no deseada de nucleótidos no incorporados. </li></ol></li><li> Centrifugar el ARN transcrito en una centrífuga de temperatura controlada a velocidad máxima (20.800 xg) durante 30 min a 20 ° C. Aspirar cuidadosamente sobrenadante. </li><li> Lavar el sedimento resultante con etanol al 70% a temperatura ambiente y centrifugar a 20.800 xg durante 10 min a 20 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante y tener cuidado de no aspirar accidentalmente el sedimento suelto. Deje secar al aire de pellets en el microtubo con tapa abierta para unos pocos minutos a temperatura ambiente. </li><li> Disresolver el sedimento obtenido en 100 l de DEPC tratados con H 2 O. </li><li> Añadir 300 l de tampón de pre-hibridación (50% vol / vol de formamida desionizada, 5x SSC, 50 mg / ml de heparina sódica sal, 0,1% vol / vol Tween-20, 5 mg / ml de ARN torula) y almacenar a -20 ° C . Las sondas pueden ser a largo plazo se almacena a -20 ° C. Nota: Para obtener una primera prueba de la sonda diluida 3 l sonda de ARN hapteno marcado recién transcrito en 100 l de tampón de hibridación para obtener la concentración final para el experimento DESEO. </li></ol> 2. Tramitación de embriones muestras usando insertos Nota: El uso microtubos o placas de múltiples pocillos para el procesamiento de embriones a través de los diferentes pasos de incubación lleva el riesgo de perder cantidades significativas de embriones mediante la aspiración accidentalmente durante el intercambio de soluciones. Para evitar esta pérdida, puede ser útil usar cestas (tales como inserciones Netwell) para llevar muestras de embrión a través del procedimiento. Estos son poliestireno eninsertos con una malla de poliéster en la parte inferior (Figura 2A), en la que descansan los embriones durante el procesamiento. <ol><li> Para el procesamiento de los embriones en el procedimiento de DESEO, montar las inserciones en una placa de 12 pocillos (Figura 2B) y añadir 2 ml de la solución adecuada a cada pocillo. </li><li> Pipetear los embriones en los insertos utilizando una punta azul. Asegúrese de que todos los embriones se sumergen en un líquido. </li><li> Cuando el tiempo de incubación es sobre el lugar que contiene las inserciones de embriones en otra placa de 12 pocillos, que se llena con la solución para el siguiente paso. <ol><li> Utilice los transportistas y los mangos (Figura 2C) para transferir hasta 12 muestras a la vez de una solución a otra (Figura 2D). Nota: Para reducir los volúmenes requeridos, use ml microtubos 2.0 para las etapas de pre-hibridación / hibridación (véase el paso 4.1) y las placas de 24 pocillos para las reacciones de tinción (PASO 6.2). Las reacciones de hibridación y de tinción se llevan a cabo en volúmenes de 1001; l y 400 l, respectivamente. </li></ol></li></ol> 3. Preparación de embriones para la hibridación <ol><li> Recoger, dechorionate, corregir y devitellinize embriones utilizando procedimientos estándar 14,18. Los embriones preparados se almacenan habitualmente en metanol a -20 ° C. </li><li> Transferencia de embriones que se utilizarán para la hibridación in situ a TA y se distribuyen en los insertos de una placa de 12 pocillos con 2 ml lleno de metanol por pocillo. </li><li> Rehidratar embriones a través de una serie de metanol disminuyendo a RT. Incubar los embriones cada vez por 3 min en: (i) 75% de metanol en 1x PBS (ii) 50% de metanol en 1x PBS, 0,1% Tween-20 (iii) 25% de metanol en 1x PBS, 0,1% Tween-20 (iv ) 1x PBS, 0,1% Tween-20 (v) 1x PBS, 0,1% de Tween-20. </li><li> Pre-fijar los embriones en paraformaldehído al 4% en PBS 1x durante 20 min a RT. </li><li> Retire el fijador por 4 lavados durante 3 min en 1x PBS, 0,1% de Tween-20 a TA. Mientras tanto descongelar y preparar soluciones de trabajo de glicina proteinasa K y. </li><li&gt; Embriones permeabilizar en proteinasa K fresco (10 g / ml a 50 mg / ml) en 1X PBS, 0,1% de Tween-20 durante 3 min a RT. Nota: El tratamiento de proteinasa K es equilibrada con la fuerza de fijación del embrión. Por ejemplo, si se omite la etapa de pre-fijación (3.4), proteinasa K tratamiento más suave se puede aplicar. </li><li> Detener la reacción por dos enjuagues 1 min en 2 mg / ml de glicina en 1x PBS, 0,1% de Tween-20 a TA. </li><li> Post-fijar los embriones en paraformaldehído al 4% en PBS 1x durante 20 min a RT. </li><li> Posteriormente, retire fijador paraformaldehído por lavado cuatro veces durante 3 min en 1X PBS, 0,1% de Tween-20 a TA. </li><li> Embriones después de la fijada Transferencia de pre-hibridación buffer. Embriones de las tiendas en tampón de pre-hibridación a -20 ° C o directamente proceder con la hibridación de las sondas. </li></ol> 4. hibridación de sondas <ol><li> Transferencia de embriones almacenados a -20 ° C en tampón de pre-hibridación a RT. Distribuir embriones en tampón de pre-hibridación en microtub 2,0 mles. </li><li> Durante 30 min a un mínimo, pre-hibridan muestras de embriones a los 65 ° C en tampón de pre-hibridación. Nota: Para pre-hibridación y la hibridación pasos se utiliza un baño de agua. Durante la pre-hibridación hay tiempo para preparar la mezcla de la sonda mediante la combinación de hasta tres sondas de ARN antisentido, cada uno específico para un transcrito de gen