이 프로젝트에 대 한 지원 자금 건강 연구의 캐나다 학회 (청소 133473 부여)에 의해 HMK에 교부 금에 의해 제공 했다.

<ol>
	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li><li>Hughes, S. C., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+labeling+with+fluorescence+in+situ+hybridization+in+Drosophila+whole-mount+embryos.">Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos.</a> Biotechniques. 24, 530-532 (1998).</li><li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li><li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li><li>Raap, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-sensitive+FISH+using+peroxidase-mediated+deposition+of+biotin-+or+fluorochrome+tyramides.">Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides.</a> Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).</li><li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues.">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).</li><li>Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , 1-9 (2010).</li><li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+mRNA+Localization+in+Animal+Cells+and+Why+It+Matters.">Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li><li>Martin, K. C., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+Localization:+Gene+Expression+in+the+Spatial+Dimension.">mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension.</a> Cell. , 719-730 (2009).</li><li>Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+and+pervasive+subcellular+distributions+for+both+coding+and+long+noncoding+RNAs.">Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs.</a> Genes Dev. 30, 594-609 (2016).</li><li>Zhou, X. L., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+kidney+tubules.">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules.</a> Dev Biol. 271, 322-338 (2004).</li></ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다.

설명된 프로토콜 고정 초파리 배아 또는 조직에서 대부분 RNAs의 검출에 대 한 매우 민감한, 재현 하 고 경제적인 방법을 제공 한다. 전통적으로 프로브 탐지의 알칼리 성 인산 가수분해 효소 방법의 사용 하는 더 많은 것 보다 약간 더 복잡 하지만 물고기에 의해 얻은 해상도 훨씬 더 큰 하 고 감도 비교 또는 향상 7,8. 전체 또는 일부 결정 플레이트를 사용 하 여 관심사의 유전자의 대규모 또는 제한 된 분석에 대 한 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 프로브 생성 모두를 검색할 수 있습니다 또는 프로브는 좀 더 구체적으로 설계 된 하지 않는 한 여러 성적 결합 형성에 주목 해야 한다 (즉, 단일 exons). 우리는 작은 적당 한 성공 가진 200 뉴클레오티드 프로브 테스트, 비록 작은 프로브 덜 효과적일 하는 경향이 하 고 덜 특정 수 있습니다. 명확 하 게,이 프로토콜 microRNAs 처리 또는 작은 introns, exons의 검출에 적합 하지 않습니다.
이 이렇게 효소 단계를 사용 하 여 신호 강도 향상, 하지만 신호 강도 비례 식 레벨의 비교적 선형이 고 광범위 한 범위에서 대상 유전자 발현 하 것 처럼 보인다. 더 높은 확대, 신호 puncta 또는 얼룩으로 볼은 세포와 조직 내에서. 비교적 드문 성적 증명서에 대 한 몇 가지 작은 puncta 볼 수 있습니다. 사본 풍부 하 게 증가 함에 따라이 수와 크기에서 성장 한다. 단일 분자 물고기 (smFISH), 것과 같이 단일 작은 puncta 단일 RNAs에 해당 또한 수 고 한다 또한 쉽게 측정할 수 이미징 및 정보학 소프트웨어를 사용 하 여. 동일한 대상에 대 한 우리 큐레이터 이미지와 함께 smFISH를 사용 하 여 얻은 게시 된 이미지의 비교 제안이 더 엄격한 비교 하 여 테스트 해야 하지만 전반적으로, 감도 및 해상도 두 가지 방법의 상대적으로 비슷한는. SmFISH의 훨씬 더 높은 비용을 감안할 때, 여기에 제공 된 메서드는 비용의 일부분에서 비슷한 결과 주어 야 한다. 그러나, 목표는 작은 성적표 또는 성적 증명서의 부분을 검출 하는, smFISH 것이 좋습니다.
일부 물고기 프로브 작은 크기 때문에이 메서드는 대형 또는 중요 한 장벽을 관통 조직에서 더 나은 수도 있습니다. 그러나, 높은 세제 수준 및 조직 고정 및 permeabilization 조작의 사용이이 문제를 해결 하려면 나타납니다. 마지막으로, 초파리 조직 개발, 해 부 조직에 대 한 여기에 설명 된 높은 세제 버퍼 초파리 배아로 대부분 다른 유기 체와 조직에 대 한 또한 작동 해야 한다.

