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1. Produzione di dorsali Substrati <ol><li> Produzione di un film piano di PLLA per colata solvente. <ol><li> Lavorare in una cappa aspirante per preparare una soluzione di 2% (w / v) PLLA in cloroformio (2 g PLLA in 100 ml di cloroformio) agitando a temperatura ambiente (RT) fino a completa dissoluzione (3 ore circa). </li><li> Mettere le rondelle su una piastra di Petri di vetro. Nota: Usare rondelle in acciaio inossidabile con un diametro interno di 10,5 mm (leggermente inferiore al diametro del campione ventrale) in modo che la rondella è posto sulla parte superiore del substrato ventrale. Altri materiali quali politetrafluoroetilene (PTFE) o lavabicchieri possono essere usati pure. </li><li> Aggiungere 200 microlitri della soluzione di PLLA nella lavatrice e far evaporare lentamente per 30 minuti a RT. Per consentire lenta evaporazione del solvente, chiudere la piastra di Petri con un foglio di alluminio con alcuni fori. </li><li> Riscaldare i campioni a 120 ° C per 5 minuti in modo da far evaporare tracce di solvente. </li><li> Lasciate che i campioni fresca fannown a RT. </li><li> Una volta che i campioni si sono raffreddati (30 min circa), coprire con 18,2 MW · cm di acqua nella scatola di Petri e incubare per 8 minuti a temperatura ambiente. Nota: Se i campioni non sono completamente raffreddate, possono richiedere fino 18,2 MW · cm di acqua e adottare uno stato gommoso. Inoltre, incubando a 18,2 M · cm di acqua per meno di 8 min può provocare il distacco improprio, e per più di 8 min nel distacco dalla lavatrice. </li><li> Con una lama di rasoio, leva le rondelle di toglierle la piastra di Petri. </li><li> Rimuovere eventuali imperfezioni dal bordo della rondella con le pinzette e lasciare che i campioni di aria secca. </li><li> Conservare i campioni in un essiccatore sotto vuoto (80 mbar) fino al giorno dell&#39;esperimento perché PLLA è degradabile per idrolisi. </li></ol></li><li> Produzione di fibre PLLA da electrospinning. <ol><li> Lavorare in una cappa aspirante per preparare una soluzione di 8% (w / v) PLLA in esafluoroisopropanolo (8 g PLLA in 100 ml esafluoroisopropanolo) da stirring a RT fino a completa dissoluzione (3 ore circa). </li><li> Posizionare il politetrafluoroetilene (PTFE) rondelle su un foglio di alluminio o su un tamburo per la electrospinning per ottenere fibre casuale o allineate rispettivamente. Nota: Utilizzare politetrafluoroetilene (PTFE) rondelle con diametro interno di 10,5 mm (leggermente inferiore al diametro del campione ventrale) in modo che la rondella è posto sulla parte superiore del substrato ventrale. Altri materiali quali rondelle in acciaio inossidabile o di vetro possono essere usati pure. Il tamburo deve ruotare ad una velocità angolare di 160,7 sec -1 (raggio = 7 cm) in modo da ottenere fibre allineate. Una velocità più bassa può non innescare allineamento delle fibre e di velocità comporta fibre rotte. </li><li> Caricare la siringa con la soluzione di polimero e posizionarlo sulla pompa a siringa. </li><li> Electrospin soluzione PLLA utilizzando una portata 0,9 ml / h con una tensione di 30 kV e una distanza di collettore di 12 cm. </li><li> Arrestare il processo electrospinning poppaer 20-30 min, una volta una buona densità di fibra è ottenuta (poiché le cellule devono interagire con più fibre contemporaneamente). </li><li> Riscaldare i campioni a 120 ° C per 5 minuti in modo da far evaporare tracce di solvente. </li><li> Conservare i campioni in un essiccatore sotto vuoto (80 mbar) fino