The support from ERC through HealInSynergy (306990) and the FPU program AP2009-3626 are acknowledged.

1. Herstellung von Rückengründe <ol><li> Produktion von Flachfolie von PLLA durch Lösungsmittelgießen. <ol><li> Arbeiten in einem Abzug, um eine Lösung von 2% (w / v) PLLA in Chloroform (2 g PLLA in 100 ml Chloroform), gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur (RT) bis zur vollständigen Lösung (ca. 3 h) herzustellen. </li><li> Legen Sie die Scheiben auf einer Glaspetrischale. Anmerkung: Die Verwendung Edelstahlscheiben mit einem Innendurchmesser von 10,5 mm (etwas kleiner als der ventral Probendurchmesser), so dass die Scheibe auf der Oberseite der ventralen Substrat platziert. Andere Materialien wie etwa Polytetrafluorethylen (PTFE) oder Glasscheiben ebenso verwendet werden. </li><li> Zugeben von 200 ul der PLLA-Lösung in die Waschmaschine und verdampfen lassen langsam für 30 min bei RT. Um eine langsame Verdampfung des Lösungsmittels zu ermöglichen, schließen Sie die Petrischale mit Aluminiumfolie mit ein paar Löcher. </li><li> Erhitzen Sie die Proben bei 120 ° C für 5 Minuten, um Lösungsmittelspuren zu verdampfen. </li><li> Lassen Proben kühl zu tunwn bei RT. </li><li> Sobald Proben abgekühlt sind (30 min ungefähr), Deckel mit 18,2 M &amp; Omega; · cm Wasser in der Petrischale und Inkubation für 8 min bei RT. Hinweis: Wenn Proben nicht vollständig abgekühlt ist, können sie aufnehmen 18,2 M &amp; Omega; · cm Wasser und einem gummiartigen Zustand übernehmen. Zusätzlich Inkubation in 18,2 M &amp; Omega; · cm Wasser für weniger als 8 min kann in unangebrachter Ablösung, und für mehr als 8 min in Loslösung von der Scheibe führen. </li><li> Mit einer Rasierklinge, hebeln Sie die Scheiben, um sie ziehen Sie die Petrischale. </li><li> Entfernen Sie alle Unvollkommenheiten von der Kante der Scheibe mit einer Pinzette und lassen Sie die Proben an der Luft trocknen. </li><li> Speichern der Proben in einem Vakuum-Exsikkator (80 mbar) bis zum Tag des Experiments aufgrund PLLA abbaubar durch Hydrolyse. </li></ol></li><li> Produktion von PLLA-Fasern durch Elektrospinnen. <ol><li> Arbeiten Sie in einem Abzug, um eine Lösung von 8% (w / v) PLLA in Hexafluorisopropanol (8 g PLLA in 100 ml Hexafluorisopropanol) durch umrühren vorbereitening bei RT bis zur vollständigen Auflösung (3 Stunden ungefähr). </li><li> Legen Sie das Polytetrafluorethylen (PTFE) Scheiben auf ein Aluminiumblech oder auf einer Trommel für die Elektrospinnen, um zufällige oder ausgerichteten Fasern bzw. zu erhalten. Anmerkung: Die Verwendung Polytetrafluorethylen (PTFE) Scheiben mit einem Innendurchmesser von 10,5 mm (etwas kleiner als der ventral Probendurchmesser), so dass die Scheibe an der Spitze der ventralen Substrat platziert. Andere Materialien, wie rostfreier Stahl oder Glas Scheiben könnten ebenso verwendet werden. Sollte die Trommel mit einer Winkelgeschwindigkeit von 160,7 s -1 (Radius = 7 cm), um die ausgerichteten Fasern zu erhalten, zu drehen. Eine langsamere Geschwindigkeit könnte Faserausrichtung nicht auslösen und eine schnellere Geschwindigkeit wird in gebrochenen Fasern führen. </li><li> Legen Sie die Spritze mit der Polymerlösung und auf der Spritzenpumpe. </li><li> Elektrospinnen PLLA Lösung unter Verwendung eines 0,9 ml / h Fließgeschwindigkeit mit einer Spannung von 30 kV und einer Kollektorabstand von 12 cm. </li><li> Stoppen Sie das Elektrospinnverfahren achterner 20-30 Minuten, einmal eine gute Faserdichte erreicht wird (da Zellen mit mehreren Fasern gleichzeitig interagieren). </li><li> Erhitzen Sie die Proben bei 120 ° C für 5 Minuten, um Lösungsmittelspuren zu verdampfen. </li><li> Speichern der Proben in einem Vakuum-Exsikkator (80 mbar) bis zum Tag des Experiments aufgrund PLLA abbaubar durch Hydrolyse. </li></ol></li></ol> 