RNA-seq 같은 새로운 RNA 게놈 넓은 탐지 방법 우리의 지식과, 유전자 표현는 언제, 어디의 무슨 레벨1에서 크게 확대. 그러나,이 상대적으로 가난한 시간적, 공간적 해상도 제공합니다. RNA 제자리 교 잡에 따라서 세포 및 subcellular 지 방화2의 세부 사항을 공개 고정 조직, 시각적으로 관찰 기록의 공간 배급을 허용 한다. 형광 성 제자리 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 더 많은 공간 해상도를 confocal 빛 시트 현미경3같은 강력한 현미경 검사 법 기술의 사용을 허용 수 있습니다. DAPI 같은 형광 마커 subcellular 관계4설정에 사용할 수 있습니다. 물고기는 또한 subcellular 수준에서 중복의 명확한 표시와 동시에 여러 개의 RNAs 단백질의 관측을 촉진 한다. 독특한 시 약 및 더블 라벨에 필요한 단계는 다음 참조3,5에서 찾을 수 있습니다.
여기에 설명 된 절차 96 잘 결정 플레이트 cDNA 템플릿 생산 (식민지 PCR), RNA 프로브 생산 (T7, T3 또는 SP6 중 합 효소 종속 실행 전사 사용) 에서 제자리 교 잡를 포함 하 여 모든 단계에 대 한 활용 및 형광 신호 개발입니다. 충분 한 수의 배아 또는 조직 각각에 추가 됩니다 수 있도록 일관성과 다양성의 평가 96 잘 접시의 잘. 각 그럼 다른 조사를 받습니다. 신호 개발 후 배아 또는 각 우물에서 조직 현미경 분석에 대 한 개별 현미경 슬라이드에 짓고 있다.
프로브 탐지를 위한 tyramide 신호 증폭 (TSA)를 사용 하 여 뛰어난 subcellular 해상도 5,6,,78강력한 신호를 생성합니다. RNAs의 subcellular 지 방화 발생 하는 거의 모든 RNAs 4,,1011에 표시 되는 중요 한 규제 메커니즘 9 입니다. 이 분석에서는 RNA-seq에 의해 검색 되지 않은 많은 성적은 쉽게 물고기 8에서 검색도 나타났습니다. RNA 교 잡 제자리에서 96 잘 접시에 적응 한 번에 (추가 하는 경우 더 많은 접시를 사용), 큰 데이터 집합의 분석을 가능 하 게 관심의 최대 96 유전자의 분석을 수 있습니다. 작은 섹션으로 번호판을 절단 하 여 메서드는 단지 몇 가지 샘플을 쉽게 적응 됩니다. 제공 하는 프로토콜은 대부분의 유형의 조직에서 RNA 배포판의 분석에 적합 합니다. 표시 되지 않습니다, 그것은 비-초파리 조직으로 잘 적응할 수 있는입니다.