al giorno dell&#39;esperimento perché PLLA è degradabile per idrolisi. </li></ol></li></ol> Culture 2. Sandwich <ol><li> Montare la cultura sandwich volta che le cellule sono rispettate supporto 2D ventrale. <ol><li> Lavorare in una cappa coltura per garantire condizioni di sterilità e sterilizzare tutti i materiali (vetrini, substrati dorsali, pinzette, ecc) in caso di esposizione ai raggi UV per 30 min. </li><li> Cappotto il substrato ventrale e dorsale con fibronectina per dirigere specifiche adesione cellulare di proteine. Per fare questo, incubare i campioni in 20 mg / ml di fibronectina disciolti in Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS) contenente Ca 2+ e Mg 2+ (200 pl / sampio) per 1 ora. Nota: A causa del processo di fabbricazione, substrati dorsali hanno uno designato lati superiore e inferiore perché le fibre film e elettrofilate solvente fusa attaccati ad uno dei lati della rondella. Questo lato è quindi quello rivolto verso le cellule (Figura 3). <ol><li> Dopo il rivestimento proteico, lavare i campioni due volte con DPBS per rimuovere proteine ​​in eccesso. Poi incubare campioni in DPBS fino al loro utilizzo per evitare di ottenere campioni secco poiché questo provoca proteina denaturalizzazione. Utilizzare DPBS contenenti Ca 2+ e Mg 2+ da cationi bivalenti regolano ripiegamento delle proteine. </li></ol></li><li> Cellule seme sul vetro coprioggetto 13. Nota: Siccome la cultura sandwich si basa su substrati 2D, semina cellulare sarà effettuata allo stesso modo come su un campione 2D. Ad esempio, C2C12 mioblasti vengono seminate a 17.500 cellule cm -1 per esperimenti di differenziazione e NIH3T3 fibroblasti vengono seminate a 7000 cells cm -1 per le culture isolate per studiare la morfologia delle cellule e l&#39;adesione. </li><li> Porre i campioni in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 e consentono alle cellule di aderire al substrato ventrale per 3 ore. </li><li> Posizionare il substrato seminato ventrale in un nuovo pozzo di una piastra 12 multi-pozzo (dove le rondelle). Nota: Assemblaggio cultura sandwich in un nuovo pozzo è un modo per eliminare le cellule che hanno aderito al fondo del pozzo dopo la semina poiché possono consumare nutrienti e secernere fattori di crescita e rifiuti che influenzano le cellule coltivate all&#39;interno sandwich sistema. Questo è anche un must per estrazioni cellulari per lisare solo le cellule coltivate all&#39;interno dell&#39;ambiente sandwich. </li><li> Attenzione e con l&#39;aiuto di un paio di pinzette, sovrapporre il substrato dorsale sulle cellule. Riempire con prodotto (1 ml) e incubare a 37 ° C con 5% di CO 2. Nota: Il peso della rondella impedirà il sub dorsalistrare da galleggiante. </li><li> Cambia il mezzo due volte alla settimana, come nelle culture 2D standard. Non spostare il substrato dorsale in quanto ciò potrebbe causare danni alle cellule. </li></ol></li><li> Montare la cultura sandwich appena dopo la semina delle cellule. <ol><li> Lavorare in una cappa coltura per garantire condizioni di sterilità e sterilizzare tutti i materiali (vetrini, substrati dorsali, pinzette, ecc) in caso di esposizione ai raggi UV per 30 min. </li><li> Cappotto il substrato ventrale e dorsale con fibronectina per dirigere specifiche adesione cellulare di proteine. Per fare questo, incubare i campioni in 20 ug / ml di fibronectina disciolti in DPBS contenenti Ca 2+ e Mg 2+ (200 microlitri / campione) per 1 ora. <ol><li> Dopo il rivestimento proteico, lavare i campioni due volte con DPBS per rimuovere proteine ​​in eccesso. Poi incubare campioni in DPBS fino al loro utilizzo per evitare di ottenere campioni secco poiché questo provoca proteina denaturalizzazione. Utilizzare DPBS contenenti Ca 2+ e Mg <sup&gt; 2+ da cationi bivalenti regolano ripiegamento delle proteine. </li></ol></li><li> Cellule seme su vetrini in un pozzetto di una piastra 12 multi-pozzo (dove rondelle adatte). Per fare questo, utilizzare una sospensione cellulare altamente concentrato per evitare perdita di cellule dopo la posa del substrato dorsale. </li><li> Attenzione e con l&#39;aiuto di un paio di pinzette, sovrapporre il substrato dorsale sulle cellule. Riempire con prodotto (1 ml) e incubare a 37 ° C con 5% di CO 2. Nota: Il peso della rondella impedirà substrato dorsale dal galleggiante. </li><li> Cambia il mezzo due volte alla settimana, come nelle culture 2D standard. Nota: non spostare il substrato dorsale poiché ciò potrebbe causare danni alle cellule. </li></ol></li></ol> 3. Analisi Nota: le culture a sandwich si basano su substrati 2D, e quindi può essere comunemente analizzati con procedure già sviluppate per le culture 2D standard. Ad esempio, poiché PLLA è trasparente e cells sono costretti a spostarsi all&#39;interno del piano xy, microscopia avviene come su substrati 2D. La migrazione cellulare può essere quindi analizzato come per culture 2D, senza la necessità di tracciare cellule in asse z come per culture 3D, che semplifica l&#39;analisi dell&#39;esperimento e l&#39;immagine. Per studiare il saggio guarigione della ferita da un saggio di zero seguire questo protocollo: <ol><li> La migrazione di studio delle cellule (ferita saggio di guarigione), all&#39;interno della cultura sandwich. <ol><li> Lavorare in una cappa coltura per garantire condizioni di sterilità e sterilizzare tutti i materiali (vetrini, substrati dorsali, pinzette, ecc) in caso di esposizione ai raggi UV per 30 min. </li><li> Cappotto il substrato ventrale e dorsale con fibronectina per dirigere specifiche adesione cellulare di proteine. Per fare questo, incubare i campioni in 20 mg / ml di fibronectina disciolti in Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS) contenente Ca 2+ e Mg 2+ per 1 ora. <ol><li> Dopo il rivestimento proteico, lavare i campioni due volte con DPBSal fine di rimuovere la proteina in eccesso. Poi incubare campioni in DPBS fino al loro utilizzo per evitare di ottenere campioni secco poiché questo potrebbe causare proteine ​​denaturalizzazione. Utilizzare DPBS contenenti Ca 2+ e Mg 2+ da cationi bivalenti regolano ripiegamento delle proteine. </li></ol></li><li> Cellule seme sui vetrini in una alta densità 13. </li><li> Porre i campioni in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 e consentono alle cellule di raggiungere confluenza. </li><li> Utilizzare un puntale a graffiare il monostrato cellulare, al fine di ottenere 2 popolazioni cellulari separati da uno spazio. </li><li> Posizionare il substrato seminato ventrale in un nuovo pozzo adatto per l&#39;acquisizione time-lapse e dove i substrati dorsali in forma (cioè 12 piastra multi-bene). </li><li> Attenzione e con l&#39;aiuto di un paio di pinzette, sovrapporre il substrato dorsale sulle cellule e poi riempire con terreno (1 ml per una piastra 12 multi-pozzo). Nota: Il peso della rondella impedirà tegli dorsale supporto a partire da galleggiante. </li><li> Porre il campione nel microscopio time-lapse (impostato a 37 ° C e 5% di CO 2) e prendere le immagini della chiusura del gap ogni 20 min. </li><li> Analizzare la chiusura del gap utilizzando un software specifico come il MiToBo plugin dal ImageJ. 