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背の基板1の製造<ol><li>溶媒キャスティングによるPLLAのフラットフィルムの製造。 <ol><li>完全に溶解するまで（約3時間）、室温（RT）で攪拌し、クロロホルム中の2％（w / v）のPLLA（100mLのクロロホルム中の2gのPLLA）の溶液を調製し、ドラフト中で作業。 </li><li>ガラスシャーレ上にワッシャーを配置します。 注：（腹サンプル直径よりわずかに小さい）10.5ミリメートルの内径で使用ステンレス鋼ワッシャをワッシャが腹側基板の上に配置されるようになっています。ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）またはガラス洗濯機のような他の材料も同様に使用することができます。 </li><li>洗濯機でPLLA溶液200μlを加え、室温で30分間ゆっくりと蒸発させます。溶媒をゆっくり蒸発を可能にするために、いくつかの穴を持つアルミホイルでペトリ皿を閉じ。 </li><li>溶媒の痕跡を蒸発させるために5分間120℃で試料を加熱します。 </li><li>サンプルはクールやってみましょうRTでWN。 </li><li>サンプルは（30分程度）まで冷却した後、ペトリ皿中·cmの水18.2MΩで覆い、室温で8分間インキュベートします。 注：サンプルを完全に冷却されていない場合は、·cmの水18.2MΩを取るとゴム状態を採用することができます。さらに、8未満分·cmの水18.2MΩでインキュベートして、不適切な脱離で、ワッシャから離脱以上の8分なることがあります。 </li><li>かみそりの刃で、ペトリ皿を、それらを剥離するワッシャを取り外します。 </li><li>ピンセットでワッシャの端から任意の欠陥を除去し、試料は空気乾燥してみましょう。 </li><li> PLLAは、加水分解により分解可能であるため、実験日まで、真空デシケーター（80ミリバール）でサンプルを保管してください。 </li></ol></li><li>エレクトロスピニングによるPLLA繊維の製造。 <ol><li> stirrによりヘキサフルオロイソプロパノール中の（w / v）のPLLA（100ミリリットルヘキサ8グラムPLLA）8％の溶液を調製し、ヒュームフード内で作業完全に溶解するまで（約3時間）は室温でる。 </li><li>それぞれランダムまたは整列した繊維を得るために、アルミニウムシート上に、またはエレクトロスピニングのためのドラムにポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、洗濯機を置きます。 注：使用し、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、ワッシャー（腹サンプル直径よりわずかに小さい）10.5ミリメートルの内径を有するワッシャを腹側基板の上に配置されるようになっています。例えば、ステンレス鋼又はガラスワッシャーのような他の材料も同様に使用することができます。ドラムは、整列した繊維を得るためには160.7秒-1（半径= 7センチ）の角速度で回転させるべきです。遅い速度は、繊維配向と壊れた繊維になります高速化は発生しません。 </li><li>ポリマー溶液と注射器をロードして、シリンジポンプの上に置きます。 </li><li> 30キロボルトの電圧を0.9ミリリットル/時間の流速及び12cmのコレクタ距離を用いてPLLA溶液をエレクトロスピニング。 </li><li>エレクトロスピニング法の後方を停止ER 20〜30分、（細胞は、同時に複数の繊維と相互作用する必要があるため）一度良好な繊維密度が達成されます。 </li><li>溶媒の痕跡を蒸発させるために5分間120℃で試料を加熱します。 </li><li> PLLAは、加水分解により分解可能であるため、実験日まで、真空デシケーター（80ミリバール）でサンプルを保管してください。 </li></ol></li></ol> 2.サンドイッチ文化<ol><li>細胞は腹側2D基板に接着されるとサンドイッチ状文化を組み立てます。 <ol><li>培養フード中で作業は、無菌状態を確保し、30分間UV照射して、すべての材料（カバーガラス、背面基板、ピンセットなど ） を滅菌します。 </li><li>特異的細胞タンパク質付着を指示するために、コートフィブロネクチンと腹側と背側の基板を。これを行うには、のCa 2+およびMg 2+（200μL/秒を含むダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）中に溶解し、フィブロネクチン20μg/ mlの中でサンプルをインキュベート1時間）十分。 注：溶剤キャストフィルムとエレクトロ繊維は洗濯機の側面の一方に取り付けられているためにより製造工程に、背側基板は、指定された上部と下部の側面を持っています。