2. Sandwich Kultur <ol><li> Montieren Sie den sandwichartigen Kultur einmal Zellen dem ventralen 2D Substrat haftet. <ol><li> Arbeit in einer Kultur Haube sterilen Bedingungen, um sicherzustellen und zu sterilisieren alle Materialien (Deckgläser, Rücken Substrate, Pinzette, etc.) durch UV-Exposition für 30 min. </li><li> Coat die ventralen und dorsalen Substrat mit Fibronektin, um spezifische Zellproteinhaftung leiten. Dazu läßt man die Proben in 20 &amp; mgr; g / ml von Fibronektin in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS), die Ca 2+ und Mg 2+ (200 &amp; mgr; l / s gelöstausreichend) für 1 Stunde. Hinweis: Aufgrund des Herstellungsprozesses, haben Rücken Substrate A bezeichnet Ober- und Unterseite, da die Lösungsmittel gegossene Film und elektrogesponnenen Fasern auf einer der Seiten der Scheibe angebracht. Diese Seite ist daher ein Blick auf die Zellen (Figur 3). <ol><li> Nach der Proteinbeschichtung, waschen Sie die Proben zweimal mit DPBS, um Protein im Überschuß zu entfernen. Dann inkubieren Proben in DPBS, bis ihre Verwendung, um die Proben vor zu trockener, da dies bewirkt, dass Protein Denaturierung zu verhindern. Verwendung DPBS, das Ca 2+ und Mg 2+, da zweiwertige Kationen regulieren Proteinfaltung. </li></ol></li><li> Samenzellen auf dem Glasplättchen 13. Hinweis: Da die sandwichartige Kultur wird auf 2D Substraten basieren, werden Zellaussaat, ähnlich wie auf einer 2D-Probe durchgeführt werden. Beispielsweise werden C2C12 Myoblasten bei 17,500 Zellen cm -1 für Differenzierungsexperimente und NIH3T3-Fibroblasten sind bei 7000 c ausgesät ausgesätEllen cm -1 für isolierte Kulturen Zellmorphologie und die Haftung zu studieren. </li><li> Die Proben werden im Brutschrank bei 37 ° C mit 5% CO 2 und, sodass die Zellen an der ventralen Substrat für 3 Stunden zu halten. </li><li> Setzen Sie den ventralen ausgesät Substrat in einer neuen Vertiefung einer 12 Multiwellplatte (wo Waschmaschinen passen). Hinweis: Montage des sandwichartigen Kultur in einer neuen und ist ein Weg, der Zellen, die an der Unterseite der Brunnen nach der Aussaat eingehalten haben, zu befreien, da diese Nährstoffe verbrauchen und sezernieren Wachstumsfaktoren und Abfälle, die Zellen innerhalb der kultivierten beeinflussen lassen sandwichartigen Systems. Dies ist auch ein Muss für zellulare Extraktionen, um nur die Zellen in der sandwichartigen Umgebung kultiviert lysieren. </li><li> Sorgfältig und mit Hilfe einer Pinzette, überlagern die dorsale Substrat, auf die Zellen. Nachfüllung mit Medium (1 ml) und bei 37 ° C mit 5% CO 2. Hinweis: Das Gewicht der Scheibe wird in die dorsale Unter verhindernStrate aus schwimmenden. </li><li> Ändern Sie das Medium zweimal pro Woche, wie in Standard-2D-Kulturen. Den dorsalen Substrat nicht bewegen, da dies könnte in Zellschäden führen. </li></ol></li><li> Montieren Sie den sandwichartigen Kultur kurz nach Zellaussaat. <ol><li> Arbeit in einer Kultur Haube sterilen Bedingungen, um sicherzustellen und zu sterilisieren alle Materialien (Deckgläser, Rücken Substrate, Pinzette, etc.) durch UV-Exposition für 30 min. </li><li> Coat die ventralen und dorsalen Substrat mit Fibronektin, um spezifische Zellproteinhaftung leiten. Dazu läßt man die Proben in 20 &amp; mgr; g / ml von Fibronektin in DPBS, die Ca 2+ und Mg 2+ (200 ul / Probe) 1 h gelöst. <ol><li> Nach der Proteinbeschichtung, waschen Sie die Proben zweimal mit DPBS, um Protein im Überschuß zu entfernen. Dann inkubieren Proben in DPBS, bis ihre Verwendung, um die Proben vor zu trockener, da dies bewirkt, dass Protein Denaturierung zu verhindern. Verwendung DPBS, das Ca 2+ und Mg <sup&gt; 2+ da zweiwertige Kationen regulieren Proteinfaltung. </li></ol></li><li> Seed-Zellen auf Deckgläsern in eine Vertiefung einer 12 Multiwellplatte (wo Scheiben