The support from ERC through HealInSynergy (306990) and the FPU program AP2009-3626 are acknowledged.

지느러미 기판 1. 생산 <ol><li> 용매 캐스팅에 의해 PLLA의 평면 필름의 생산. <ol><li> 실온 완전히 (약 3 시간)에 용해 될 때까지 (RT)에서 교반하여 2 % 용액을 클로로포름 (w / v)의 PLLA (100 ㎖의 클로로포름에 2g의 PLLA)을 제조 흄 후드에서 작업. </li><li> 유리 페트리 접시에 와셔를 놓습니다. 주 : (복부 샘플 직경보다 약간 작다) 10.5 mm의 내경 사용 스테인레스 와셔 와셔 복부 기판 위에 배치되도록. 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 또는 유리 와셔와 같은 다른 재료도 사용될 수있다. </li><li> 세탁기에서 PLLA 용액 200 μl를 추가하고 실온에서 30 분 동안 천천히 증발 할 수 있습니다. 용매의 느린 증발을 허용하기 위해, 몇 개의 구멍을 알루미늄 호일로 페트리 접시를 닫는다. </li><li> 용매를 증발 추적하기 위하여 5 분 동안 120 ℃에서 샘플을 가열한다. </li><li> 샘플 할 식지실온에서 WN. </li><li> 샘플 (30 분 정도) 냉각 한 후, 페트리 접시 · CM 물 18.2 MΩ 커버하고 실온에서 8 분 동안 품어. 참고 : 샘플이 완전히 냉각되지 않으면, 그들이 · 최대 CM 물을 18.2 MΩ을 가지고 고무 상태를 채택 할 수있다. 또한,보다 8 분 · CM 물 18.2 MΩ에서 배양하는 것은 부적절한 분리, 그리고 세탁기에서 분리 이상 8 분 동안 발생할 수 있습니다. </li><li> 면도날로, 페트리 접시를 벗겨 와셔를 들어 올립니다. </li><li> 핀셋 세탁기의 가장자리에서 모든 결함을 제거하고 샘플을 자연 건조 할 수 있습니다. </li><li> PLLA는 가수 분해에 의해 분해 가능하므로 실험 일까지 진공 데시 케이 터 (80 밀리바)에서 샘플을 보관. </li></ol></li><li> 전기 방사에 의한 PLLA 섬유의 제조. <ol><li> stirr하여 헥사 플루오로 이소프로판올 용액의 8 % (w / v)의 PLLA (100 ㎖의 헥사 플루오로 이소프로판올 8g의 PLLA)을 제조 흄 후드에서 작동완전히 용해 될 때까지 실온에서 보내고 (3 시간 정도). </li><li> 각각 랜덤 또는 정렬 된 섬유를 얻기 위해서 알루미늄 판 또는 전기 방사를위한 드럼 상에 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 와셔를 놓는다. 주 : (복부 샘플 직경보다 약간 작다) 10.5 mm의 내경 사용 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 와셔 와셔 복부 기판 위에 배치되도록. 스테인리스 강이나 유리 와셔와 같은 다른 재료도 사용될 수있다. 드럼 정렬 된 섬유를 얻기 위해서는 160.7 초 -1 (반경 = 7cm)의 각속도로 회전한다. 