この辺は、したがって、細胞（ 図3）に対向するものです。 <ol><li>タンパク質コーティングの後、過剰なタンパク質を除去するためにDPBSで二回サンプルを洗浄します。そして、これはタンパク質の変性を引き起こすため、乾燥なってからサンプルを防ぐためにそれらを使用するまでDPBSでサンプルをインキュベートします。二価の陽イオンは、タンパク質の折り畳みを調節することからのCa 2+およびMg 2+を含む使用DPBS。 </li></ol></li><li>ガラスの種子細胞は13をカバースリップ。 注：サンドイッチ様培養物を2D基板に基づいているように、細胞播種は、2Dサンプル上と同様に行われます。例えば、C2C12筋芽は-1分化実験およびNIH3T3線維芽細胞のためには、7,000℃で播種された17,500個の細胞で播種し、ellsの-1細胞形態との密着性を研究するために、単離された培養物について。 </li><li> 5％CO 2で37℃のインキュベーターでサンプルを置き、細胞が3時間腹基板に接着することができます。 </li><li> （ワッシャーが収まら）12マルチウェルプレートの新しいウェル内腹シードの基板を配置します。 注：新しい十分にサンドイッチ状文化を組み立てることは、これらの栄養素を消費し、内の培養細胞に影響を与える増殖因子および廃棄物を分泌するため、播種後ウェルの底に付着した細胞を取り除くために一つの方法ですサンドイッチのようなシステム。これは、サンドイッチのような環境内で培養した細胞のみを溶解するために、また、細胞抽出のための絶対必要です。 </li><li>慎重にピンセットの助けを借りて、細胞の背側基板をオーバーレイ。培地（1ml）で補充し、5％CO 2、37℃でインキュベートします。 注意：ワッシャーの重量は背側のサブを防ぐことができますフローティングからstrate。 </li><li>標準的な2D培養のように1週間に2回培地を変更します。これは細胞の損傷につながる可能性があるので、背側基板を移動しないでください。 </li></ol></li><li>ちょうど細胞播種後にサンドイッチ状文化を組み立てます。 <ol><li>培養フード中で作業は、無菌状態を確保し、30分間UV照射して、すべての材料（カバーガラス、背面基板、ピンセットなど ） を滅菌します。 </li><li>特異的細胞タンパク質付着を指示するために、コートフィブロネクチンと腹側と背側の基板を。これを行うには、のCa 2+およびMg 2+を 1時間（200μL/サンプル）を含むDPBSに溶解フィブロネクチンの20 / mlの中でサンプルをインキュベートします。 <ol><li>タンパク質コーティングの後、過剰なタンパク質を除去するためにDPBSで二回サンプルを洗浄します。そして、これはタンパク質の変性を引き起こすため、乾燥なってからサンプルを防ぐためにそれらを使用するまでDPBSでサンプルをインキュベートします。のCa 2+およびMgを含む使用DPBS <s二価の陽イオンは、タンパク質の折り畳みを調節するので2+&gt;まで。 </li></ol></li><li> （ワッシャーが収まら）12マルチウェルプレートのウェル中のガラスカバースリップ上にシード細胞。これを行うには、背側基板を敷設した後、細胞の損失を回避するために、高度に濃縮された細胞懸濁液を使用しています。 </li><li>慎重にピンセットの助けを借りて、細胞の背側基板をオーバーレイ。培地（1ml）で補充し、5％CO 2、37℃でインキュベートします。 注意：ワッシャーの重量はフローティングから背側基板を防ぐことができます。 </li><li>標準的な2D培養のように1週間に2回培地を変更します。 注：これは、細胞損傷をもたらす可能性があるので、背側基板を移動しないでください。 </li></ol></li></ol> 3.分析注：サンドイッチ状培養物を2D基板に基づいており、そのため一般に、既に標準2D培養のために開発された手順によって分析することができます。例えば、PLLAは透明とセル画であるため、LSは、xy平面内で移動するように拘束され、顕微鏡検査は2D基板上のように行われます。細胞移動は、従って、実験および画像解析を簡素化し、3D培養の場合と同様に、z軸に細胞を追跡する必要性なしに、2D培養の場合と同様に分析することができます。スクラッチアッセイによってアッセイ創傷治癒を研究するため、このプロトコルは、次のとおりです。 <ol><li>サンドイッチ状の培養内の研究細胞の移動（創傷治癒アッセイ）。 <ol><li>培養フード中で作業は、無菌状態を確保し、30分間UV照射して、すべての材料（カバーガラス、背面基板、ピンセットなど ） を滅菌します。 </li><li>特異的細胞タンパク質付着を指示するために、コートフィブロネクチンと腹側と背側の基板を。