passen). Um dies zu tun, verwenden Sie ein hochkonzentrierte Zellsuspension zu Zellverlust nach der Verlegung die dorsale Substrat zu vermeiden. </li><li> Sorgfältig und mit Hilfe einer Pinzette, überlagern die dorsale Substrat, auf die Zellen. Nachfüllung mit Medium (1 ml) und bei 37 ° C mit 5% CO 2. Hinweis: Das Gewicht der Scheibe wird in die dorsale Substrat Aufschwimmen verhindern. </li><li> Ändern Sie das Medium zweimal pro Woche, wie in Standard-2D-Kulturen. Hinweis: Die Rücken Substrat nicht bewegen, da dies zu Zellschäden führen. </li></ol></li></ol> 3. Analyse Anmerkung: sandwichartigen Kulturen werden auf 2D Substraten, und so ist üblicherweise durch die bereits für Standard-2D-Kulturen entwickelten Verfahren analysiert werden. Da beispielsweise PLLA ist transparent und cells gezwungen sind, innerhalb der xy-Ebene zu bewegen, wird die Mikroskopie als auf 2D-Substraten durchgeführt. Die Zellmigration kann daher als für 2D Kulturen analysiert werden, ohne die Notwendigkeit von Tracking-Zellen in der z-Achse wie für 3D-Kulturen, die das Experiment und Bildanalyse vereinfacht. Um die Wundheilung Assay durch einen Kratzer Test studieren folgen Sie diesem Protokoll: <ol><li> Untersuchung der Zellwanderung (Wundheilungs Assay) innerhalb des sandwichartigen Kultur. <ol><li> Arbeit in einer Kultur Haube sterilen Bedingungen, um sicherzustellen und zu sterilisieren alle Materialien (Deckgläser, Rücken Substrate, Pinzette, etc.) durch UV-Exposition für 30 min. </li><li> Coat die ventralen und dorsalen Substrat mit Fibronektin, um spezifische Zellproteinhaftung leiten. Dazu läßt man die Proben in 20 &amp; mgr; g / ml von Fibronektin in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS), die Ca 2+ und Mg 2+ 1 h gelöst. <ol><li> Nach der Proteinbeschichtung, waschen Sie die Proben zweimal mit DPBSum Protein im Überschuß zu entfernen. Dann inkubieren Proben in DPBS, bis ihre Verwendung, um die Proben vor zu trockener da dies Protein Denaturierung verursachen zu vermeiden. Verwendung DPBS, das Ca 2+ und Mg 2+, da zweiwertige Kationen regulieren Proteinfaltung. </li></ol></li><li> Samenzellen auf den Deckgläschen mit hoher Dichte 13. </li><li> Die Proben werden im Brutschrank bei 37 ° C mit 5% CO 2 und sodass die Zellen Konfluenz erreichen. </li><li> Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um die Zellschicht, um Kratzer zu 2 Zellpopulationen durch einen Spalt getrennt zu erhalten. </li><li> Setzen Sie den ventralen ausgesät Substrat in einem neuen gut geeignet für die Zeitraffer-Akquisition und dem dorsalen Substrate passen (dh 12 Multi-Well-Platte). </li><li> Sorgfältig und mit Hilfe einer Pinzette, überlagern die dorsale Substrat, auf die Zellen und dann nachgefüllt Medium (1 ml für eine 12 Multi-Well-Platte). Hinweis: Das Gewicht der Scheibe wird verhindert ter dorsal Substrat aus schwimmenden. </li><li> Legen Sie die Probe in der Zeitraffer-Mikroskop (bis 37 ° C und 5% CO 2) und nehmen Sie Bilder von der Lückenschluss alle 20 Minuten. </li><li> Analysieren Sie den Lückenschluss mit speziellen Software wie das Plugin MiToBo von ImageJ. 14 </li></ol></li></ol> Hinweis: Protein und Nukleinsäure-Extraktion wird in ähnlicher Weise wie auf der 2D-Substraten durchgeführt. Es gibt nur einen zusätzlichen Schritt, der in der Demontage des sandwichartigen Kultur Lysepuffer direkt auf die Zellen, um die Effizienz der Extraktion hinzuzufügen besteht. Beispielsweise für mRNA-Extraktion: <ol start="2"><li> Extrahieren von mRNA aus sandwichartigen Kulturen <ol><li> Vorbereitung alle Puffer vom kommerziellen Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Nehmen Sie die sandwichartige Kultur aus dem Inkubator. </li><li> Entfernen Sie die Kulturmedien aus den Proben. </li><li> Die Proben einmal Waschen mit DPBS, die