느린 속도는 섬유 정렬을 유발하지 않을 수 있습니다 및 빠른 속도를 절단 섬유 발생합니다. </li><li> 고분자 용액을 주사기를로드하고 주사기 펌프에 놓습니다. </li><li> 30 kV의 전압의 12 cm의 컬렉터 거리 0.9 ㎖ / 시간의 유속을 사용 PLLA 용액 Electrospin. </li><li> 전기 방사 공정 후방 정지ER 20-30 분, (셀이 동시에 여러 섬유와 상호 작용이 있기 때문에) 회 좋은 섬유 밀도가 달성된다. </li><li> 용매를 증발 추적하기 위하여 5 분 동안 120 ℃에서 샘플을 가열한다. </li><li> PLLA는 가수 분해에 의해 분해 가능하므로 실험 일까지 진공 데시 케이 터 (80 밀리바)에서 샘플을 보관. </li></ol></li></ol> 2. 샌드위치 문화 <ol><li> 세포가 복부 2D 기판에 부착되면 샌드위치와 같은 문화를 조립합니다. <ol><li> 문화 후드에서 작업은 무균 조건을 보장하고 30 분 동안 자외선 노출에 의해 모든 자료 (커버 글라스, 등의 기판, 핀셋 등)을 살균합니다. </li><li> 순서 코트 피브로넥틴과 복부와 지느러미 기판은 특정 세포 단백질 접착을 지시합니다. 이렇게하려면, 둘 베코의 인산염 완충 식염수 (DPBS) 칼슘을 포함하는 2 + Mg를 2 + (200 μL / S에 용해 피브로넥틴의 20 μg의 / ㎖에서 샘플을 품어1 시간 동안) 충분한. 주 : 용매 캐스트 필름과 전기 방사 섬유가 세탁기의 측면 중 하나에 부착하므로 인해 제조 공정에, 등쪽 기판 지정된 상부 및 하부면을 갖는다. 이 측면 따라서 세포 (그림 3)에 직면 하나입니다. <ol><li> 단백질을 코팅 한 후, 과잉의 단백질을 제거하기 위해 DPBS 두 번 샘플을 세척한다. 그런 다음이 단백질 변성의 원인부터 건조되기에서 샘플을 방지하기 위해 자신의 사용까지 DPBS에서 샘플을 품어. 가의 양이온 이후 2 + 칼슘과 마그네슘이 포함 된 사용 DPBS는 단백질 접힘을 조절한다. </li></ol></li><li> 유리에 종자 세포는 13 된 커버. 참고 : 샌드위치 같은 문화가 2D 기판을 기반으로, 휴대 시드 유사하게 2D 샘플로 수행됩니다. 예를 들어,의 C2C12 근육 모세포가 분화 cm -1 실험 및 NIH3T3 섬유 아세포에 대한 7,000 C에서 시딩 17,500 세포로 시딩ELL 학생 센티미터 -1 고립 된 문화가 세포 형태 및 접착 성을 연구하기 위해. </li><li> 5 % CO 2, 37 ℃ 인큐베이터에서 샘플을 배치 및 셀 3 시간 동안 복부 기판에 부착 할 수있다. </li><li> (와셔 맞는 경우) 12 멀티 웰 플레이트의 새로운 우물에 복부 시드 기판을 놓습니다. 참고 : 새로운 잘 샌드위치와 같은 문화를 조립하는 것은 이러한 영양소를 소비하고 내에서 배양 된 세포에 영향을 미치는 성장 인자 및 폐기물을 분비하기 때문에 잘 파종 후 하단에 부착 한 세포를 제거하는 방법 중 하나입니다 샌드위치 같은 시스템. 이것은 또한 샌드위치 형 환경 내에서만 배양 세포를 용균시키기 위하여 세포 추출을위한 필요한 것이다. </li><li> 조심스럽게 및 핀셋의 도움으로, 세포 등의 기판을 오버레이. 매체 (1 ml)로 리필 5 % CO 2와 37 ° C에서 품어. 참고 : 세탁기의 무게는 등의 서브를 방지 할 수 있습니다부동에서 strate. </li><li> 표준 2 차원 문화로 일주일에 두 번 매체를 변경합니다. 이 세포가 손상 될 수 있기 때문에 등의 기판을 이동하지 마십시오. </li></ol></li><li> 단지 세포 파종 후 샌드위치와 같은 문화를 조립합니다. <ol><li> 문화 후드에서 작업은 무균 조건을 보장하고 30 분 동안 자외선 노출에 의해 모든 자료 (커버 글라스, 등의 기판, 핀셋 등)을 살균합니다. </li><li> 순서 코트 피브로넥틴과 복부와 지느러미 기판은 특정 세포 단백질 접착을 지시합니다. 