14 </li></ol></li></ol> Nota: Proteine ​​e estrazione degli acidi nucleici avviene allo stesso modo come su substrati 2D. C&#39;è solo un ulteriore passaggio che consiste nello smontare la coltura a sandwich per aggiungere il tampone di lisi direttamente sulle cellule al fine di aumentare l&#39;efficienza di estrazione. Ad esempio, per l&#39;estrazione di mRNA: <ol start="2"><li> Estratto mRNA da culture sandwich <ol><li> Preparare tutti i buffer dal kit commerciale secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Prendere la cultura sandwich fuori dal termostato. </li><li> Rimuovere il terreno di coltura dai campioni. </li><li> Lavare i campioni una volta con DPBS contenente Ca2+ e Mg 2+ (1 ml) e rimuovere tutta la soluzione. </li><li> Con l&#39;aiuto di un paio di pinzette, rimuovere il substrato dorsale e aggiungere la soluzione tampone di lisi (350 microlitri) al substrato ventrale. Sovrapporre nuovo substrato dorsale sul substrato ventrale per lisare le cellule anche aderito al substrato dorsale. </li><li> Rimuovere il substrato dorsale per isolare la soluzione di lisi. </li><li> Seguire le istruzioni del produttore per ottenere il mRNA. </li></ol></li></ol> Nota: immunorilevazione delle proteine ​​può essere eseguita anche su substrati come 2D. Dal momento che le culture sandwich potevano ostacolare la corretta diffusione degli anticorpi e buffer, tempi di incubazione dovrebbero essere aumentati. Inoltre, il sandwich può essere smontato prima di avviare il protocollo di colorazione, ma in quest&#39;ultimo caso alcune cellule rimarrà attaccato al substrato dorsale e alcuni al substrato ventrale. <ol start="3"><li> Proteine ​​Immunodetect all&#39;interno di una cultura sandwich <ol&gt; <li> Lavare il campione una volta con DPBS e fissare con formaldeide al 4% in PBS per 20 minuti a 4 ° C. Nota: substrato dorsale può essere rimosso durante il processo di fissazione in modo da evitare problemi di diffusione. </li><li> Risciacquare con DPBS (1 ml) e quindi permeabilize con 0,5% Triton X-100 in DPBS (1 ml) per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Bloccare non specifici siti di legame con 1% di albumina in DPBS (1 ml) per 30 minuti a RT. </li><li> Incubare con l&#39;anticorpo primario (2 mg / ml; 1 ml) in soluzione di bloccaggio per 3 ore a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 3 volte per 10 min con DPBS / 0,5% Tween 20 (1 ml). </li><li> Incubare 2 hr con anticorpi secondari (2 mg / ml) e 1 mg / ml DAPI in una soluzione bloccante (1 ml) a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 3 volte per 10 minuti in DPBS / 0,5% Tween 20 (1 ml). </li><li> Lavare in DPBS. Nota: I campioni possono essere montati su una diapositiva con Vectashield e sigillati con smalto quando i substrati dorsali vengono rimossi prima della immunolocalizzazione. </li><li> Osservare sotto la micro fluorescenzacampo di applicazione per supporti 2D standard. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Al giorno d&#39;oggi, la cultura 3D è un tema importante per l&#39;industria farmaceutica e biotecnologica, nonché la ricerca in biologia cellulare, tra cui il cancro e le cellule staminali. Di conseguenza sono stati sviluppati diversi sistemi di coltura 3D. Purtroppo, le differenze tra i sistemi 3D di solito determinano il comportamento cellulare diverso, ostacolando la comprensione del destino delle cellule. Inoltre, le procedure sperimentali di solito non sono così semplice come per sistemi di coltura 2D. Quindi l...