Ca2+ und Mg 2+ (1 ml), und entfernen Sie die gesamte Lösung. </li><li> Mit Hilfe einer Pinzette, entfernen Sie den Rücken Substrat und fügen Sie die Lyse-Puffer (350 ul) zur ventralen Substrat. Overlay wieder die dorsale Substrat auf der ventralen Substrat zur Lyse der Zellen auch an der dorsalen Substrat haftet. </li><li> Entfernen Sie die Rücken Substrat, um die Lyse-Lösung zu isolieren. </li><li> Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, um die mRNA zu erhalten. </li></ol></li></ol> Anmerkung: Immunodetektion von Proteinen kann auch als 2D Substraten durchgeführt werden. Seit sandwichartigen Kulturen könnte die korrekte Diffusion der Antikörper und Puffer zu behindern, sollte Inkubationszeiten erhöht werden. Auch kann das Sandwich vor dem Starten des Färbeprotokoll demontiert werden, aber im letzteren Fall einige Zellen im dorsalen Substrat und einige zur ventralen Substrat verbunden bleiben. <ol start="3"><li> Immunodetect Proteine ​​innerhalb einer sandwichartigen Kultur <ol&gt; <li> Die Probe einmal Waschen mit DPBS setzen und mit 4% Formaldehyd in PBS für 20 Minuten bei 4 ° C. Anmerkung: Dorsal Substrat kann während des Fixierungsprozesses, so daß Diffusionsprobleme vermieden entfernt werden. </li><li> Gründlich mit DPBS (1 ml) und dann mit permeabilisieren 0,5% Triton X-100 in DPBS (1 ml) für 5 min bei RT. </li><li> Blockieren unspezifischer Bindungsstellen mit 1% Albumin in DPBS (1 ml) für 30 min bei RT. </li><li> Inkubieren mit dem primären Antikörper (2 ug / ml; 1 ml) in Blockierungslösung 3 h bei RT. </li><li> Für 10 min mit DPBS / 0,5% Tween 20 (1 ml) 3x waschen. </li><li> Inkubieren 2 Std mit sekundärem Antikörper (2 ug / ml) und 1 &amp; mgr; g / ml DAPI in Blocking-Lösung (1 ml) bei RT. </li><li> Für 10 min in DPBS / 0,5% Tween 20 (1 ml) 3x waschen. </li><li> In DPBS waschen. Hinweis: Die Proben können auf einem Objektträger mit Vectashield montiert und mit Nagellack versiegelt, wenn Rücken Substrate vor der Immundetektion entfernt werden. </li><li> Beachten Sie unter dem FluoreszenzmikroUmfang wie für Standard-2D-Substraten. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+third+dimension:+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues.">Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 13), 3015-3024 (2012).</li><li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rev. Mod. Phys. 31 (1), 11-20 (1959).</li><li>Ruffner, H., Lichtenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+systems--towards+primary+drug+discovery+platforms:+an+interview+with+Heinz+Ruffner+(Novartis)+and+Jan+Lichtenberg+(InSphero).">3D cell culture systems--towards primary drug discovery platforms: an interview with Heinz Ruffner (Novartis) and Jan Lichtenberg (InSphero).</a> Biotechnol J. 7 (7), 833-834 (2012).</li><li>Horning, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+tumor+model+for+in+vitro+evaluation+of+anticancer+drugs.">3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs.</a> Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensation+mechanism+in+tumor+cell+migration:+mesenchymal-amoeboid+transition+after+blocking+of+pericellular+proteolysis.">Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis.</a> J Cell Biol. 160 (2), 267-277 (2003).</li><li>Schor, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+'sandwich'+assay+for+quantifying+chemo-regulated+cell+migration+within+3-dimensional+matrices:+wound+healing+cytokines+exhibit+distinct+motogenic+activities+compared+to+the+transmembrane+assay.">A novel 'sandwich' assay for quantifying chemo-regulated cell migration within 3-dimensional matrices: wound healing cytokines exhibit distinct motogenic activities compared to the transmembrane assay.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 63 (5), 287-300 (2006).