이렇게하려면, 칼슘 및 마그네슘 2 + 1 시간 동안 (200 μL / 샘플)를 포함 DPBS에 용해 피브로넥틴의 20 μg의 / ㎖에서 샘플을 품어. <ol><li> 단백질을 코팅 한 후, 과잉의 단백질을 제거하기 위해 DPBS 두 번 샘플을 세척한다. 그런 다음이 단백질 변성의 원인부터 건조되기에서 샘플을 방지하기 위해 자신의 사용까지 DPBS에서 샘플을 품어. 칼슘과 마그네슘이 포함 된 사용 DPBS <s&gt; 2+까지 가의 양이온은 단백질 접힘을 조절하기 때문이다. </li></ol></li><li> (와셔에 맞게) 12 멀티 웰 플레이트의 잘 커버 글라스에 씨앗 세포. 이를 위해, 등쪽 기판 누워 후 세포의 손실을 방지하기 위해 고농도의 세포 현탁액을 사용한다. </li><li> 조심스럽게 및 핀셋의 도움으로, 세포 등의 기판을 오버레이. 매체 (1 ml)로 리필 5 % CO 2와 37 ° C에서 품어. 참고 : 세탁기의 무게는 부동에서 지느러미 기판을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 표준 2 차원 문화로 일주일에 두 번 매체를 변경합니다. 참고 :이 세포 손상을 초래할 수 있기 때문에 등의 기판을 이동하지 마십시오. </li></ol></li></ol> 3. 분석 주 : 샌드위치 형 2D 배양 기질에 기초하고 있으며, 그래서 일반적으로 이미 표준 2D 배양을 위해 개발 과정에 의해 분석 될 수있다. 예를 들어, 이후 PLLA는 투명하고 CEL입니다LS가 xy 평면 내에서 이동 제한됩니다, 현미경은 2D 기판에로 이루어집니다. 세포 이동 따라서 실험 및 이미지 분석을 단순화 3D 배양 용으로서 Z 축에서 트래킹 셀의 필요없이, 2 차원 배양 용으로 분석 될 수있다. 스크래치 분석에 의해 상처 치유 분석을 연구하려면이 프로토콜을 따르 <ol><li> 샌드위치 같은 문화 내에서 연구 세포 이동 (상처 치유 분석). <ol><li> 문화 후드에서 작업은 무균 조건을 보장하고 30 분 동안 자외선 노출에 의해 모든 자료 (커버 글라스, 등의 기판, 핀셋 등)을 살균합니다. </li><li> 순서 코트 피브로넥틴과 복부와 지느러미 기판은 특정 세포 단백질 접착을 지시합니다. 이렇게하려면 1 시간 동안 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS) 칼슘을 포함하는 2 + Mg를 2 +에 용해 피브로넥틴의 20 μg의 / ㎖에서 샘플을 품어. <ol><li> 단백질 코팅 후 DPBS 두 번 샘플을 씻어순서를 초과하는 단백질을 제거합니다. 이어서 단백질 변성을 일으킬 수이 때문에 건조 샘플을 얻는 것을 방지하기 위해, 이들의 사용까지 DPBS에서 샘플을 배양. 가의 양이온 이후 2 + 칼슘과 마그네슘이 포함 된 사용 DPBS는 단백질 접힘을 조절한다. </li></ol></li><li> 고밀도 (13)에 커버 글라스에 종자 세포. </li><li> 5 % CO 2, 37 ℃ 인큐베이터에서 샘플을 배치 및 세포가 합류를 달성 할 수있다. </li><li> 간격으로 구분이 세포 인구를 얻기 위해 세포 단일 층을 긁어 피펫 팁을 사용합니다. </li><li> 시간 경과 수집을위한 새로운 잘 적합한에서 복부 시드 기판을 놓고 등의 기판 (즉, 12 멀티 웰 플레이트)을 맞게한다. </li><li> 조심스럽게 및 핀셋의 도움으로, 세포 등의 기판을 오버레이하고 (12 멀티 웰 플레이트 1 ㎖) 매체 리필. 