<table><tbody><tr><td>15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes</td><td>Frogga Bio</td><td>TB15-500</td><td>Certified DNase and RNase free</td></tr><tr><td>2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene)</td><td>Biomart (Canada)</td><td>141106-1K</td><td>Certified DNase and RNase free</td></tr><tr><td>50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes</td><td>Frogga Bio</td><td>TB50-500</td><td>Certified DNase and RNase free</td></tr><tr><td>96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane</td><td>EMD MILLIPORE</td><td>MSBVS1210</td><td>Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues</td></tr><tr><td>96-well PCR plate (200 &amp;mu;l)</td><td>Denville</td><td>C18096-10</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc syringe filter (0.2 u)</td><td>PALL</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc syringe filter (0.45 u)</td><td>PALL</td><td>PN4614</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA002.500</td><td></td></tr><tr><td>AXYGEN 96-well assay storage plates</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-P96-450V-C</td><td>To store bacterial glycerol stocks</td></tr><tr><td>AXYGEN Aluminum Plate Seals</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-PCR-AS-200</td><td>To seal plates</td></tr><tr><td>AXYGEN Wide-bore tips (200 ul)</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-T205-WB-C</td><td>To transfer samples</td></tr><tr><td>Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin</td><td>Jackson ImmunoResearch Lab</td><td>200062156</td><td>Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 &amp;mu;g/ml or 1/400 dilution.</td></tr><tr><td>BRAND 8-channel manifold (autoclavable)</td><td>BrandTech Scientific Inc.</td><td>704526</td><td>To remove liquids from the top of 96-well PCR plates</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C1919</td><td>Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2&amp;mu;m filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000)</td></tr><tr><td>Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA)</td><td>Home made</td><td></td><td>Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA</td></tr><tr><td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D2522</td><td>Antifade reagent in mounting media</td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-uridine-5&amp;rsquo;-triphosphate</td><td>Roche</td><td>11-209-256-910</td><td></td></tr><tr><td>Embryo collection cage</td><td>Home made</td><td>N/A</td><td>Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate</td></tr><tr><td>Eppendorf centrifuge 5804</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5804</td><td>Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Bioshop</td><td>FOR001.500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Bioshop</td><td>GLY002.4</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>GLN001.500</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784-250MG</td><td>Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution</td></tr><tr><td>Lab Armor Beads</td><td>DiaMed</td><td>LAA42370-001</td><td>Fill in heating unit</td></tr><tr><td>Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-998-347</td><td>Sample mixing</td></tr><tr><td>Mesh - 100 micons</td><td>FlyStuff</td><td>57-103</td><td>For collecting embryos</td></tr><tr><td>Mesh - 800 microns</td><td>SEFAR - Nytex</td><td>06-780/53</td><td>For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4.</td></tr><tr><td>Micro Cover Glasses</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>Size: 22 X 22 mm</td></tr><tr><td>Micro slides,frstd</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>Size: 25 X 75 mm</td></tr><tr><td>Multi-Well Plate Vacuum Manifold</td><td>Pall Corporation</td><td>P/N 5017</td><td>Remove liquid from bottom of 96-well filter plate</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Bioshop</td><td>PAR070.500</td><td>Fixation</td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Bio-Rad</td><td>Model: DNA Engine PTC-200</td><td>96-well plate PCR and probe denature</td></tr><tr><td>Picric acid solution</td><td>Sigma-aldrich</td><td>80456</td><td>For tissue fixation I solution</td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCL)</td><td>Bioshop</td><td>POC308</td><td></td></tr><tr><td>PP lid for 96-well plates, 100/case</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-P-LID-PP</td><td>Lid for storing plates</td></tr><tr><td>Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile)</td><td>UltiDent Scientific</td><td>825-1-50-5S</td><td>Liquid handling</td></tr><tr><td>Progene Pierceable Aluminum Foil</td><td>UltiDent Scientific</td><td>87-CFILM-AL</td><td>Seal 96-well plate, DNase and RNase free</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P2308- 5MG</td><td>Embryo permeabilization</td></tr><tr><td>RiboLock Ribonuclease Inhibitor</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td>40 Unit/ul</td></tr><tr><td>Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set</td><td>Roche</td><td>11277057001</td><td>RNA probe sythesis</td></tr><tr><td>RNase free water</td><td>GIBCO</td><td>10977015-500ml</td><td>RNA probe sythesis</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td>Remove RNase contamination</td></tr><tr><td>Single stranded DNA from salmon testes</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D9156</td><td>For hybridization solution</td></tr><tr><td>Skim milk (non fat power)</td><td>Bioshop</td><td>SKI400.500</td><td>Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent</td></tr><tr><td>Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free)</td><td>Bioshop</td><td>SAA333</td><td>Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation</td></tr><tr><td>SP6 RNA Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0131</td><td>20 Unit/ul</td></tr><tr><td>Stainless Steel Shot for Sand Bath</td><td>VWR</td><td>13259-274.</td><td>To fill the heating unit</td></tr><tr><td>Stereomicroscope &amp;amp; gooseneck light source</td><td>Leica</td><td>Model: MZ6</td><td>Tissue dissection and mounting</td></tr><tr><td>Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate</td><td>Molecular Probes</td><td>S911</td><td>Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 &amp;mu;g/ml) for in situ.</td></tr><tr><td>T3 RNA Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0101</td><td>20 Unit/ul</td></tr><tr><td>T7 RNA Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0111</td><td>20 Unit/ul</td></tr><tr><td>Tip station (10 ul)</td><td>Axygen</td><td>T-300-STK-S</td><td>Certified DNase and RNase free</td></tr><tr><td>Tip station (200 ul)</td><td>Sorbio</td><td>27770T</td><td>Certified DNase and RNase free</td></tr><tr><td>Tips ( 1ml)</td><td>Sorbio</td><td>10200</td><td>Certified DNase and RNase free</td></tr><tr><td>TRITON X-100</td><td>Bioshop</td><td>TRX506</td><td>Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop</td><td>TWN510</td><td>Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ</td></tr><tr><td>Whatman qualitative filter paper, Grade 3</td><td>Sigma-aldrich</td><td>WHA1003917</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Preparation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media</td><td></td><td></td><td>DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>1 X PBT (1L)</td><td></td><td></td><td>1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %)</td></tr><tr><td>1 X PBTT (1L)</td><td></td><td></td><td>1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %)</td></tr><tr><td>1 X PBTB (1L)</td><td></td><td></td><td>1 % Skim milk in 1 X PBT</td></tr><tr><td>1 X PBTTB (1L)</td><td></td><td></td><td>1 % Skim milk in 1 X PBTT</td></tr></tbody></table>