</li><li>Lee, E. J., Hwang, C. M., Baek, D. H., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+system+for+the+assessment+of+cell+migration+on+3D+micropatterned+substrates.">Fabrication of microfluidic system for the assessment of cell migration on 3D micropatterned substrates.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009 (2009), 6034-6037 (2009).</li><li>Zaman, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+tumor+cells+in+3D+matrices+is+governed+by+matrix+stiffness+along+with+cell-matrix+adhesion+and+proteolysis.">Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 10889-10894 (2006).</li><li>Ballester-Beltr&#225;n, J., Lebourg, M., Salmer&#243;n-S&#225;nchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+and+ventral+stimuli+in+sandwich-like+microenvironments.+Effect+on+cell+differentiation.">Dorsal and ventral stimuli in sandwich-like microenvironments. Effect on cell differentiation.</a> Biotechnol Bioeng. 110 (11), 3048-3058 (2013).</li><li>Ballester-Beltr&#225;n, J., Lebourg, M., Moratal, D., Salmer&#243;n-S&#225;nchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin-matrix+sandwich-like+microenvironments+to+manipulate+cell+fate.">Fibronectin-matrix sandwich-like microenvironments to manipulate cell fate.</a> Biomater. Sci. 2 (3), 381-389 (2014).</li><li>Ballester-Beltr&#225;n, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmer&#243;n-S&#225;nchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+and+ventral+stimuli+in+cell-material+interactions:+effect+on+cell+morphology.">Dorsal and ventral stimuli in cell-material interactions: effect on cell morphology.</a> Biointerphases. 7 (1-4), 39 (2012).</li><li>Ballester-Beltr&#225;n, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmer&#243;n-S&#225;nchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+within+confined+sandwich-like+nanoenvironments.">Cell migration within confined sandwich-like nanoenvironments.</a> Nanomedicine. , (2015).</li><li>Gla&#223;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration+Analysis:+Segmenting+Scratch+Assay+Images+with+Level+Sets+and+Support+Vector+Machines.">Cell Migration Analysis: Segmenting Scratch Assay Images with Level Sets and Support Vector Machines.</a> Pattern Recogn. 45 (9), 3154-3165 (2012).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li><li>Huebsch, N., Arany, P. R., Mao, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+traction-mediated+manipulation+of+the+cell/matrix+interface+to+control+stem-cell+fate.">Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate.</a> Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).</li><li>Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonpolarized+signaling+reveals+two+distinct+modes+of+3D+cell+migration.">Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration.</a> J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).</li><li>Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulatory+effects+of+a+three-dimensional+microenvironment+on+cell-mediated+fibronectin+fibrillogenesis.">Stimulatory effects of a three-dimensional microenvironment on cell-mediated fibronectin fibrillogenesis.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 19), 4427-4436 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Heutzutage ist 3D-Kultur ein wichtiges Thema für die pharmazeutische und biotechnologische Industrie und Forschung in der Zellbiologie, einschließlich Krebs und Stammzellen. Als Folge mehrere 3D-Kultursysteme entwickelt worden. Leider Unterschiede zwischen den 3D-Systemen in der Regel in verschiedenen Zellverhalten führen, behindert das Verständnis der Zellschicksal. Außerdem sind die experimentellen Verfahren in der Regel nicht so einfach, wie für die 2D-Kultursysteme. Daher die Entwicklung neuer Kultursystemen v...