주 : 세탁기의 중량을 방지 할 t그는 부동에서 기판을 지느러미. </li><li> 시간 경과 현미경에서 샘플을 배치 (37 ° C로 설정하고, 5 % CO 2)와 갭 폐쇄 매 20 분의 이미지를 가져 가라. </li><li> 같은 ImageJ에에서 플러그인 MiToBo로 특정 소프트웨어를 사용하여 갭 폐쇄를 분석한다. (14) </li></ol></li></ol> 주 : 단백질 및 핵산 추출은 기판 상에 2 차원으로 유사하게 수행된다. 추출 효율을 증가시키기 위해 세포에 직접 용해 완충액을 추가 샌드위치 형 배양 분해로 이루어져 하나의 추가 단계가있다. 예를 들어, mRNA의 추출 : <ol start="2"><li> 샌드위치 같은 문화에서의 mRNA를 추출 <ol><li> 제조업체의 지시에 따라 상업용 키트에서 모든 버퍼를 준비한다. </li><li> 인큐베이터에서 밖으로 샌드위치와 같은 문화를 가지고. </li><li> 샘플에서 배양 배지를 제거합니다. </li><li> DPBS이 칼슘을 함유 한 번 샘플을 씻으십시오Mg를 2+ 2+ (1 mL) 및 모든 용액을 제거한다. </li><li> 핀셋의 도움으로, 등의 기판을 제거하고 복부 기판에 용해 버퍼 (350 μL)를 추가합니다. 또한 지느러미 기판에 부착 세포를 용균시키기 위해 다시 복부 기판 지느러미 기판 오버레이. </li><li> 분해 용액을 분리하는 등의 기판을 제거합니다. </li><li> 의 mRNA를 얻기 위해 제조업체의 지침을 따르십시오. </li></ol></li></ol> 참고 : 단백질의 면역 적 또한 2D 기판에로 수행 할 수 있습니다. 샌드위치 같은 문화가 항체와 버퍼의 올바른 확산을 방해 할 수 있기 때문에, 배양 시간이 증가한다. 또한, 샌드위치 염색 프로토콜을 시작하기 전에 분해 될 수 있지만, 후자의 경우 일부 셀은 등쪽 기판 및 기판에 대한 일부 복부에 부착 된 상태를 유지한다. <ol start="3"><li> 샌드위치 같은 문화 내에서 Immunodetect 단백질 <ol&gt; <li> DPBS 한 번 샘플을 세척하고 4 ℃에서 20 분 동안 PBS에서 4 % 포름 알데히드로 고정한다. 주 : 도설 기판 확산 문제를 회피되도록 정착 과정에서 제거 될 수있다. </li><li> DPBS (1 ml)으로 헹군 후, RT에서 5 분 동안 0.5 % DPBS에서 트리톤 X-100 (1 ml)로 Permeabilize 하시려면. </li><li> RT에서 30 분 동안 1 % DPBS 알부민 (1 mL)로 비특이적 결합 부위를 차단. </li><li> 일차 항체와 함께 품어 (2 μg의 / ㎖ 1 ml)을 실온에서 3 시간 동안 솔루션을 차단한다. </li><li> DPBS 10 분 / 0.5 % 트윈 20 (1 ㎖)에 대해 3 회 반복한다. </li><li> 실온에서 용액 (1 ml)에 차단하는 이차 항체 (2 μg의 / ㎖) 및 1 μg의 / ㎖ DAPI와 2 시간을 품어. </li><li> DPBS에서 10 분 / 0.5 % 트윈 20 (1 ㎖)에 대해 3 회 반복한다. </li><li> DPBS에 씻으십시오. 참고 : 시료는 Vectashield와 슬라이드에 장착 등의 기판 전에 면역을 제거 할 때 매니큐어로 밀봉 할 수있다. </li><li> 형광 마이크로 하에서 관찰표준 2D 기판 용으로 범위. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