high resolution fluorescent in situ hybridization in drosophila embryos and tissues using tyramide signal amplification

표현의 패턴 및 초파리 게놈 넓은 기준 RNAs의 subcellular 지 방화를 결정 하기 위해 노력 하 고 다양 한 조직에에서, 우리 우리의 원래 형광 현장에 수많은 수정 및 향상 된 개발 했습니다. 교 잡 (물고기) 프로토콜. 처리량 및 비용 효율성을 촉진 하기 위하여 신호 검출 프로브 세대에서 모든 단계는 exon 결정 96 잘 접시를 사용 하 여 수행 됩니다. Digoxygenin (파)-이라는 antisense RNA 프로브 템플릿으로 게놈 DNA 또는 cDNA 클론을 사용 하 여 생산 됩니다. 조직 고정 permeabilization 후에, 프로브는 성적 관심에 때 교배 하 고 biotin, streptavidin 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)를 활용 하 고 붙일 활용에 활용 된 안티 발굴 항 체의 승계를 사용 하 여 검색 tyramide, HRP, 존재는 즉시 인접 한 단백질의 전자 밀도가 지역에는 반응성이 매우 높은 중급. 이러한 증폭 및 지역화 단계 두 세포 및 subcellular 사본 지역화를 용이 하 게 하는 강력 하 고 매우 지역화 된 신호를 생성 합니다. 제공 하는 프로토콜은 다양 한 조직 및 발달 단계에서에서 매우 구체적인 신호를 생산 하기 위해 최적화 되었습니다. 참조 또한 동시에 여러 성적 증명서 또는 성적 증명서 및 단백질의 동시 탐지를 허용 하는 추가 변이 대 한 제공 됩니다.