diferente y marcada con un hapteno diferente. </li><li> Para obtener la mezcla de sondas, añadir cantidades juntas apropiadas (por lo general entre 1 l a 6 l) de cada antisentido sonda deseada original de hapteno marcado con RNA en tampón de hibridación 100 l (50% vol / vol de formamida desionizada, 5x SSC, 50 mg / ml sal de sodio de heparina, 0,1% vol / vol Tween-20, 5 mg / ml de ARN torula, 5% en peso / vol de dextrano sulfato). Nota: La adición de sulfato de dextrano es opcional. </li><li> Desnaturalizar la mezcla de sondas de ARN antisentido en un bloque de calor a 80 ° C durante 5 min. Posteriormente transferir la mezcla de sonda desnaturalizada directamente a 65 ° C. </li><li> Eliminar la mayor parte de la pre-hibridacióntampón de las muestras de embriones y añadir la mezcla de sonda desnaturalizada. </li><li> Deje que las muestras de embriones se hibridan a la sonda mezcla O / N a 65 ° C. Nota: Las temperaturas oscilan entre 55 ° C y 65 ° C se utilizan habitualmente para la hibridación, pre y post-hibridación pasos. La hibridación a 65 ° C proporciona condiciones más estrictas y se recomienda en caso de problemas de fondo al utilizar temperaturas más bajas. Si no hay problemas de fondo, hibridación a 55 ° C se recomienda, que proporciona la ventaja de una mayor intensidad de la señal y la mejora de la integridad del embrión. </li><li> A la mañana siguiente, primero transferir las soluciones de lavado rigurosidad a 65 ° C, para asegurarse de que se calientan a la temperatura correcta en el tiempo. </li><li> Transferencia de la hibridación de la sonda con la mezcla de los embriones de los microtubos de 2,0 ml en insertos de una placa de 12 pocillos que contenía 2 ml de tampón de lavado de hibridación precalentada (50% de formamida en 2 x SSC, 0,1% de Tween-20). Coloque la placa de 12 pocillos que contiene el emmuestras bryo en un horno y se incuban durante 20 minutos a 65 ° C. </li><li> Muestras de embriones Transferencia a 2 ml de tampón nuevo lavado de hibridación y se incuban durante 20 minutos a 65 ° C. Repita este paso una vez más. </li><li> Eliminar el exceso de sonda por 20 min lavados a 65 ° C, una vez en 2 x SSC, 0,1% de Tween-20 y tres veces en 0,2 x SSC, 0,1% de Tween-20. </li><li> Transferir las muestras de embrión a 1x PBS, 0,1% de Tween-20 a TA. </li><li> Incubar los embriones en tampón de bloqueo (8% de suero de ovejas en 1x PBS, 0,1% de Tween-20) durante al menos 30 min a TA. </li></ol> 5. Detección de anticuerpos de sondas marcadas con Hapteno Nota: En contraste con la hibridación simultánea de los tres sondas marcadas de forma diferente, cada sonda se detecta uno tras otro en rondas separadas de incubación de anticuerpos y la tinción. Por lo tanto, en cada ronda de detección sólo se utiliza un anticuerpo (ya sea anti-digoxigenina-AP o anti-fluoresceína-AP o anti-biotina-AP). <ol><li> Elija entre PASO5.1.1 a 5.1.3 y proceder con la preparación de la dilución de anticuerpo apropiado de acuerdo con la etiqueta hapteno que se va a detectar. Nota: Para la detección secuencial de las sondas marcadas de forma diferente, otro anti-hapteno-anticuerpo se aplica en cada ciclo de detección. <ol><li> Para la detección de una sonda marcada con fluoresceína diluido anti-fluoresceína-AP conjuga 1: 4000 en tampón de bloqueo. </li><li> Para la detección de una sonda marcada con digoxigenina diluir anti-digoxigenina-AP conjuga 1: 4000 en tampón de bloqueo. </li><li> Para la detección de una sonda marcada con biotina preparar una solución de conjugado anti-biotina-AP en una dilución 1: 4000 en tampón de bloqueo. </li></ol></li><li> Incubar los embriones en la solución anti-hapteno-AP seleccionado durante 3 a 4 horas a RT. Alternativamente, incubar O / N a 4 ° C. No aplique los tres anticuerpos simultáneamente. </li><li> Con el fin de eliminar el anticuerpo no unido lavar los embriones con 1x PBS, 0,1% de Tween-20 para 4 veces 15 min a TA. </li><li> Para cambiar los sistemas tampón seh dos veces 15 min a TA en TNT (0,1 M Tris-HCl pH 8,0, NaCl 0,1 M, 0,1% de Tween-20). </li></ol> 6. La tinción de fosfatasa alcalina cromogénico <ol><li> Con posterioridad a la detección de anticuerpos elegir entre PASO 6.1.1 a 6.1.4 y proceda con uno de los fosfatasa alcalina reacciones de tinción cromogénicos para obtener la señal de color deseado (ver Tabla 1). Para cada ronda de detección se aplica una reacción sustrato cromogénico diferente para resaltar cada patrón de transcripción en otro color. <ol><li> Fast Red tinción <ol><li> Lavar los embriones dos veces durante 15 min en TT8.2 (0,1 M Tris-HCl pH 8,2, 0,1% de Tween-20). </li><li> Mientras que lavar los embriones, preparar la solución de tinción Rojo Rápido Del Fast Red TR / NAMP fosfatasa alcalina sustrato Tablets Set. </li><li> Disolver una tableta de tampón desde el comprimido fijado en 1 ml de agua destilada y mezclar mediante agitación para obtener 0,1 M Tris-HCl pH 8,2. </li><li> Caída de una tableta Red TR / NAMP rápido en el preparado Tris tampón y se disuelven por agitación para obtener la solución Fast Red tinción. </li><li> Claro solución colorante Fast Red de partículas no disueltas a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras. </li></ol></li><li> Fast Blue Staining <ol><li> Lavar