요즘, 3D 문화는 암을 포함한 세포 생물학에서 중요한 제약 및 생명 공학 산업을위한 주제뿐만 아니라 연구이고, 줄기 세포. 결과적으로 여러 3 차원 배양 시스템이 개발되어왔다. 불행히도, 3D 시스템 간의 차이는 일반적으로 세포의 운명 이해를 방해하는 다른 셀 동작이 발생할. 또한, 실험 절차는 일반적으로 2D 문화 시스템처럼 간단하지 않다. 따라서, 이들 단점 중 일부는 매우 중요하다 극복하?...

생체 세포의 미세 환경의 대부분은 3 차원 (3D) 성질을 가지고 있지만 전통적으로, 세포 배양 물은 바이 - 차원 (2D)의 기판상에서 수행되었다. 이 부 자연스러운 2D 환경은 평평한 세계에 스스로 적응하는 방법으로 세포의 행동 변화를 유발하는 직접적인 영향을 세포 운명 1,2. 따라서, 2 차원 세포 배양에서 얻어진 결과는 항상 생체 내에서 재현 할 수 없습니다. 이것은 모든 사이즈 의존성 생물학적기구 3,4-으로 더 통찰력을 얻기 위해 더 많은 생리 같은 조건을 제공하고자하는 새로운 비즈니스 배양 시스템의 개발을 장려하고있다. 2D는 세포 복부 부착 기판 상에 반해 생체 내에서 세포의 대부분이 완전히 ECM에 의해 둘러싸여있다 : 2 차원 배양 및 생체 환경에서 3D 간의 주된 차이점들 중 하나는 세포 외 기질 (ECM)에 고정 세포 수용체의 분포 따라서 CELL 밀착성이 수용체의 3 차원 분포를 통해 발생한다. 이것에 의해 이러한 세포 성장, 세포 분화 및 유전자 발현에 중요한 프로세스를 변조 다른 세포 접착 신호 전달 경로를 트리거한다. 그들의 변동 및 복잡성이 일반적인 세포 배양 과정에서의 표준화를 방해하지만 지난 수십 년 동안, 다양한 3 차원 배양 시스템은 5-8 확립되었다. 또한 3D 시스템은 일반적으로 처리 할 수​​ 및 2D 기판에 현재의 실험 절차는 쉽게 3D 문화 확립 할 수 없습니다 쉽지 않다. 또한, 문헌은 거의 이러한 모델에서 세포 행동의 적절한 이해를 방해하고, 동등한 조건 2D 또는 3D 다른 시스템과 3 차원 배양을 비교하지 않는다. 일단 2D 기판 등의 수용체의 자극에 부착 된 세포를 가진 - 신소재 (샌드위치 같은 문화)의 필름을 중첩하여 - 셀 모두 응답 3D 환경을 트리거 할 수 있습니다. REA이 뒤에 아들은 지느러미와 복부 수용체 준수와 샌드위치 환경 내에서 확산 (그림 1) 9, 10 두의 동시 활성화입니다. 결과적으로, 세포는 배양 11,12 2D에 대해서 중요한 변화를 겪는다. 등의 자극이 키 세포 경로의 변화를 유발하기 때문에 따라서, 세포의 운명은, 때문에 샌드위치 문화의 조립시 결정됩니다. 따라서, 세포의 운명은 고도로 샌드위치 형 배양 11 조립 시간에 의해 결정된다. 인해 시스템의 특성상, 샌드위치 형상 배양 모두 복부 및 등쪽 측면에 같은 화학, 지형, 강성 및 단백질 코팅 같은 셀 / 재료 상호 상이한 파라미터들의 연구를 허용 간단하고 다양한 도구이다. 이는 넓은 V의 독립적 지느러미와 복부 조합에 다른 3D 시스템 (그림 2)에 비해 다양한 기능의 높은 수준을 제공합니다표면 상태의 ariety. 부가 적으로, 다른 세포주 및 배양 샌드위치 형 조립 상이한 시간은 가능성의 넓은 스펙트럼을 증가​​ 연구 될 수있다. 샌드위치 같은 문화의 표준 프로토콜을 사용하여 아래에 자세히 설명되어 하나 등의 기판, 단백질 코팅으로 복부 기판과 피브로넥틴 등의 유리 커버 슬립과 같은 산 (PLLA) 전기 방사 섬유 또는 필름-L-유산 폴리. 샌드위치 같은 문화는 세포 파종 후 또는 2D 문화의 3 시간 후 조립했다. 그러나, 다른 재료 시스템 및 단백질이 사용될 수 있음에 유의 마찬가지로 샌드위치 형상의 배양은 상이한 시점에서 조립 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Ploy(lactic acid)</td><td>NatureWorks</td><td>4042D</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Cover glasses (12 mm&amp;Oslash;)</td><td>Marienfeld</td><td>631-0666</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Scharlab</td><td>CL0200</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td><td>Sigma</td><td>105228</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Syringe (1 ml)</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010-200V0</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE1000</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>High Voltage DC Power Supply</td><td>Glassman High Voltage</td><td>Series FC</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Hucoa-Herl&amp;ouml;s</td><td>3111</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Laminar flow&amp;nbsp; hood</td><td>Telstar</td><td>AV30/70</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Human Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMI 6000</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7409</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>Reagent</td></tr></tbody></table>