그림 6 은이 절차를 사용 하 여 얻은 결과의 예를 보여줍니다. 상위 3 패널 패널 표시 예제 늦게 신호 초파리 배아 (amnioserosa, 근육 및 중앙 신경 조직, 다른 조직에 초기 초파리 배아 (그림 6, 패널 A-C), 다음 3의 예를 보여 각각 (그림 6, 패널 D-F). 다음은 예제 3 탈피에서 애벌레 조직 (그림 6, 패널 G J)입니다. 성인 생식 기에서 대표 이미지를 표시 하는 패널 K와 L (난소와 고환, 각각). 수백 개의 이미지는 업로드 하 고 우리의 검색에서 주석 '형광 제자리에 과일 파리 데이터베이스' (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig1.jpg"> 
그림 1입니다. 형광 제자리에서 교 잡 (물고기) 프로토콜 및 키 장비 개요. CDNA의의 (A) PCR 증폭 (B) 녹음 방송 생체 외에서 생성 유전자 특정 센스 발굴-96 잘 접시 (b에서 표시 판의 사진)에서 RNA 프로브 표시. (C) 와 (D): 성인 (여성: 남성 비율 2:1. 300-400 파리/병) 파리 3-4 일 동안 친구를 사용할 수 있습니다. 25 ° C에서 표준 cornmeal 음식에 하룻밤 컬렉션에서 배아 통풍이 잘 플라스틱 상자에 전송 됩니다 (컨테이너 크기에 cornmeal 음식의 1 L: 8 "X 8" X 3"LWH) 또는 적절 한 애벌레의 밀도 유지 하는 새로운 병. 조직 컬렉션에 대 한 활성 효 모 분말, 계란 (AEL) 누워 후 48 h 24 음식 위에 뿌리고 해야 합니다. (H E): 교 잡 실험 형광 제자리에서 3 일 연속 수행. 사진 b 8 채널 흡 인기 (사진 c)와 같이 배아 또는 부동 하지 않는 조직, 96-잘 PCR 플레이트를 사용 합니다. 대부분 애벌레 조직 처럼 떠 조직에 대 한 필터 바닥 플레이트 d에서 (사진)를 사용 하 고 낮은 압력 (e에서 사진)를 사용 하는 매니폴드 흡 인기와 바닥에서 액체를 제거 합니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig2.jpg"> 
그림 2입니다. RNA 프로브 수익률의 결정입니다. 새로 합성 antisense RNA 프로브 1 %agarose 젤 (5 µ L/레인)에 관찰. 수익률 (밴드의 강도에 따라) 분류 될 수 있다 '낮은 수익률' 3, 10 차선에서 1, 4, 5, 6, 8, 차선에 ' 전형적인 항복' 또는 '고수익' 차선 2, 7, 9, 11 및 12에서에서. '전형적인 수익률' 샘플에 대 한 조사 각 현장에서 실험에 대 한 교 잡 솔루션의 100 µ L에 희석의 10-15 µ L을 사용 합니다. '높은 수익률' 프로브 '전형적인 프로브' 강도 기준으로 밴드 강도 따라 추가 교 잡 솔루션 샘플을 희석. 각 우물에서 대략 동일한 최종 프로브 농도를 목표로 합니다. 화살표 'RNA 프로브', 중 하나를 가리키는 각 차선에 더 높은 악대는 원래 DNA 템플렛 이다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig3.jpg"> 
그림 3입니다. 주요 대규모 배아 수집 및 고정에 대 한 단계. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig4.jpg"> 
그림 4입니다. 애벌레 또는 부동 조직에서 액체를 제거 하기 위한 수 제 튜브. 일부 애벌레와 성인 조직 고정 중 솔루션에서 부동. 나일론 메쉬 1 mL 팁으로는 흡 인기에 연결 하는 어댑터 뒤 끝을 잘라 200 µ L에 의해 개최이 간단한 도구에 의하여 이루어져 있다. 액체는 어떤 조직을 잃지 않고 안전 하 게 제거할 수 있습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig5.jpg"> 
그림 5입니다. Tyramide 신호 증폭. (RNA 생 감각과 센스 RNA 프로브 1) 파기 표시 된 hybridizes. (Biotin 활용 된 1 차적인 항 체 발굴 UTP 사이 2) 면역-선호도 바인딩. (3) HRP streptavidin 바인딩 biotin 활용. (4) HRP catalyzes 단명 cyanine 3 tyramide 래 디 칼 형성 하 cyanine 3 tyramide와 과산화 수소 반응. (5) cyanine 3 tyramide 래 디 칼에 가까운 단백질 티로신 잔류물에 바인딩합니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig6.jpg"> 
그림 6입니다. 교 잡 이미지 대표 제자리에 . 각 패널 (녹청에 표시 된) 다른 RNA와 핵 DAPI (빨간색으로 표시)으로 물에의 한 예를 보여 줍니다. (A-C) 초기 초파리 배아의 예입니다. (D, F) 늦은 초파리 배아의 예입니다. (G-J) 예제 3의 탈피 초파리 애벌레 조직 (malphigian tubules, midgut, 침 샘과 근육 각각). (K) 성인 난소입니다. (L) 성인 고환입니다. 각 패널 조사를 교배 시키기 유전자의 이름을 표시 합니다. 스케일 바 = 10 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

교 잡 프로토콜 설명된 RNA 제자리에 전체 초파리 배아 또는 해 부 조직에서 RNA의 검출을 허용 한다. 96-잘 결정 접시와 tyramide 신호 증폭에 사용 하 여, 성적 감지할 수 있습니다 높은 해상도, 감도, 및 처리량, 그리고 상대적으로 저렴 한 비용.