Traditionell Zellkultur wurde auf zweidimensionalen (2D) als Substrate verwendet, obwohl die meisten in vivo zelluläre Mikro eine dreidimensionale (3D) Natur. Diese unnatürliche 2D-Umgebung löst Veränderungen im Verhalten der Zelle als eine Möglichkeit der Selbstanpassung zu einer flachen Welt, die einen direkten Einfluss auf das Schicksal der Zelle 1,2. Daher Ergebnisse auf 2D-Zellkulturen erhalten werden, sind nicht immer reproduzierbar in vivo. Dies hat die Entwicklung von neuen relevanten Kultursystemen versuchen, mehrere physiologische ähnlichen Bedingungen um weitere Einblicke in jeder Dimension abhängige biologische Mechanismus 3,4 zu liefern gefördert. Einer der Hauptunterschiede zwischen dem 2D- und dem 3D-Kultur in vivo-Umgebung ist die Verteilung der Zellen-Rezeptoren der extrazellulären Matrix (ECM) verankert ist: während auf 2D Substrate Zellen ventral haften, sind die Mehrzahl der Zellen in vivo vollständig durch das ECM umgeben so cell Adhäsion tritt durch eine 3D-Verteilung von Rezeptoren. Dies löst verschiedene Zelladhäsion Signaltransduktionswege modulieren, wodurch wichtige Prozesse wie Zellwachstum, Zelldifferenzierung und Genexpression. In den letzten Jahrzehnten wurden viele verschiedene 3D-Kultursysteme etabliert 5-8, obwohl ihre Variabilität und Komplexität behindert deren Standardisierung gemeinsam Zellkulturverfahren. Außerdem 3D-Systeme sind in der Regel nicht leicht zu handhaben und zu aktuellen experimentellen Verfahren 2D Substrate nicht ohne weiteres für die 3D-Kulturen hergestellt werden. Außerdem Literatur selten vergleicht 3D-Kulturen mit dem Äquivalent 2D Bedingung oder anderen 3D-Systemen, behindern die richtige Verständnis des Zellverhaltens in diesen Modellen. Sobald mit den Zellen auf einem 2D Substrat die Anregung der dorsalen Rezeptoren haften - durch Überlagerung einer Schicht aus einem neuen Material (Sandwich-ähnlichen Kultur) - Zell-Antworten können gleichermaßen 3D-Umgebungen auszulösen. Die reaSohn dafür ist die gleichzeitige Aktivierung sowohl dorsalen und ventralen Rezeptoren zu haften und in der Sandwich-Umgebung verteilt (Abbildung 1) 9,10. Als Konsequenz Zellen eine wichtige Änderungen bezüglich 2D Kulturen 11,12. Auf diese Weise wird das Schicksal der Zelle bei der Montage aufgrund der Sandwichkultur bestimmt, da die Rücken Stimulation löst Veränderungen im zellulären Wege-Taste. Daher wird das Zellschicksal stark von der Zeit, wenn die sandwichartige Kultur zusammengebaut 11 bestimmt. Aufgrund der Natur des Systems, ist eine sandwichartige Kultur ein einfaches und vielseitiges Werkzeug, das Studium der verschiedenen Parameter in Zell / Material-Wechselwirkungen wie Chemie, Topographie, Steifigkeit und Proteinbeschichtungen sowohl auf der ventralen und dorsalen Seiten ermöglicht. Dies bietet einen höheren Grad an Flexibilität im Vergleich zu anderen 3D-Systemen (Figur 2) aufgrund der unabhängigen dorsalen und ventralen Kombination verschieden variety der Oberflächenbeschaffenheit. Zudem können andere Zelllinien und verschiedene Zeiten, die sandwichartig zusammenzusetzen Kultur untersucht werden, was die breite Spektren von Möglichkeiten. Ein Standardprotokoll des sandwichartigen Kultur wird unter Verwendung von detaillierten entweder Poly-L-Milchsäure (PLLA) elektrogesponnenen Fasern oder Folien als Rücken Substraten Deckglas als ventral Substrat und Fibronectin als Proteinbeschichtung. Sandwichartigen Kulturen wurden direkt nach Zellaussaat oder nach 3 h von 2D-Kultur zusammengebaut. Beachten Sie jedoch, dass andere Materialsysteme und Proteine ​​eingesetzt werden könnten; ebenfalls sandwichartigen Kultur kann zu unterschiedlichen Zeitpunkten zusammengesetzt werden.