dos veces los embriones durante 15 min en tampón de tinción SB8.2 fresco (0,1 M Tris-HCl pH 8,2, NaCl 0,1 M, 0,05 M MgCl 2, 0,1% de Tween-20). </li><li> Mientras se lava embriones, preparar la solución de tinción con azul de Fast de 50 mg / ml Fast Blue BB (en DMF) y 50 mg / ml de fosfato de naftol (en DMSO) soluciones madre. </li><li> Recién preparar una solución azul BB rápida en 0,5 mg / ml en SB8.2. </li><li> Recién preparar una solución de fosfato de naftol separada en 0,5 mg / ml en SB8.2. </li><li> Añadir gota a gota la solución de fosfato de naftol preparado en la solución de Fast Blue BB bajo mezcla constante con un vórtice. La concentración de trabajo final resultante es 0,25 mg / ml para ambos componentes del sustrato. Nota: Diferente Fast naftol phosp Azul /combinaciones de odio resultan en tonos de colores diferentes (ver Tabla 1). </li></ol></li><li> BCIP / NBT tinción <ol><li> Lavar dos veces los embriones durante 15 min en tampón de tinción SB9.5 fresco (0,1 M Tris-HCl pH 9,5, NaCl 0,1 M, 0,05 M MgCl 2, 0,1% de Tween-20). </li><li> Para una señal cromogénico purpleblue, recién preparar solución de tinción BCIP / NBT añadiendo 1 l levamisol, 3,5 l BCIP y 4,5 l de NBT por ml de tampón de tinción SB9.5 y mezclar bien. </li></ol></li><li> INT tinción <ol><li> Lavar los embriones dos veces durante 15 min en tampón de tinción SB9.5 fresco. </li><li> Para una señal cromogénico yellowbrown, recién preparar solución de tinción INT añadiendo 1 l levamisol, 5 l Magenta-Phos y 5 l INT por ml de tampón de tinción SB9.5 y mezclar bien. Nota: Como alternativa, utilice 7,5 l / ml BCIP / INT solución colorante lista para su uso. </li></ol></li></ol></li><li> Para las muestras de embriones de transferencia de reacción de tincióna una placa de 24 pocillos. Incubar cada muestra en 400 l de la solución de tinción elegido en la oscuridad. </li><li> Monitorear ocasionalmente señal desarrollo bajo un microscopio estereoscópico. Detener la reacción de tinción cuando se obtiene la intensidad de la señal deseada y antes de que se observó significativa la señal de fondo. </li><li> Para detener la reacción cromogénico, transferir embriones teñidos en insertos de una placa de 12 pocillos que contenía 2 ml por pocillo TNT. Enjuague los embriones teñidos dos veces en TNT. </li><li> Lavar los embriones dos veces durante 10 minutos en 1 x PBS, 0,1% de Tween-20 a temperatura ambiente para eliminar el sustrato residual. </li></ol> 7. Anticuerpo Desmontaje / fosfatasa alcalina inactivación <ol><li> Eliminar el anticuerpo e inactivar la fosfatasa alcalina por incubación en 2 ml de solución de paro pH bajo (0,1 M glicina-HCl pH 2,2, 0,1% de Tween-20) durante 10 min a RT. </li><li> Enjuague durante 1 min con 2 ml de 1 × PBS, 0,1% de Tween-20 a TA. </li><li> Lavar 3 veces durante 3 min en 1 × PBS, 0,1% de Tween-20 a TA. </li></ol> 8. Segunda Ronda de Detección <ol><li> Para detectar el patrón de distribución de un segundo transcrito de proceder con la detección de anticuerpos de sondas de hapteno marcado con (STEP 5.1 a 5.4) usando conjugados anticuerpo-AP dirigidos en contra de la segunda etiqueta hapteno. </li><li> Realizar tinción cromogénico de fosfatasa alcalina (PASO 6/1 a 6/5) aplicar una combinación de sustrato que produce un color que contraste con el utilizado en la primera ronda de detección (para los colores disponibles véase la Tabla 1). </li><li> Retire segundo conjugado anticuerpo-AP como se describe en el PASO 7.1 a 7.3. </li></ol> 9. Tercera Ronda de Detección <ol><li> Con el fin de detectar el patrón de distribución de tercera transcripción, proceder a la detección de anticuerpos de sondas de hapteno marcado con (PASO 5.1 a 5.4) usando anticuerpo-AP conjugados específicos para la tercera etiqueta hapteno. </li><li> Realizar tinción cromogénico de fosfatasa alcalina (PASO 6/1 a 6/5) aplicar una combinación de sustrato que no era apnavegaban en las rondas anteriores de detección. Elige una reacción cromogénico que produce un color precipitar fáciles de distinguir de los de las dos rondas anteriores de detección (por la elección del color ver Tabla 1). </li></ol> 10. Montaje e Imagen <ol><li> Transferencia de embriones teñidos correctamente a 30% de glicerol en PBS y se incuba hasta que los embriones están completamente empapadas en la solución de glicerol. Ellos están bien equilibrados cuando se hunden hasta el fondo. </li><li> Embriones de traslado hasta el 70% de glicerol en H 2 O y permiten equilibrar a temperatura ambiente. Los embriones teñidos se pueden almacenar en 70% de glicerol a 4 ° C. </li><li> Para el montaje, la pipeta manchado embriones en una gota de glicerol 70% sobre un portaobjetos y sin tocar los espaciadores pegados a la corredera (Figura 3). Aplicar la hoja de la cubierta. </li><li> Ver embriones montada bajo un microscopio de disección. Mueva la hoja de la cubierta aplicada, de modo que los embriones giran a la orientación deseada. </li><li> Observar adecuadamenteembriones orientados en alta resolución (20X, 40X objetivos) bajo un microscopio compuesto con diferenciales óptica Interferencia contraste. </li><li> Captura imágenes con una cámara digital en color y ahorrar en el dispositivo de almacenamiento digital. </li></ol>