これを行うには、1時間2+のCa 2+およびMgを含むダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）中に溶解し、フィブロネクチン20μg/ mlの中でサンプルをインキュベートします。 <ol><li>タンパク質コーティングの後、DPBSで二回サンプルを洗浄過剰なタンパク質を除去するためです。そして、これはタンパク質の変性を引き起こす可能性があるので、乾燥なってからサンプルを防ぐためにそれらを使用するまでDPBSでサンプルをインキュベートします。二価の陽イオンは、タンパク質の折り畳みを調節することからのCa 2+およびMg 2+を含む使用DPBS。 </li></ol></li><li>高密度13でガラスカバースリップ上の細胞をシード。 </li><li> 5％CO 2で37℃のインキュベーター内でサンプルを置き、細胞がコンフルエンスを達成することを可能にします。 </li><li>ギャップによって分離2細胞集団を得るために細胞単層を傷つけピペットチップを使用してください。 </li><li>タイムラプス取得のための新しい同様に適切で腹シードの基板を配置し、背側の基板（ すなわち 12マルチウェルプレート）を取り付けてあります。 </li><li>慎重にピンセットの助けを借りて、細胞の背側基板をオーバーレイしてから（12マルチウェルプレートには1 ml）を培地に補充します。 注意：ワッシャーの重量はTを防ぐことができます彼は、フローティングから基板を背側。 </li><li> （37℃、5％CO 2に設定）タイムラプス顕微鏡でサンプルを置き、隙間閉鎖の画像ごとに20分を取ります。 </li><li>このようなImageJのプラグインからのMiToBoとして、特定のソフトウェアを使用して、隙間閉鎖を分析します。14 </li></ol></li></ol>注：タンパク質および核酸抽出を2次元基板上と同様に行われます。抽出効率を向上させるために細胞に直接、溶解緩衝液を添加することがサンドイッチ状培養物を分解することからなる唯一の余分なステップがあります。例えば、mRNA抽出のために： <ol start="2"><li>サンドイッチ状の培養からmRNAを抽出します<ol><li>製造業者の説明書に従って市販のキットからすべてのバッファを準備します。 </li><li>インキュベーターからサンドイッチ状文化を取り出します。 </li><li>サンプルから培地を除去します。 </li><li>カルシウムを含むDPBSで一度サンプルを洗います2+およびMg 2+（1ml）およびすべてのソリューションを削除します。 </li><li>ピンセットの助けを借りて、背側基板を除去し、腹側基板に溶解バッファー（350μl）を追加します。また、背側基板に付着した細胞を溶解するために、再び腹基板上に背側基板をオーバーレイ。 </li><li>溶解液を分離するために背側基板を取り外します。 </li><li>のmRNAを取得するには、製造元の指示に従ってください。 </li></ol></li></ol>注：タンパク質の免疫検出はまた、2D基板上のように行うことができます。サンドイッチ状の文化が、抗体および緩衝液の正確な拡散を妨げる可能性があるため、インキュベーション時間を増やす必要があります。また、サンドイッチは、染色プロトコルを開始する前に分解することができるが、後者の場合には、いくつかの細胞が背側基板と腹側の基板にはいくつかに付着したままになります。 <ol start="3"><li>サンドイッチ状文化内Immunodetectタンパク質<ol&gt; <li> DPBSで一度サンプルを洗浄し、4℃で20分間、PBS中の4％ホルムアルデヒドで固定します。 注：背側基板は、拡散の問題が回避されるように、固定プロセスの間に除去することができます。 </li><li> DPBS（1ml）ですすぎ、次いで室温で5分間、DPBS中0.5％トリトンX-100（1 ml）で透過性。 </li><li> RTで30分間、DPBS中の1％アルブミン（1mL）で非特異的結合部位をブロックします。 </li><li>一次抗体とインキュベート（2 / mlの、1ミリリットル）を室温で3時間ブロッキング溶液中で。 </li><li> DPBSで10分/ 0.5％のTween 20（1ミリリットル）のために3回洗浄します。 </li><li>室温で溶液（1 ml）を遮断する二次抗体（2μg/ ml）および1 / mlのDAPIで2時間インキュベートします。 </li><li> DPBSで10分/ 0.5％のTween 20（1ミリリットル）のために3回洗浄します。 </li><li> DPBSで洗浄します。 注：サンプルは、ベクタシールドでスライド上にマウントし、背側基板は、従来の免疫削除されたときにマニキュアで封止することができます。 </li><li>蛍光マイクロ下で観察します標準の2D基板用としてスコープ。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