<table><tbody><tr><td>Ploy(lactic acid)</td><td>NatureWorks</td><td>4042D</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Cover glasses (12 mm&amp;Oslash;)</td><td>Marienfeld</td><td>631-0666</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Scharlab</td><td>CL0200</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td><td>Sigma</td><td>105228</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Syringe (1 ml)</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010-200V0</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE1000</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>High Voltage DC Power Supply</td><td>Glassman High Voltage</td><td>Series FC</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Hucoa-Herl&amp;ouml;s</td><td>3111</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Laminar flow&amp;nbsp; hood</td><td>Telstar</td><td>AV30/70</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Human Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMI 6000</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7409</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>Reagent</td></tr></tbody></table>

sandwich-like microenvironments to harness cell/material interactions

Zellkultur wurde traditionell auf zweidimensionalen (2D) Substrate, wo Zellen mit Rezeptoren, die zur ventralen Biomaterialoberfläche haften geführt. Jedoch in vivo, die meisten Zellen sind vollständig von der extrazellulären Matrix (ECM) umgeben ist, was in einem dreidimensionalen (3D) Verteilung der Rezeptoren. Hiermit können die Unterschiede in der Outside-in-Signalwege und damit das Verhalten der Zelle auslösen. Dieser Artikel zeigt, dass die Stimulation der dorsalen Rezeptoren von Zellen durch Überlagerung eines Films aus einem neuen Material (a sandwichartigen Kultur) bereits zu einer 2D-Substrat haftet löst wichtige Änderungen in Bezug auf Standard-2D-Kulturen. Außerdem verschiebt sich die gleichzeitige Anregung ventralen und dorsalen Rezeptoren Zellverhalten stärker an die in 3D-Umgebungen gefunden. Zusätzlich aufgrund der Art des Systems ist eine sandwichartige Kultur ein vielseitiges Werkzeug, das die Untersuchung der verschiedenen Parameter in Zell / Material inte ermöglichtractions zB Topographie, Steifigkeit und unterschiedlichen Proteinbeschichtungen sowohl auf der ventralen und dorsalen Seiten. Da schließlich sandwichartigen Kulturen werden auf 2D Substraten, mehrere Analyseverfahren bereits für Standard-2D-Kulturen entwickelt normalerweise verwendet werden kann, die Überwindung komplexere Verfahren für die 3D-Systemen benötigt.

Die Stimulation der Rezeptoren dorsal im sandwichartigen Kultur löst Veränderungen in der Zellmorphologie, Zelladhäsion und intrazelluläre Signalwege (zB focal adhesion kinase, FAK) 10-12. Als Beispiel Fibroblasten innerhalb des sandwichartigen System kultiviert überexprimiert die α 5-Integrin-Untereinheit im Vergleich zu dem 2D, wie für andere 3D-Kulturen 15,16 beobachtet. Zellschicksal ist stark abhängig von der Zeit, wenn die Rücken Rezep...

Watch this Scientific Journal Video about Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions at JoVE.com

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Sandwichartigen Mikroumgebungen zu nutzen Handy / Material-Interaktionen

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

sandwich-like-microenvironments-to-harness-cellmaterial-interactions

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K Aufrufe.  Universitat Politècnica de València. The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Serie: Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Mikrofabrizierten Plattformen für Mechanisch Dynamische Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Forschung

Biotechnik

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events leading to stromal activation and establishment of the tumor microenvironment (TME). Several in vitro and in vivo models of the TME have been developed; however, in general these models do not readily permit isolation of individual cell populations, under non-perturbing conditions, for further study. To circumvent this difficulty, we have employed an in vitro TME model using a cell growth substrate consisting of a permeable microporous membrane insert that permits simple generation of highly enriched cell populations grown intimately, yet separately, on either side of the insert&#39;s membrane for extended co-culture times. Through use of this model, we are capable of generating greatly enriched cancer-associated fibroblast (CAF) populations from normal diploid human fibroblasts following co-culture (120 hr) with highly metastatic human breast carcinoma cells, without the use of fluorescent tagging and/or cell sorting. Additionally, by modulating the pore-size of the insert, we can control for the mode of intercellular communication (e.g., gap-junction communication, secreted factors) between the two heterotypic cell populations, which permits investigation of the mechanisms underlying the development of the TME, including the role of gap-junction permeability. This model serves as a valuable tool in enhancing our understanding of the initial events leading to cancer-stroma initiation, the early evolution of the TME, and the modulating effect of the stroma on the responses of cancer cells to therapeutic agents.

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

Ein Mimic des Tumor-Microenvironment: Eine einfache Methode für Enriched Zellpopulationen Generierung und Untersuchung der interzellulären Kommunikation

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

Krebsforschung

Silicon Microchips for Manipulating Cell-cell Interaction

The role of the cellular microenvironment is recognized as crucial in determining cell fate and function in virtually all mammalian tissues from development to malignant transformation.&nbsp; In particular, interaction with neighboring stroma has been implicated in a plethora of biological phenomena; however, conventional techniques limit the ability to interrogate the spatial and dynamic elements of such interactions.
In Micromechanical Reconfigurable Culture (RC), we employ a micromachined silicon substrate with moving parts to dynamically control cell-cell interactions through mechanical repositioning. Previously, this method has been applied to investigate intercellular communication in co-cultures of hepatocytes and non-parenchymal cells, demonstrating time-dependent interactions and a limited range for soluble signaling 1.
Here, we describe in detail the preparation and use of the RC system. We begin by demonstrating the handling of the device parts using tweezers, including actuating between the gap and contact configurations (cell populations separated by a narrow 80-&micro;m gap, or in direct intimate contact). Next, we detail the process of preparing the substrates for culture, and the multi-step cell seeding process required for obtaining confluent cell monolayers. Using live microscopy, we then illustrate real-time manipulation of cells between the different possible experimental configurations. Finally, we demonstrate the steps required in order to regenerate the device surface for reuse: toluene and piranha cleaning, polystyrene coating, and oxygen plasma treatment.