높은 해상도 교 잡 형광 제자리에 초파리 태아와 Tyramide 신호 증폭을 사용 하 여 조직에서

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

12.8K 조회수.  University of Toronto. 교 잡 프로토콜 설명된 RNA 제자리에 전체 초파리 배아 또는 해 부 조직에서 RNA의 검출을 허용 한다. 96-잘 결정 접시와 tyramide 신호 증폭에 사용 하 여, 성적 감지할 수 있습니다 높은 해상도, 감도, 및 처리량, 그리고 상대적으로 저렴 한 비용.

비디오: High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are expressed in spatial relation to each other in situ. Multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) greatly facilitates the instant comparison of gene expression patterns, as it allows distinctive visualization of different mRNA species in contrasting colors in the same sample specimen. This provides the possibility to relate gene expression domains topographically to each other with high accuracy and to define unique and overlapping expression sites. In the presented protocol, we describe a MC-WISH procedure for comparing mRNA expression patterns of different genes in Drosophila embryos. Up to three RNA probes, each specific for another gene and labeled by a different hapten, are simultaneously hybridized to the embryo samples and subsequently detected by alkaline phosphatase-based colorimetric immunohistochemistry. The described procedure is detailed here for Drosophila, but works equally well with zebrafish embryos.

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

We describe a multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) procedure in intact Drosophila embryos allowing simultaneous and specific detection of three different mRNA distribution patterns by contrasting color precipitates.

멀티 타겟 원체 전체 마운트<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드에서 유전자 발현의 도메인을 비교<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

연구

발생학

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

생물학

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

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Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and computational modeling to classify and compare biological processes. Although cell culture model systems are great for high content imaging, high throughput studies of cell morphology suggest that ex vivo cultures are limited in recapitulating the morphological complexity found in cells within living organisms. As such, there is a need for a scalable high throughput model system to image living cells within an intact organism. Described here is a protocol for using a high content image analyzer to simultaneously acquire multiple time-lapse videos of embryonic Drosophila melanogaster development during the syncytial blastoderm stage. The syncytial blastoderm has traditionally served as a great in vivo model for imaging biological events; however, obtaining a significant number of experimental replicates for quantitative and high-throughput approaches has been labor intensive and limited by the imaging of a single embryo per experimental repeat. Presented here is a method to adapt imaging and microinjection approaches to suit a high content imaging system, or any inverted microscope capable of automated multipoint acquisition. This approach enables the simultaneous acquisition of 6-12 embryos, depending on desired acquisition factors, within a single imaging session.

Presented here is a protocol to microinject and simultaneously image multiple Drosophila embryos during embryonic development using a plate-based, high content imager.

자동 고함량 분석기를 사용하여 수행된 살아있는 세포 현미경 검사법을 위한 Drosophila 배아 준비 및 미세 주입

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of embryogenesis, these organelles undergo dramatic movements powered by actin-based cytoplasmic streaming and motor-driven trafficking along microtubules. The development of a multitude of small, organelle-specific fluorescent probes (FPs) makes it possible to visualize a wide range of different lipid-containing structures in any genotype, allowing live imaging without requiring a genetically encoded fluorophore. This protocol shows how to inject vital dyes and molecular probes into Drosophila embryos to monitor the trafficking of specific organelles by live imaging. This approach is demonstrated by labeling lipid droplets (LDs) and following their bulk movement by particle image velocimetry (PIV). This protocol provides a strategy amenable to the study of other organelles, including lysosomes, mitochondria, yolk vesicles, and the ER, and for tracking the motion of individual LDs along microtubules. Using commercially available dyes brings the benefits of separation into the violet/blue and far-red regions of the spectrum. By multiplex co-labeling of organelles and/or cytoskeletal elements via microinjection, all the genetic resources in Drosophila are available for trafficking studies without the need to introduce fluorescently tagged proteins. Unlike genetically encoded fluorophores, which have low quantum yields and bleach easily, many of the available dyes allow for rapid and simultaneous capture of several channels with high photon yields.

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

In the early Drosophila embryo, many organelles are motile. In principle, they can be imaged live via specific fluorescent probes, but the eggshell prevents direct application to the embryo. This protocol describes how to introduce such probes via microinjection, and then analyze bulk organelle motion via particle image velocimetry.