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J., Johnson, G. D., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+phosphatase-fast+red,+a+new+fluorescent+label.+Application+in+double+labelling+for+cell+cycle+analysis.">Alkaline phosphatase-fast red, a new fluorescent label. Application in double labelling for cell cycle analysis.</a> J Immunol Methods. 132 (1), 45-49 (1990).</li><li>Hauptmann, G., Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+alkaline+phosphatase-mediated+azo+dye+staining+for+dual+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish.">Application of alkaline phosphatase-mediated azo dye staining for dual fluorescent in situ hybridization in zebrafish.</a> Neuromethods. 99, In situ hybridization methods, 393-404 (2015).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems.">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev Biol. 11, 43 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La hibridación in situ (ISH) con sondas de ácido nucleico marcadas radiactivamente se utiliza a menudo para detectar la localización del ARN en secciones de tejido. El método ISH radiactivo, sin embargo, es mucho tiempo, menos sensible, y no permite que la apreciación de los patrones de distribución de la transcripción completa en enteros monturas. En contraste, el método MC-Wish aquí descrita permite la comparación directa de múltiples dominios de expresión génica en colores contrastantes dentro de embriones intactos. MC-DESEO tiene la ventaja de que el contexto histológico es evidente de inmediato y se visualizó simplemente por microscopía de campo claro estándar. Esto proporciona la posibilidad de relacionar los dominios de expresión de genes topográficamente entre sí con gran precisión y definir sitios únicos y solapados de expresión de una manera rápida y fiable. Por otro lado, ISH fluorescente multiplexado (FISH) es más potente con respecto a la sensibilidad y la resolución y se utiliza de preferencia, si celular o incluso re sub-celularSe requiere solución de la detección de mRNA. El amplio espectro de transcripciones que ha sido asignada por MC-Wish sugiere que virtualmente cualquier transcripción se puede analizar no sólo en embriones, sino también en los tejidos de larvas y adultos y en especies distintas de Drosophila. De hecho, el procedimiento descrito se detalla aquí por Drosophila, funciona de manera similar eficiente con embriones de pez cebra 11,16,22. Por otra parte, el método MC-DESEO puede adaptarse a una amplia variedad de invertebrados y vertebrados embriones y muestra de tejido. Hapteno etiquetas y concentraciones de sonda Utilizamos rutinariamente fluoresceína, digoxigenina, y biotina como etiquetas hapteno de sondas de ARN. Por otra parte, las sondas dinitrofenol marcado se pueden aplicar, que se han introducido en los experimentos de WISH de pez cebra 23-25. Sondas marcadas con fluoresceína muestran una menor sensibilidad en comparación con los otros hapteno-etiquetas, de modo que la fluoresceína se utiliza mejor fo la detección de abundantes transcripciones. Cada sonda recién transcrito se prueba primero en un solo experimento de WISH, donde se evalúa su rendimiento, ya sea usando BCIP / NBT o Fast Red como sustrato. Una concentración de la sonda se considera como óptimo cuando una señal fuerte sin desarrollo fondo se consigue en pocos minutos a horas. Para asegurarse de que los dominios de expresión de interés se han detectado en toda su extensión por MC-Wish, es esencial para visualizar cada patrón de transcripción por una sola etiqueta experimentos desea usando la combinación de sustrato más sensible, BCIP / NBT. Esto asegura que los dominios de expresión débiles no se pasan por alto en el experimento multi-objetivo. Para compensar la menor sensibilidad de las otras combinaciones de sustrato que es esencial para el uso duplicado (a) triplicado concentraciones de sonda en comparación con la tinción estándar de BCIP / NBT. Inactivación bajo pH El paso de inactivación pH bajo puede conducir adesintegración parcial de los híbridos RNA sonda / sentido de ARNm de hapteno marcado antisentido resultantes en la detección de señal reducida en la segunda y tercera rondas de tinción. Para minimizar la pérdida de la sensibilidad, los pasos de inactivación son tan cortos como sea posible. Hemos experimentado que un tiempo de incubación de 10 min a pH bajo es suficiente para la eliminación de la AP-actividad. Los lavados rápidos posteriores en grandes volúmenes garantizan una rápida dilución de no consolidados conjugados anticuerpo-AP y prevenir la re-unión de las sondas haptenizadas. Procedimientos alternativos incluyen la fijación de paraformaldehído y la inactivación de calor. Sin embargo, algunos de los precipitados de color no son estables al calor y la fijación de paraformaldehído puede no ser suficiente para la inactivación completa de AP. Inactivación incompleta de la primera aplicada conjugado anticuerpo-AP puede conducir a la re-visualización del patrón de mRNA en la siguiente ronda de detección que lleva a la superposición de falso positivo en la expresión con la segunda especie de ARNm para ser detectado. Por lo tanto, en un experimento de control THe embriones se dividen en dos fracciones después de la inactivación de la primera aplicada conjugado anticuerpo-AP. El segundo conjugado de anticuerpo-AP se omite de la fracción de control y no debe producir una señal en la segunda reacción de color. Sin embargo, si la segunda reacción de color genera un patrón de distribución de señal correspondiente a la primera uno, entonces el procedimiento de inactivación no fue eficiente. En este caso, el tiempo de incubación en solución de bajo pH parada debe prolongarse para el siguiente experimento. Órdenes de aplicación sustrato AP Dado que la sensibilidad disminuye con cada ronda subsiguiente de detección, es recomendable para detectar mRNAs menos abundantes antes de la más abundantes transcripciones. Además, las combinaciones de sustrato Fast Blue Fast Red y son significativamente menos sensible que el BCIP purpleblue / NBT mancha, de modo que los colorantes se aplican preferiblemente Fast en la primera ronda de tinción para la detección de la transcripción expresado más fuerte. Esto también hcomo la ventaja de que la tinción BCIP / NBT posterior se puede controlar y se detuvo en el tiempo antes de la señal purpleblue pone demasiado oscura en relación con los colorantes Fast más ligeros. Así, en un experimento de dos de color estándar, primero la más fuerte de ARNm expresado es detectado por Fast Red y segunda la más débil por BCIP / NBT. Como alternativa a los colorantes Fast las combinaciones de sustrato INT amarillas pueden ser aplicadas, que sin embargo producen precipitados que se convierten difunden después de algún tiempo. Por lo tanto BCIP / INT se aplica exclusivamente en la última ronda de la tinción. En consecuencia, en un experimento de tres colores que utilizamos a menudo, una combinación de sustrato INT segundo BCIP / NBT (o Fast Blue) y tercero primera Fast Red. Tenga en cuenta que es recomendable para fotografiar embriones manchadas tan pronto como sea posible al aplicar INT. Detección fluorescente de colorantes azoicos Puede ser a veces difícil de reconocer patrones de expresión se superponen cuando un precipitado de color más oscuro está sombreado uno más ligero. Fo ejemplo, un fuerte desarrollo precipitado BCIP / NBT puede enmascarar las señales de colorante Fast más ligeros. Una forma de solucionar este problema es capturar imágenes inmediatamente después de cada mancha y eliminar el precipitado de color aplicada antes de la próxima ronda de detección. En este caso, colorante azoico soluble en alcohol (Fast Red) e INT precipitados se eliminan mediante lavados con etanol después de la primera y segunda rondas de detección, respectivamente, y la tinción de BCIP / NBT se aplica como el último sustrato AP-26. Otra posibilidad es tomar ventaja de las propiedades fluorescentes de los colorantes azoicos. Fast Red se puede visualizar utilizando el filtro de rodamina establece 27, mientras que Fast Blue se puede observar con filtros de rojo lejano 28,29. Comparación o de superposición de imágenes cromogénicos y fluorescentes pueden revelar el lugar de co-distribution.Using este enfoque, el desarrollo señal de BCIP / NBT tiene que ser detenido en el tiempo, de modo que no se haga demasiado densa y apagar la señal fluorescente del colorante azo producto de reacción.