Tradizionalmente, coltura cellulare è stata effettuata su (2D) substrati bi-dimensionali, anche se la maggior parte dei microambienti cellulari in vivo hanno un (3D) natura tridimensionale. Questo ambiente 2D innaturale provoca cambiamenti nel comportamento delle cellule, come un modo di auto-adattamento ad un mondo piatto, che influenza direttamente il destino della cellula 1,2. Pertanto, i risultati ottenuti su colture cellulari 2D non sono sempre riproducibili in vivo. Ciò ha favorito lo sviluppo di nuovi sistemi di coltura interessati cercano di fornire condizioni più fisiologiche simili per ottenere ulteriori approfondimenti qualsiasi meccanismo biologico 3,4 dimensione-dipendente. Una delle principali differenze tra la cultura 2D e 3D in ambiente vivo è la distribuzione dei recettori cellulari ancorate alla matrice extracellulare (ECM): considerando che il 2D substrati cellule aderiscono ventralmente, la maggior parte delle cellule in vivo sono completamente circondato dal ECM e quindi cell adesione avviene attraverso una distribuzione 3D dei recettori. Questo innesca diverse vie di segnalazione di adesione delle cellule che modulano in tal modo i processi importanti, come la crescita cellulare, la differenziazione cellulare e l&#39;espressione genica. Nel corso degli ultimi decenni, molti diversi sistemi di coltura 3D sono stati stabiliti 5-8, anche se la loro variabilità e complessità ostacolano la loro standardizzazione delle procedure di coltura delle cellule comune. Inoltre sistemi 3D di solito non sono facili da gestire e le attuali procedure sperimentali su supporti 2D non possono essere facilmente stabiliti per le culture 3D. Inoltre, la letteratura a confronto raramente culture 3D con la condizione 2D equivalente o altri sistemi 3D, ostacolando la corretta comprensione del comportamento delle cellule in questi modelli. Una volta che le cellule aventi aderito su un substrato 2D, l&#39;eccitazione dei recettori dorsali - sovrapponendo una pellicola di un nuovo materiale (coltura a sandwich) - può innescare risposte cellulari simili ambienti 3D. La reafiglio di questo è l&#39;attivazione simultanea di entrambi dorsale e ventrale recettori di aderire e diffondere all&#39;interno dell&#39;ambiente panino (Figura 1) 9,10. Di conseguenza, le cellule subiscono cambiamenti rilevanti rispetto alle colture 2D 11,12. Così, il destino della cellula è determinata durante il montaggio a causa della cultura panino, poiché la stimolazione dorsale provoca variazioni percorsi cellulari chiave. Pertanto, il destino cellulare è fortemente determinato dal tempo in cui la coltura a sandwich è assemblato 11. A causa della natura del sistema, una cultura sandwich è uno strumento semplice e versatile che consente lo studio dei parametri differenti nelle interazioni cellula / materiale come rivestimenti chimica, topografia, rigidità e proteine ​​ad entrambi i lati ventrale e dorsale. Ciò offre un maggior grado di flessibilità rispetto ad altri sistemi 3D (Figura 2) a causa dorsale indipendente e combinazione ventrale un&#39;ampia variety delle condizioni della superficie. Inoltre, diverse linee cellulari e tempi diversi per assemblare la coltura a sandwich possono essere studiati, aumentando l&#39;ampio spettro di possibilità. Un protocollo standard della cultura sandwich è di seguito utilizzando poli-L-lattico (PLLA) fibre elettrofilate o film come substrati dorsali, vetrino di vetro come substrato ventrale e fibronectina come rivestimento proteico. Culture sandwich sono stati assemblati subito dopo la semina delle cellule o dopo 3 ore di coltura 2D. Si noti tuttavia che potrebbero essere utilizzati altri sistemi di materiali e proteine; analogamente la cultura sandwich può essere montato a tempi diversi.