現在、3D培養は、癌および幹細胞を含む医薬品やバイオテクノロジーの業界だけでなく、細胞生物学の研究のための重要なトピックです。結果として、いくつかの3D培養系が開発されています。残念ながら、3Dシステムの違いは、通常、細胞の運命の理解を妨げ、別の細胞の挙動をもたらします。また、実験手順は、通常の2D培養システムのためのほど簡単ではありません。したがって、これ?...

インビボ細胞微小環境の大部分は3次元（3D）の性質を持っているのに伝統的に、細胞培養物は、二次元（2D）基板上で行われています。この不自然な2D環境では、フラット世界に自己適応の方法として、細胞の挙動の変化をトリガし、これに直接影響を与える細胞の運命1,2。したがって、2D細胞培養に得られた結果は、 生体内で常に再現性がありません。これは、任意の次元に依存する生物学的メカニズムの3,4へのさらなる洞察を得るために、より生理的に似た条件を提供しようとしている新しい関連する培養システムの開発を奨励してきました。 2Dおよび3D培養における生体内環境との間の主な違いの1つは、細胞外マトリックス（ECM）に固定細胞受容体の分布である：2Dに細胞が腹側に付着する基質に対して、 インビボでの細胞の大部分は、完全にECMに囲まれているとこのように、CELLの接着は、受容体の三次元分布を介して行われます。これにより、細胞増殖、細胞分化および遺伝子発現のような重要なプロセスを調節する別の細胞接着シグナル伝達経路を誘発します。その変動性と複雑さは、一般的な細胞培養手順での標準化を妨げるのに、最後の十年の間に、多くの異なる三次元培養系は、5-8を確立されています。また3Dシステムは、通常、取り扱いが容易ではなく、2D基板上に現在の実験手順は、簡単に3Dの文化のために確立することはできません。さらに、文献はほとんどこれらのモデルにおける細胞の挙動の適切な理解を妨げ、同等の2D条件や他の3Dシステムと3Dの文化を比較しません。 一度2D基板上に付着した細胞を持つ、背側の受容体の励起 - 新材料（サンドイッチ状文化）のフィルムを重ねることでは - 似た3D環境の細胞応答を誘発することができます。 REAこの背後にある息子は背側と腹側の受容体付着およびサンドイッチ環境内で拡散する（ 図1）9,10の両方の同時活性化です。結果として、細胞は、2D培養物11,12に対する重要な変更を受けます。背側刺激が重要な細胞経路の変化をトリガするのでこのように、細胞の運命は、理由サンドイッチ文化の組み立て中に決定されます。したがって、細胞の運命は非常にサンドイッチ状培養11を組み立てられた時点で決定されます。 によるシステムの性質上、サンドイッチ状文化は両方腹と背側部で、このような化学、地形、剛性およびタンパク質のコーティングなどの細胞/材料の相互作用における異なるパラメータの研究を可能にする、シンプルで汎用性の高いツールです。これは、幅の広いVの独立した背と腹の組み合わせに他の3Dシステム（ 図2）に比べて汎用性の高い学位を提供しています表面状態のariety。また、サンドイッチ状培養を組み立てるために、異なる細胞株および異なる時間での可能性の広いスペクトルを増加させる、研究することができます。 サンドイッチ様培養の標準プロトコルは、タンパク質コーティングなどの腹側基板およびフィブロネクチンのような背側基板としてカバーガラスをポリ-L-乳酸（PLLA）エレクトロ繊維またはフィルムのいずれかを用いて以下に詳述します。サンドイッチ状の文化だけで、細胞播種後または2D培養3時間後に組み立てました。しかし、他の材料系およびタンパク質を使用できることに注意。同様にサンドイッチ状培養を異なる時点で組み立てることができます。