La hibridación in situ (ISH) es el método estándar para la detección y localización de los transcritos de ARN en un contexto morfológico, dentro de las células, tejidos y organismos 1. Las señales producidas por el procedimiento de ISH son comúnmente visualizaron mediante sistemas de detección radiactivas, fluorescentes y cromogénicos. En los últimos años los avances tecnológicos significativos en ISH fluorescente (FISH) 2 como resultado mejorado dramáticamente sensibilidad y resolución, lo que permite la detección y cuantificación de la expresión de ARN en una sola célula y los niveles subcelulares y visualización de ARN hasta moléculas individuales 3,4 .Mientras métodos sofisticados de FISH de una sola molécula se utilizan para aplicaciones más especializadas, ISH cromogénico es generalizada como un RNA de rutina en el método de detección in situ en la investigación y el diagnóstico clínico. Para la detección cromogénico se utilizan reacciones enzima precipitación, que generan productos visibles en colores contrastantes en los sitios5 de la hibridación. Esto tiene la ventaja de que la visualización de ARN se puede combinar con tinciones histológicas de rutina y el contexto morfológico es inmediatamente evidente por microscopía de campo claro estándar. Por otra parte, numerosos de los sustratos de color aplicadas producen precipitados, que son estables en medios de montaje orgánicos y / o acuosos, por lo que las preparaciones permanentes de muestreo se pueden obtener 5. En Drosophila, los protocolos de ISH iniciales aplicadas sondas marcados con radioisótopos para la detección de la transcripción del material seccionado 6. Si bien es difícil de reconstruir a partir de secciones de tejido patrones de transcripción completos de embriones enteros o sistemas de órganos, la aplicación de procedimientos cromogénicos ISH con sondas no marcadas radiactivamente hace posible detectar distribuciones globalmente el ARN en los montajes enteros-7. Aunque existen muchas variaciones de ISH cromogénico, en el típico todo el montaje hibridación in situ los protocolos (ojalá) hybsondas de hapteno marcado con ridized son detectados por anticuerpos anti-hapteno conjugado a una enzima informadora y transcritos de ARNm se visualizaron mediante un cromógeno precipitante. La paleta de precipitados de diferentes colores producidos por el reportero enzimas de fosfatasa alcalina (AP), peroxidasa de rábano picante (POD), y beta-galactosidasa (GAL) permite para la detección distintivo de múltiples dianas en una y la misma muestra de 8-14. Sin embargo, la actividad enzimática POD dura sólo durante un período de tiempo limitado y la reacción colorimétrica GAL es algo menos sensible, por lo que sin amplificación adicional (tiramida) de señal 15 la detección de menos abundantes transcripciones puede ser un reto con estas enzimas. En contraste, la actividad permanente de AP permite de larga duración renovación del sustrato y de alta relación señal-ruido. Por lo tanto, la detección secuencial usando AP enzima informadora con sustratos de diferente color ha demostrado ser exitoso en el eficaz ydetección distintivo de hasta tres transcripciones diferentes en embriones individuales 10-12,16. Por esta multi-objetivo DESEO cromogénico (MC-DESEO) método (Figura 1) 14, sondas de ARN antisentido etiquetadas son generados por la transcripción in vitro y marcados con una de las hapteno-etiquetas disponibles. Los embriones son formaldehído fijos y permeabilized por tratamiento con metanol y proteinasa K digestión. La hibridación de los embriones se lleva a cabo simultáneamente con hasta tres sondas de ARN antisentido marcadas de manera diferente cada específicos para un gen diferente. Después de retirar la sonda no unida por lavados de rigurosidad cada etiqueta hapteno se visualiza en una ronda separada de detección. Una sola ronda de detección consiste en la incubación de embriones con un anticuerpo anti-hapteno acoplado a AP y visualización de ARN mediante la aplicación de un AP-sustrato que produce un precipitado de color estable localizada. Después de la detección de anticuerpos y la tinción, el conju anticuerpo-AP aplicadopuerta se elimina mediante un lavado de pH bajo. En experimentos multicolores, cada ronda de detección emplea un anticuerpo dirigido contra un hapteno-etiqueta diferente y cada patrón de transcripción se visualiza por un sustrato de color diferente (Tabla 1). Los embriones se montan en glicerol y la imagen en el microscopio compuesto de alta resolución usando contraste de interferencia diferencial (DIC) óptica.