초파리 배아에서 지질 함유 소기관의 세포 골격 의존성 밀매 시각화

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged molecules within complex biological samples. While traditional confocal microscopes allow one to resolve two adjacent fluorescent point sources located a few hundred nanometers apart, observing the finer details of subcellular biology requires the ability to resolve signals in the order of tens of nanometers. Numerous hardware-based methods for super-resolution microscopy have been developed to allow researchers to sidestep such resolution limits, although these methods require specialized microscopes that are not available to all researchers. An alternative method for increasing resolving power is to isotropically enlarge the sample itself through a process known as expansion microscopy (ExM), which was first described by the Boyden group in 2015. ExM is not a type of microscopy per se but is rather a method for swelling a sample while preserving the relative spatial organization of its constituent molecules. The expanded sample can then be observed at an effectively increased resolution using a traditional confocal microscope. Here, we describe a protocol for implementing ExM in whole-mount Drosophila embryos, which is used to examine the localization of Par-3, myosin II, and mitochondria within the surface epithelial cells. This protocol yields an approximately four-fold increase in sample size, allowing for the detection of subcellular details that are not visible with conventional confocal microscopy. As proof of principle, an anti-GFP antibody is used to distinguish distinct pools of myosin-GFP between adjacent cell cortices, and fluorescently labeled streptavidin is used to detect endogenous biotinylated molecules to reveal the fine details of the mitochondrial network architecture. This protocol utilizes common antibodies and reagents for fluorescence labeling, and it should be compatible with many existing immunofluorescence protocols.

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Here, a protocol for the implementation of expansion microscopy in early Drosophila embryos to achieve super-resolution imaging using a conventional laser-scanning confocal microscope is presented.

초고해상도 이미징을 위해 확장 현미경을 사용하여 전체 마운트 초파리 배아를 물리적으로 확대

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...

Antibody-Mediated Live Imaging을 통한 단백질 시각화 향상

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein localization, dynamics, and function. Compared to immunofluorescence, live imaging more accurately reflects protein localization without potential artifacts arising from tissue fixation. Importantly, live imaging enables quantitative and temporal characterization of protein levels and localization, crucial for understanding dynamic biological processes such as cell movement or division. However, a major limitation of fluorescent tagging approaches is the need for sufficiently high protein expression levels to achieve successful visualization. Consequently, many endogenously tagged fluorescent proteins with relatively low expression levels cannot be detected. On the other hand, ectopic expression using viral promoters can sometimes lead to protein mislocalization or functional alterations in physiological contexts. To address these limitations, an approach is presented that utilizes highly sensitive antibody-mediated protein detection in living embryos, essentially performing immunofluorescence without the need for tissue fixation. As proof of principle, endogenously GFP-tagged Notch receptor that is barely detectable&#160;in living embryos can be successfully visualized after antibody injection. Furthermore, this approach was adapted to visualize post-translational modifications (PTMs) in living embryos, allowing the detection of temporal changes in tyrosine phosphorylation patterns during early embryogenesis and revealing a novel subpopulation of phosphotyrosine (p-Tyr) underneath apical membranes. This approach can be modified to accommodate other protein-specific, tag-specific, or PTM-specific antibodies and should be compatible with other injection-amenable model organisms or cell lines. This protocol opens new possibilities for live imaging of low-abundance proteins or PTMs that were previously challenging to detect using traditional fluorescent tagging methods.

저자 스포트라이트: Unveiling the Dynamics of Mechanical and Biochemical Signals in Animal Morphogenesis Research (동물 형태 형성 연구에서 기계적 및 생화학적 신호의 역학 공개) 

This protocol describes the customized antibody-based fluorescence labeling and injection into early Drosophila embryos to enable live imaging of low-abundance proteins or post-translational modifications that are challenging to detect using traditional GFP/mCherry-tag approaches.

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

높은 해상도 교 잡 형광 제자리에 초파리 태아와 Tyramide 신호 증폭을 사용 하 여 조직에서

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Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

에 대한 Mesoscopic 형광 Tomography 인 - 생체내 이미징 Drosophila

자동 고함량 분석기를 사용하여 수행된 살아있는 세포 현미경 검사법을 위한 Drosophila 배아 준비 및 미세 주입

초파리 배아에서 지질 함유 소기관의 세포 골격 의존성 밀매 시각화

초고해상도 이미징을 위해 확장 현미경을 사용하여 전체 마운트 초파리 배아를 물리적으로 확대

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

전체 마운트 RNA 형광