sandwich-like microenvironments to harness cell/material interactions

세포 배양은 전통적 세포가 생체 복부 표면 수용체를 사용하여 부착 BI 차원 (2D)의 기판상에서 수행되었다. 그러나, 생체 내에서, 대부분의 셀이 완전히 수용체의 3 차원 분포의 결과로, 세포 외 기질 (ECM)에 의해 둘러싸여있다. 이 신호 전달 경로에 외부-따라서 세포 행동의 차이를 유발 할 수 있습니다. 이 문서에서는 이미 새로운 물질 (샌드위치 같은 문화)의 필름을 중첩하여 2D 기판에 부착 된 세포의 지느러미 수용체를 자극하는 표준 2D 문화에 대한 중요한 변경 사항을 트리거 보여줍니다. 또한, 복부와 지느러미 수용체의 동시 여기 가까이 3D 환경에서 발견에 셀 동작을 이동합니다. 또한 인해 시스템의 특성상, 샌드위치 형상 배양 세포 / 재료 INTE 상이한 파라미터들의 연구를 허용 다용도 공구이다ractions, 예를 들어, 지형, 강성과 모두 복부와 등의 측면에서 다른 단백질 코팅. 샌드위치 형 배양액 2D 기판에 기초하기 때문에 최종적으로, 여러 분석 절차는 이미 3D 시스템에 필요한 더 복잡한 절차를 극복 정상적으로 사용할 수있는 표준 2D 배양을 위해 개발.

샌드위치 형 배양 내 등쪽 수용체의 자극은 세포 형태학, 세포 부착 및 세포 내 신호 전달 경로 (예, 국소 유착 키나제, FAK) 10-12의 변화를 트리거한다. 다른 3D 배양 15,16 관찰로서 예를 들어, 샌드위치 형 시스템 내에서의 배양 섬유 아세포는 2D에 비해 5 인테그린 α 서브 유닛을 과발현. 셀 운명은 하이드로 겔과 같은 다른 3D 시스템에서 발생하는...

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Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

샌드위치 같은 미세 환경은 셀 / 재료의 상호 작용을 활용하는

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

sandwich-like-microenvironments-to-harness-cellmaterial-interactions

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K 조회수.  Universitat Politècnica de València. The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

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Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

기계 다이나믹 셀 문화 Microfabricated 플랫폼

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

연구

생체공학

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events leading to stromal activation and establishment of the tumor microenvironment (TME). Several in vitro and in vivo models of the TME have been developed; however, in general these models do not readily permit isolation of individual cell populations, under non-perturbing conditions, for further study. To circumvent this difficulty, we have employed an in vitro TME model using a cell growth substrate consisting of a permeable microporous membrane insert that permits simple generation of highly enriched cell populations grown intimately, yet separately, on either side of the insert&#39;s membrane for extended co-culture times. Through use of this model, we are capable of generating greatly enriched cancer-associated fibroblast (CAF) populations from normal diploid human fibroblasts following co-culture (120 hr) with highly metastatic human breast carcinoma cells, without the use of fluorescent tagging and/or cell sorting. Additionally, by modulating the pore-size of the insert, we can control for the mode of intercellular communication (e.g., gap-junction communication, secreted factors) between the two heterotypic cell populations, which permits investigation of the mechanisms underlying the development of the TME, including the role of gap-junction permeability. This model serves as a valuable tool in enhancing our understanding of the initial events leading to cancer-stroma initiation, the early evolution of the TME, and the modulating effect of the stroma on the responses of cancer cells to therapeutic agents.

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

종양 미세 환경의 모방 : 세포 간 통신을 농축 세포 인구를 생성 및 조사를위한 간단한 방법

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

암 연구학

Silicon Microchips for Manipulating Cell-cell Interaction

The role of the cellular microenvironment is recognized as crucial in determining cell fate and function in virtually all mammalian tissues from development to malignant transformation.&nbsp; In particular, interaction with neighboring stroma has been implicated in a plethora of biological phenomena; however, conventional techniques limit the ability to interrogate the spatial and dynamic elements of such interactions.
In Micromechanical Reconfigurable Culture (RC), we employ a micromachined silicon substrate with moving parts to dynamically control cell-cell interactions through mechanical repositioning. Previously, this method has been applied to investigate intercellular communication in co-cultures of hepatocytes and non-parenchymal cells, demonstrating time-dependent interactions and a limited range for soluble signaling 1.
Here, we describe in detail the preparation and use of the RC system. We begin by demonstrating the handling of the device parts using tweezers, including actuating between the gap and contact configurations (cell populations separated by a narrow 80-&micro;m gap, or in direct intimate contact). Next, we detail the process of preparing the substrates for culture, and the multi-step cell seeding process required for obtaining confluent cell monolayers. Using live microscopy, we then illustrate real-time manipulation of cells between the different possible experimental configurations. Finally, we demonstrate the steps required in order to regenerate the device surface for reuse: toluene and piranha cleaning, polystyrene coating, and oxygen plasma treatment.