<table><tbody><tr><td>Ploy(lactic acid)</td><td>NatureWorks</td><td>4042D</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Cover glasses (12 mm&amp;Oslash;)</td><td>Marienfeld</td><td>631-0666</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Scharlab</td><td>CL0200</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td><td>Sigma</td><td>105228</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Syringe (1 ml)</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010-200V0</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE1000</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>High Voltage DC Power Supply</td><td>Glassman High Voltage</td><td>Series FC</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Hucoa-Herl&amp;ouml;s</td><td>3111</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Laminar flow&amp;nbsp; hood</td><td>Telstar</td><td>AV30/70</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Human Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMI 6000</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7409</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>Reagent</td></tr></tbody></table>

sandwich-like microenvironments to harness cell/material interactions

細胞培養物は、伝統的に、細胞が生体材料の表面に腹受容体を使用して接着する二次元（2D）基板上で行われています。しかしながら、インビボで 、細胞のほとんどは完全に受容体の三次元（3D）分布をもたらす、細胞外マトリックス（ECM）によって囲まれています。これは、シグナル伝達経路における外、したがって細胞の挙動での違いをトリガすることができます。 この記事では、すでに新素材（サンドイッチ状文化）のフィルムを重ね合わせることによって、2D基板に付着した細胞の背側の受容体を刺激すると、標準の2D文化に対する重要な変更をトリガーすることを示しています。また、腹側と背側の受容体の同時励起が近い3D環境で見られるものと細胞の挙動をシフトします。また、原因システムの性質上、サンドイッチ状の培養は、細胞/材料INTEで異なるパラメータの研究を可能にする汎用性の高いツールです。ractions、 例えば 、地形、剛性との両方の腹と背側面に異なるタンパク質コーティング。サンドイッチ様培養物を2D基板に基づいているので、最終的に、既に標準的な2D培養のために開発され、いくつかの分析手順は、3Dシステムのために必要な、より複雑な手順を克服し、正常に使用することができます。

サンドイッチ状の培養内の背側の受容体の刺激は、細胞形態の変化、細胞接着および細胞内シグナル伝達経路（ 例えば、焦点接着キナーゼ、FAK）10〜12をトリガーします。他の3Dの文化15,16のために観察されるような例として、サンドイッチ状システム内で培養した線維芽細胞は、2Dと比較して、α5インテグリンサブユニットを過剰発現しました。 <p class="jove_...