This article describes an experimental approach for dynamic regulation of cell-cell interactions between adherent cells on a micrometer scale. Manipulation of intercellular communication between hepatocytes and stromal cell is demonstrated. The developed platform enables investigation of cell-cell interactions in a variety of biological processes, including development and pathogenesis.

Silizium-Mikrochips zur Manipulation Zell-Zell-Interaktion

The role of the cellular microenvironment is recognized as crucial in determining cell fate and function in virtually all mammalian tissues from ...

Biologie

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other physical or chemical stimuli. They have been commonly used for in vitro cell studies by providing in vivo like surroundings. Especially, how cells response to chemical gradients, electrical fields, and shear stresses has drawn many interests since these phenomena are important in understanding cellular properties and functions. These microfluidic chips can be made of glass substrates, silicon wafers, polydimethylsiloxane (PDMS) polymers, polymethylmethacrylate (PMMA) substrates, or polyethyleneterephthalate (PET) substrates. Out of these materials, PMMA substrates are cheap and can be easily processed using laser ablation and writing. Although a few microfluidic devices have been designed and fabricated for generating multiple, coexisting chemical and electrical stimuli, none of them was considered efficient enough in reducing experimental repeats, particular for screening purposes. In this report, we describe our design and fabrication of two PMMA-based microfluidic chips for investigating cellular responses, in the production of reactive oxygen species and the migration, under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli. The first chip generates five relative concentrations of 0, 1/8, 1/2, 7/8, and 1 in the culture regions, together with a shear stress gradient produced inside each of these areas. The second chip generates the same relative concentrations, but with five different electric field strengths created within each culture area. These devices not only provide cells with a precise, controllable micro-environment but also greatly increase the experimental throughput.

Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

Entwerfen Mikrofluidiksysteme für ein Studium zellulären Reaktionen Unter Einzel- oder Coexisting Chemie / Elektro / Schubspannung Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Ein Hochdurchsatz-Zellarray-Plattform für korrelative Analyse von Zelldifferenzierung und Zugkräften

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Herstellung eines Multiplex künstliche zellulären Mikroumgebung Arrays

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

3D-Analyse von multizellulären Reaktionen auf tschoattraktive Verläufe

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Erzeugung dynamischer Umgebungsbedingungen mit einem hochdurchsatzstarken mikrofluidischen Gerät

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

Herstellung und Verwendung von Mikroumgebung Microarrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Generation of Multicue Cellular Microenvironments by UV-Photopatterning of Three-Dimensional Cell Culture Substrates

The extracellular matrix is an important regulator of cell function. Environmental cues existing in the cellular microenvironment, such as ligand distribution and tissue geometry, have been increasingly shown to play critical roles in governing cell phenotype and behavior. However, these environmental cues and their effects on cells are often studied separately using in vitro platforms that isolate individual cues, a strategy that heavily oversimplifies the complex in vivo situation of multiple cues. Engineering approaches can be particularly useful to bridge this gap, by developing experimental setups that capture the complexity of the in vivo microenvironment, yet retain the degree of precision and manipulability of in vitro systems.
This study highlights an approach combining ultraviolet (UV)-based protein patterning and lithography-based substrate microfabrication, which together enable high-throughput investigation into cell behaviors in multicue environments. By means of maskless UV-photopatterning, it is possible to create complex, adhesive protein distributions on three-dimensional (3D) cell culture substrates on chips that contain a variety of well-defined geometrical cues. The proposed technique can be employed for culture substrates made from different polymeric materials and combined with adhesive patterned areas of a broad range of proteins. With this approach, single cells, as well as monolayers, can be subjected to combinations of geometrical cues and contact guidance cues presented by the patterned substrates. Systematic research using combinations of chip materials, protein patterns, and cell types can thus provide fundamental insights into cellular responses to multicue environments.

Traditionally, cell culture is performed on planar substrates that poorly mimic the natural environment of cells in vivo. Here we describe a method to produce cell culture substrates with physiologically relevant curved geometries and micropatterned extracellular proteins, allowing systematic investigations into cellular sensing of these extracellular cues.