This article describes an experimental approach for dynamic regulation of cell-cell interactions between adherent cells on a micrometer scale. Manipulation of intercellular communication between hepatocytes and stromal cell is demonstrated. The developed platform enables investigation of cell-cell interactions in a variety of biological processes, including development and pathogenesis.

세포 세포 상호 작용을 조작에 대한 실리콘 마이크로 칩

The role of the cellular microenvironment is recognized as crucial in determining cell fate and function in virtually all mammalian tissues from ...

생물학

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other physical or chemical stimuli. They have been commonly used for in vitro cell studies by providing in vivo like surroundings. Especially, how cells response to chemical gradients, electrical fields, and shear stresses has drawn many interests since these phenomena are important in understanding cellular properties and functions. These microfluidic chips can be made of glass substrates, silicon wafers, polydimethylsiloxane (PDMS) polymers, polymethylmethacrylate (PMMA) substrates, or polyethyleneterephthalate (PET) substrates. Out of these materials, PMMA substrates are cheap and can be easily processed using laser ablation and writing. Although a few microfluidic devices have been designed and fabricated for generating multiple, coexisting chemical and electrical stimuli, none of them was considered efficient enough in reducing experimental repeats, particular for screening purposes. In this report, we describe our design and fabrication of two PMMA-based microfluidic chips for investigating cellular responses, in the production of reactive oxygen species and the migration, under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli. The first chip generates five relative concentrations of 0, 1/8, 1/2, 7/8, and 1 in the culture regions, together with a shear stress gradient produced inside each of these areas. The second chip generates the same relative concentrations, but with five different electric field strengths created within each culture area. These devices not only provide cells with a precise, controllable micro-environment but also greatly increase the experimental throughput.

Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

단일 또는 공존 화학 / 전기 / 전단 응력 자극에서 세포 응답 유학을위한 미세 유체 장치 설계

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

세포 분화 및 견인 힘의 상관 관계 분석을위한 높은 처리량 세포 마이크로 어레이 플랫폼

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

멀티플렉스 인공 세포 MicroEnvironment 배열의 제작

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

화학 유인 그라데이션에 대 한 다중 세포 반응의 3D 분석

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

고처리량 미세 유체 장치를 사용하여 동적 환경 조건의 생성

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

제조 및 MicroEnvironment의 microArrays의 사용 (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Generation of Multicue Cellular Microenvironments by UV-Photopatterning of Three-Dimensional Cell Culture Substrates

The extracellular matrix is an important regulator of cell function. Environmental cues existing in the cellular microenvironment, such as ligand distribution and tissue geometry, have been increasingly shown to play critical roles in governing cell phenotype and behavior. However, these environmental cues and their effects on cells are often studied separately using in vitro platforms that isolate individual cues, a strategy that heavily oversimplifies the complex in vivo situation of multiple cues. Engineering approaches can be particularly useful to bridge this gap, by developing experimental setups that capture the complexity of the in vivo microenvironment, yet retain the degree of precision and manipulability of in vitro systems.
This study highlights an approach combining ultraviolet (UV)-based protein patterning and lithography-based substrate microfabrication, which together enable high-throughput investigation into cell behaviors in multicue environments. By means of maskless UV-photopatterning, it is possible to create complex, adhesive protein distributions on three-dimensional (3D) cell culture substrates on chips that contain a variety of well-defined geometrical cues. The proposed technique can be employed for culture substrates made from different polymeric materials and combined with adhesive patterned areas of a broad range of proteins. With this approach, single cells, as well as monolayers, can be subjected to combinations of geometrical cues and contact guidance cues presented by the patterned substrates. Systematic research using combinations of chip materials, protein patterns, and cell types can thus provide fundamental insights into cellular responses to multicue environments.

Traditionally, cell culture is performed on planar substrates that poorly mimic the natural environment of cells in vivo. Here we describe a method to produce cell culture substrates with physiologically relevant curved geometries and micropatterned extracellular proteins, allowing systematic investigations into cellular sensing of these extracellular cues.