<table><tbody><tr><td>Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0603</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0111</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0101</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0131</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>DNase I, RNase-free&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>NTP Set</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-UTP</td><td>Roche</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-12-UTP</td><td>Roche</td><td>11427857910</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-16-UTP</td><td>Roche</td><td>11388908910</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium acetate</td><td>Applichem</td><td>A2936</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, absolute&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>di-Sodium hydrogen phosphate</td><td>Scharlau</td><td>SO0339</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dihydrogen phosphate</td><td>Scharlau</td><td>SO0331</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>tri-Sodium citrate</td><td>Scharlau</td><td>SO0200</td><td></td></tr><tr><td>deionized formamide</td><td>Applichem</td><td>A2156</td><td></td></tr><tr><td>RNA type VI from torula yeast</td><td>Sigma</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Applichem</td><td>A3004</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfate sodium salt</td><td>Sigma</td><td>D6001</td><td></td></tr><tr><td>Sheep serum</td><td>Sigma</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>Sheep anti-biotin-AP Fab fragments&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11426303001</td><td></td></tr><tr><td>Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11426303001</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody</td><td>Vector laboratories</td><td>MB-3100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane</td><td>Scharlau</td><td>TR04241000</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Scharlau</td><td>MA0036</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Scharlau</td><td>SO0227</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Applichem</td><td>A3006</td><td></td></tr><tr><td>Fast Red tablet set</td><td>Sigma</td><td>F4648</td><td></td></tr><tr><td>Fast Blue BB salt</td><td>Sigma</td><td>F3378</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol-AS-MX-phosphate</td><td>Sigma</td><td>N5000</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol-AS-GR-phosphate</td><td>Sigma</td><td>N3625</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol-AS-BI-phosphate</td><td>Sigma</td><td>N2250</td><td></td></tr><tr><td>Magenta-Phos</td><td>Biosynth</td><td>B7550</td><td></td></tr><tr><td>INT</td><td>Sigma</td><td>I8377</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Applichem</td><td>A1243</td><td></td></tr><tr><td>BCIP</td><td>Applichem</td><td>A1117</td><td></td></tr><tr><td>INT/BCIP solution</td><td>Roche</td><td>11681460001</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol 86-88%</td><td>Scharlau</td><td>GL0023</td><td></td></tr><tr><td>Universal incubator</td><td>Memmert</td><td>BE400</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Memmert</td><td>WB14</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>Grant</td><td>QBT2</td><td></td></tr><tr><td>Netwell&amp;nbsp; inserts 15 mm</td><td>Corning</td><td>3477</td><td></td></tr><tr><td>Netwell carrier kit 15 mm</td><td>Corning</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>12-well cell culture plate</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microtube</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml microtube</td><td>Sarstedt</td><td>72.691</td><td></td></tr></tbody></table>

multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization for comparing gene expression domains in drosophila embryos

Para analizar genes redes reguladoras activas durante el desarrollo embrionario y la organogénesis es esencial para definir con precisión cómo los diferentes genes se expresan en relación espacial entre sí in situ. Multi-objetivo cromogénico todo el montaje hibridación in situ (MC-DESEO) facilita en gran medida en el instante en comparación de los patrones de expresión de genes, ya que permite la visualización distintiva de las diferentes especies de ARNm en colores contrastantes en el mismo espécimen de muestra. Esto proporciona la posibilidad de relacionar los dominios de expresión génica topográficamente entre sí con gran precisión y definir los sitios de expresión únicos y solapados. En el protocolo presentado, se describe un procedimiento de MC-Wish para comparar los patrones de expresión de mRNA de diferentes genes en embriones de Drosophila. Hasta tres sondas de ARN, cada uno específico para otro gen y etiquetado por un hapteno diferente, son simultáneamente hibridado a las muestras de embrión y posteriormente detectado por medio de álcaline-fosfatasa basa inmunohistoquímica colorimétrico. El procedimiento descrito se detalla aquí para Drosophila, pero funciona igual de bien con embriones de pez cebra.

El protocolo descrito permite para la visualización simultánea de múltiples patrones de transcripción en diferentes colores. MC-Wish proporciona la ventaja de comparar directamente los patrones de expresión de genes diferentes en el mismo embrión. A modo de ejemplo, los patrones de expresión de espiráculos vacías (ems) 19, fushi tarazu (Zona Franca) 20 y descuidado emparejado 1 (SLP1) 21 se comparan directamente en Drosophila blastoderm melanogaster embriones de etapa y se visualizan en una variedad de tonos de color (Figura 4) . Diferentes combinaciones de sustrato de AP están disponibles para obtener un panel de contraste precipitados de color (Tabla 1). El precipitado de color rojo producido por Fast Red y el precipitado de color púrpura producido por BCIP / NBT puede distinguirse fácilmente y por lo tanto se utilizan más comúnmente en los experimentos de dos colores (Figura 4A). Sin embargo, la mancha BCIP / NBT puede convertirse rápidamente en un color bastante oscuro, de modo que el color Fast Red se disfraza en caso de co-distribución parcial de transcripciones. Por lo tanto, la aplicación de Fast Blue puede ser una ventaja, que genera azules, productos verdes y violetas en combinación con NAMP, NAGP y NABP, respectivamente (Tabla 1). La combinación de azul rápido con NAMP da un color azul claro que es fácilmente discernible del producto Fast Red en los dominios de expresión adyacentes o superpuestos como se muestra aquí por ems y sitios de expresión SLP1 visualizados en rojo y azul, respectivamente (Figura 4B). La combinación Fast Blue NAGP proporciona un fuerte contraste similar a la mancha Fast Red, de modo que el dominio ems verde es claramente distintiva desde el sitio de expresión SLP1 rojo (Figura 4C). Sin embargo, si el ccsme y sitios de expresión SLP1 se dèprotegidos por Fast Blue NABP y Fast Red, respectivamente, el violeta resultante y precipitados de color rojo son menos discernible (Figura 4D). Como se mencionó anteriormente, Fast Red y Fast Blue NAGP son fáciles de distinguir como lo demuestra SLP1 y expresión Zona Franca en rojo y verde, respectivamente (Figura 4D). MagentaPhos en combinación con INT produce un precipitado amarillo, que se utiliza para revelar la expresión segmentaria de FTZ (Figura 4C, E). El precipitado de color amarillo genera buen contraste con los sustratos de color azul como se ejemplifica por la detección de SLP1 y Zona Franca con Fast Blue NAMP y MAG / INT, respectivamente (Figura 4E). Sin embargo, el precipitado de color amarillo es menos fácil discernible a partir del producto Fast Red. El dominio de expresión manchada amarilla de ems puede ser apenas disti<html> nguished de la expresión rostral del SLP1 muestra en rojo (Figura 4F). Por lo tanto, la combinación de sustratos de color tiene que ser cuidadosamente elegido para cada experimento. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama de flujo de MC-Wish. Para la visualización multicolor de tres patrones de transcripción únicas, elegir entre diferentes conjugados anticuerpo-AP y combinaciones de sustrato de color en cada ciclo de detección. Abreviaturas: AP, fosfatasa alcalina; BIO, biotina; DIG, digoxigenina; FLUO, fluoresceína. Para otras abreviaturas ver leyendas a la figura 4 y en la Tabla 1. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53830/53830fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> s / ftp_upload / 53830 / 53830fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Los insertos como portadores embrión. (A) Insertos instalados en la parte inferior con las membranas de poliéster de 15 mm de diámetro y 74 micras tamaño de malla se utilizan como portadores de embrión de Drosophila. (B) Los insertos se montan en placas de 12 pocillos, que funcionan como bandejas de depósito para las diferentes soluciones. (C) los transportistas y las manijas disponibles permiten el procesamiento de (D) 12 inserciones / muestras de embriones a la vez. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53830/53830fig2large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig3.jpg" /> Figura 3. Montaje de embriones teñidos. Los embriones se montan en una gota de 70% de glicerol entre dos pilas de cubreobjetos, que funcionan como espaciadores. Movimiento suave de la aplicaciónmentido gran cubreobjetos ayuda a girar los embriones montados en la orientación deseada para la observación y fotografía. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53830/53830fig3large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig4.jpg" /> Figura 4. Visualización multicolor de las transcripciones de ARNm en embriones de Drosophila. Ejemplos de experimentos MC-Wish en embriones de Drosophila se muestran de vistas laterales. Los patrones de expresión de ARNm de espiráculos vacías (EMS), fushi tarazu (ZLC) y descuidado emparejado 1 (SLP1) se visualizan por diferentes combinaciones de color de sustrato de AP, que se indican en cada panel. Las transcripciones fueron detectados por (A) Zona Franca FLUO y ems DIG, ( <strong&gt; B) SLP1 FLUO, ems BIO y DIG Zona Franca, (C) ems BIO, SLP1 FLUO y DIG Zona Franca, (D) PERFIL Zona Franca, SLP1 FLUO y ems DIG, (E) SLP1 FLUO, ems DIG, y Zona Franca BIO, (F) PERFIL Zona Franca, SLP1 FLUO y ems DIG marcado sondas. Las sondas hapteno marcado fueron immunohistochemically detectado uno tras otro en las órdenes mencionadas. Abreviaturas: FB Azul rápida; FR, tableta Fast Red. Para otras abreviaturas ver leyendas a la figura 1 y en la Tabla 1. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53830/53830fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Combinación de sustrato </td><td> Añadir a 1 ml de tampón de AP </td><td> Concentration [g / ml] </td><td> Tampón AP </td><td> Color </td><td> Sensibilidad de la señal </td></tr><tr><td> BCIP NBT </td><td> 3,5 l 4,5 l </td><td> 175 337.5 </td><td> SB9.5 </td><td> morado </td><td> +++ </td></tr><tr><td> INT MAG </td><td> 5 l 5 l </td><td> 250 250 </td><td> SB9.5 </td><td> amarillo </td><td> + </td></tr><tr><td> Solución madre BCIP / INT </td><td> 7.5 l </td><td> 250 250 </td><td> SB9.5 </td><td> amarillo </td><td> + </td></tr><tr><td> Fast Blue NAMP </td><td> 5 l 5 l </td><td> 250 250 </td><td> SB8.2 </td><td> azul </td><td> ++ </td></tr><tr><td> Fast Blue NABP </td><td> 20 l 10 l </td><td> 1000 500 </td><td> SB8.2 </td><td> violeta </td><td> ++ </td></tr><tr><td> Fast Blue NAGP </td><td> 10 l 10 l </td><td> 500 500 </td><td> TT8.2 </td><td> verde </td><td> + </td></tr><tr><td> Fast Red NAMP </td><td> 1 comprimido </td><td> 1000 400 </td><td> TT8.2 </td><td> rojo </td><td> ++ </td></tr></tbody></table> Tabla 1. combinaciones de sustrato Abreviaturas: +++, fuerte;. ++, Medio; +, Débil NBT, cloruro de 4-nitro-azul de tetrazolio; BCIP, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato; INT, 2- (4-yodofenil) -3- (4-nitrofenil) -5-fenil-tetrazolio cloruro; MAG, Magenta-Phos, 5-bromo-6-cloro-3-indolil-fosfato, NAMP, naftol-AS-MX-fosfato; NABP, naftol-AS-BI-fosfato; NAGP, naftol-AS-GR-fosfato; SB9.5, tampón de tinción a pH 9,5; SB8.2, tampón de tinción a pH 8,2; TT8.2, tampón Tris-Tween a un pH de 8,2.