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Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

サンドイッチ状の微小環境は、Cell /材料の相互作用を活用します

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

sandwich-like-microenvironments-to-harness-cellmaterial-interactions

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K ビュー.  Universitat Politècnica de València. The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

ビデオ: Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

機械的にダイナミックな細胞培養のための微細加工プラットフォーム

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

生物工学

Silicon Microchips for Manipulating Cell-cell Interaction

The role of the cellular microenvironment is recognized as crucial in determining cell fate and function in virtually all mammalian tissues from development to malignant transformation.&nbsp; In particular, interaction with neighboring stroma has been implicated in a plethora of biological phenomena; however, conventional techniques limit the ability to interrogate the spatial and dynamic elements of such interactions.
In Micromechanical Reconfigurable Culture (RC), we employ a micromachined silicon substrate with moving parts to dynamically control cell-cell interactions through mechanical repositioning. Previously, this method has been applied to investigate intercellular communication in co-cultures of hepatocytes and non-parenchymal cells, demonstrating time-dependent interactions and a limited range for soluble signaling 1.
Here, we describe in detail the preparation and use of the RC system. We begin by demonstrating the handling of the device parts using tweezers, including actuating between the gap and contact configurations (cell populations separated by a narrow 80-&micro;m gap, or in direct intimate contact). Next, we detail the process of preparing the substrates for culture, and the multi-step cell seeding process required for obtaining confluent cell monolayers. Using live microscopy, we then illustrate real-time manipulation of cells between the different possible experimental configurations. Finally, we demonstrate the steps required in order to regenerate the device surface for reuse: toluene and piranha cleaning, polystyrene coating, and oxygen plasma treatment.

This article describes an experimental approach for dynamic regulation of cell-cell interactions between adherent cells on a micrometer scale. Manipulation of intercellular communication between hepatocytes and stromal cell is demonstrated. The developed platform enables investigation of cell-cell interactions in a variety of biological processes, including development and pathogenesis.

細胞間相互作用を操作するためのシリコンマイクロチップ

The role of the cellular microenvironment is recognized as crucial in determining cell fate and function in virtually all mammalian tissues from ...

生物学

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

三次元細胞培養用チップサイズの足場の微細加工

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other physical or chemical stimuli. They have been commonly used for in vitro cell studies by providing in vivo like surroundings. Especially, how cells response to chemical gradients, electrical fields, and shear stresses has drawn many interests since these phenomena are important in understanding cellular properties and functions. These microfluidic chips can be made of glass substrates, silicon wafers, polydimethylsiloxane (PDMS) polymers, polymethylmethacrylate (PMMA) substrates, or polyethyleneterephthalate (PET) substrates. Out of these materials, PMMA substrates are cheap and can be easily processed using laser ablation and writing. Although a few microfluidic devices have been designed and fabricated for generating multiple, coexisting chemical and electrical stimuli, none of them was considered efficient enough in reducing experimental repeats, particular for screening purposes. In this report, we describe our design and fabrication of two PMMA-based microfluidic chips for investigating cellular responses, in the production of reactive oxygen species and the migration, under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli. The first chip generates five relative concentrations of 0, 1/8, 1/2, 7/8, and 1 in the culture regions, together with a shear stress gradient produced inside each of these areas. The second chip generates the same relative concentrations, but with five different electric field strengths created within each culture area. These devices not only provide cells with a precise, controllable micro-environment but also greatly increase the experimental throughput.

Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

シングルまたは共存化学/電気/せん断応力刺激下で細胞応答を研究するためのマイクロ流体デバイスを設計

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

Patterning of Microorganisms and Microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, including studies of microbial physiology and interactions. At the simplest level, accurate spatial patterning of microorganisms would enable reliable, long-term imaging of large numbers of individual cells and transform the ability to quantitatively study distance-dependent microbe-microbe interactions. More uniquely, coupling accurate spatial patterning and full control over environmental conditions, as offered by microfluidic technology, would provide a powerful and versatile platform for single-cell studies in microbial ecology. 
This paper presents a microfluidic platform to produce versatile and user-defined patterns of microorganisms within a microfluidic channel, allowing complete optical access for long-term, high-throughput monitoring. This new microfluidic technology is based on capillarity-assisted particle assembly and exploits the capillary forces arising from the controlled motion of an evaporating suspension inside a microfluidic channel to deposit individual microsized objects in an array of traps microfabricated onto a polydimethylsiloxane (PDMS) substrate. Sequential depositions generate the desired spatial layout of single or multiple types of micro-sized objects, dictated solely by the geometry of the traps and the filling sequence. 
The platform has been calibrated using colloidal particles of different dimensions and materials: it has proven to be a powerful tool to generate diverse colloidal patterns and perform surface functionalization of trapped particles. Furthermore, the platform was tested on microbial cells, using Escherichia coli cells as a model bacterium. Thousands of individual cells were patterned on the surface, and their growth was monitored over time. In this platform, the coupling of single-cell deposition and microfluidic technology allows both geometric patterning of microorganisms and precise control of environmental conditions. It thus opens a window into the physiology of single microbes and the ecology of microbe-microbe interactions, as shown by preliminary experiments.

We present a technology that uses capillarity-assisted assembly in a microfluidic platform to pattern micro-sized objects suspended in a liquid, such as bacteria and colloids, into prescribed arrays on a polydimethylsiloxane substrate.

シーケンシャルキャピラリティーアシストアセンブリによる微生物と微粒子のパターニング

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, ...

工学

A Microfluidics Approach for the Functional Investigation of Signaling Oscillations Governing Somitogenesis

Periodic segmentation of the presomitic mesoderm of a developing mouse embryo is controlled by a network of signaling pathways. Signaling oscillations and gradients are thought to control the timing and spacing of segment formation, respectively. While the involved signaling pathways have been studied extensively over the last decades, direct evidence for the function of signaling oscillations in controlling somitogenesis has been lacking. To enable the functional investigation of signaling dynamics, microfluidics is a previously established tool for the subtle modulation of these dynamics. With this microfluidics-based entrainment approach endogenous signaling oscillations are synchronized by pulses of pathway modulators. This enables modulation of, for instance, the oscillation period or the phase-relationship between two oscillating pathways. Furthermore, spatial gradients of pathway modulators can be established along the tissue to study how specific changes in the signaling gradients affect somitogenesis.
The present protocol is meant to help establish microfluidic approaches for the first-time users of microfluidics. The basic principles and equipment needed to set up a microfluidic system are described, and a chip design is provided, with which a mold for chip generation can conveniently be prepared using a 3D printer. Finally, how to culture primary mouse tissue on a microfluidic chip and how to entrain signaling oscillations to external pulses of pathway modulators are discussed.
This microfluidic system can also be adapted to harbor other in vivo and in vitro model systems such as gastruloids and organoids for functional investigation of signaling dynamics and morphogen gradients in other contexts.

A protocol for the culture and manipulation of mouse embryonic tissue on a microfluidic chip is provided. By applying pulses of pathway modulators, this system can be used to externally control signaling oscillations for the functional investigation of mouse somitogenesis.

ソミトジェネシスを支配するシグナル伝達振動の機能的調査のためのマイクロフルイディクスアプローチ

Periodic segmentation of the presomitic mesoderm of a developing mouse embryo is controlled by a network of signaling pathways. Signaling oscillations and ...

発生生物学

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

多重の人工細胞の微小環境配列の作製

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

化学誘引物質勾配に対するマルチセル応答の3D 解析

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

ハイスループットマイクロ流体装置を用いた動的環境条件の生成

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

微小環境マイクロアレイの作製と利用（MEArrays）

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...