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Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Se describe un montaje de todo el hibridación in situ procedimiento multi-objetivo cromogénico (MC-DESEO) en embriones de Drosophila intactos permitiendo la detección simultánea y específica de tres patrones de distribución de ARNm diferentes contrastando precipitados de color.

Multi-objetivo Cromogénico Todo el montaje<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación para comparar dominios de expresión génica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

multi-target-chromogenic-whole-mount-situ-hybridization-for-comparing

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

11.4K vistas.  Stockholm University.  Se describe un montaje de todo el hibridación in situ procedimiento multi-objetivo cromogénico (MC-DESEO) en embriones de Drosophila intactos permitiendo la detección simultánea y específica de tres patrones de distribución de ARNm diferentes contrastando precipitados de color. 

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High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

Alta resolución fluorescente In Situ hibridación en embriones de Drosophila y tejidos utilizando amplificación de la señal de Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Investigación

Genética

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

Generación de bibliotecas de captura de conformación de genoma cromatina desde etapas bien tempranas embriones de Drosophila

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biología

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Pez cebra todo el montaje de alta resolución doble fluorescente In Situ La hibridación

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of embryogenesis, these organelles undergo dramatic movements powered by actin-based cytoplasmic streaming and motor-driven trafficking along microtubules. The development of a multitude of small, organelle-specific fluorescent probes (FPs) makes it possible to visualize a wide range of different lipid-containing structures in any genotype, allowing live imaging without requiring a genetically encoded fluorophore. This protocol shows how to inject vital dyes and molecular probes into Drosophila embryos to monitor the trafficking of specific organelles by live imaging. This approach is demonstrated by labeling lipid droplets (LDs) and following their bulk movement by particle image velocimetry (PIV). This protocol provides a strategy amenable to the study of other organelles, including lysosomes, mitochondria, yolk vesicles, and the ER, and for tracking the motion of individual LDs along microtubules. Using commercially available dyes brings the benefits of separation into the violet/blue and far-red regions of the spectrum. By multiplex co-labeling of organelles and/or cytoskeletal elements via microinjection, all the genetic resources in Drosophila are available for trafficking studies without the need to introduce fluorescently tagged proteins. Unlike genetically encoded fluorophores, which have low quantum yields and bleach easily, many of the available dyes allow for rapid and simultaneous capture of several channels with high photon yields.

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

In the early Drosophila embryo, many organelles are motile. In principle, they can be imaged live via specific fluorescent probes, but the eggshell prevents direct application to the embryo. This protocol describes how to introduce such probes via microinjection, and then analyze bulk organelle motion via particle image velocimetry.

Visualización del tráfico dependiente de citoesqueletos de orgánulos que contienen lípidos en embriones de Drosophila

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Biología del Desarrollo

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Todo el monte In Situ La hibridación de E8.5 a E11.5 embriones de ratón

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Comparación cuantitativa de Cis-Elemento regulador (CRE) Las actividades de transgénicos Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP), utilizando Drosophila Tejido

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Todo el monte ARN fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Multiplex Detection of Gene Expression in the Intact Drosophila Brain Using Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ within a given tissue remain limited. The EASI-FISH protocol described here has been adapted to detect the expression of dozens of genes in the intact adult Drosophila central nervous system (CNS) using commercially available reagents. This protocol includes a new gel formulation that enhances gel robustness, enabling multiple rounds of hybridization and allowing the embedding of multiple brains per gel. This improvement increases throughput, facilitates optimal comparison of experimental conditions, and reduces reagent costs. Additionally, by employing the GAL4-UAS system for co-detection of green fluorescent protein (GFP), gene expression can be visualized in specific neuronal or glial cell types. Notably, the high resolution achieved through expansion microscopy, combined with the sensitivity of the method, allows for the detection of single RNA transcripts. This approach effectively integrates high image quality with high throughput, making it a powerful tool for studying gene expression throughout the intact fly brain.

Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) is a robust technique that combines expansion microscopy with fluorescence in situ hybridization (FISH) to detect the expression of multiple genes in thick tissue. This protocol outlines recent advancements in the method and its adaptation for labeling the intact Drosophila central nervous system..

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ ...

Multi-objetivo Cromogénico Todo el montaje

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