<table><tbody><tr><td>Ploy(lactic acid)</td><td>NatureWorks</td><td>4042D</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Cover glasses (12 mm&amp;Oslash;)</td><td>Marienfeld</td><td>631-0666</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Scharlab</td><td>CL0200</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td><td>Sigma</td><td>105228</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Syringe (1 ml)</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010-200V0</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE1000</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>High Voltage DC Power Supply</td><td>Glassman High Voltage</td><td>Series FC</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Hucoa-Herl&amp;ouml;s</td><td>3111</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Laminar flow&amp;nbsp; hood</td><td>Telstar</td><td>AV30/70</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Human Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMI 6000</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7409</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>Reagent</td></tr></tbody></table>

sandwich-like microenvironments to harness cell/material interactions

Colture cellulari è stata tradizionalmente effettuata su substrati bi-dimensionali (2D) in cui le cellule aderiscono con recettori ventrali alla superficie biomateriale. Tuttavia in vivo, la maggior parte delle cellule sono completamente circondati dalla matrice extracellulare (ECM), risultando in un tridimensionale (3D) distribuzione dei recettori. Questo può innescare differenze nella outside-in vie di segnalazione e quindi nel comportamento delle cellule. Questo articolo dimostra che la stimolazione dei recettori dorsali di cellule già aderito ad un substrato 2D sovrapponendo una pellicola di un nuovo materiale (una coltura a sandwich) innesca modifiche importanti rispetto a culture 2D standard. Inoltre, l&#39;eccitazione contemporanea dei recettori ventrale e dorsale sposta comportamento delle cellule più vicina a quella che si trova in ambienti 3D. Inoltre, a causa della natura del sistema, una cultura sandwich è uno strumento versatile che permette lo studio di diversi parametri di cella / materiale interactions, ad esempio, la topografia, la rigidità e diversi rivestimenti di proteine ​​su entrambi i lati ventrale e dorsale. Infine, dal momento che le culture sandwich si basano su substrati 2D, diverse procedure di analisi già sviluppati per le culture 2D standard, può essere utilizzato normalmente, superando le procedure più complesse necessarie per i sistemi 3D.

La stimolazione dei recettori dorsali all&#39;interno della cultura sandwich innesca cambiamenti nella morfologia cellulare, adesione cellulare e vie di segnalazione intracellulare (ad es chinasi di adesione focale, FAK) 10-12. Come esempio, colture di fibroblasti nel sistema sandwich overexpressed la α 5 integrina subunità rispetto al 2D, come osservato per altre culture 3D 15,16. Destino cellulare è strettamente dipendente dal tempo in cui i rec...

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Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Microambienti sandwich di sfruttare Cellulari / Materiale Interazioni

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

sandwich-like-microenvironments-to-harness-cellmaterial-interactions

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K Views.  Universitat Politècnica de València. The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

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Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Piattaforme microfabbricazione per coltura cellulare meccanicamente dinamica

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Ricerca

Bioingegneria

Silicon Microchips for Manipulating Cell-cell Interaction

The role of the cellular microenvironment is recognized as crucial in determining cell fate and function in virtually all mammalian tissues from development to malignant transformation.&nbsp; In particular, interaction with neighboring stroma has been implicated in a plethora of biological phenomena; however, conventional techniques limit the ability to interrogate the spatial and dynamic elements of such interactions.
In Micromechanical Reconfigurable Culture (RC), we employ a micromachined silicon substrate with moving parts to dynamically control cell-cell interactions through mechanical repositioning. Previously, this method has been applied to investigate intercellular communication in co-cultures of hepatocytes and non-parenchymal cells, demonstrating time-dependent interactions and a limited range for soluble signaling 1.
Here, we describe in detail the preparation and use of the RC system. We begin by demonstrating the handling of the device parts using tweezers, including actuating between the gap and contact configurations (cell populations separated by a narrow 80-&micro;m gap, or in direct intimate contact). Next, we detail the process of preparing the substrates for culture, and the multi-step cell seeding process required for obtaining confluent cell monolayers. Using live microscopy, we then illustrate real-time manipulation of cells between the different possible experimental configurations. Finally, we demonstrate the steps required in order to regenerate the device surface for reuse: toluene and piranha cleaning, polystyrene coating, and oxygen plasma treatment.

This article describes an experimental approach for dynamic regulation of cell-cell interactions between adherent cells on a micrometer scale. Manipulation of intercellular communication between hepatocytes and stromal cell is demonstrated. The developed platform enables investigation of cell-cell interactions in a variety of biological processes, including development and pathogenesis.

I microchip di silicio per la manipolazione di interazione cellula-cellula

The role of the cellular microenvironment is recognized as crucial in determining cell fate and function in virtually all mammalian tissues from ...

Biologia

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

Microfabbricazione di chip di dimensioni Ponteggi per tridimensionale coltura cellulare

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other physical or chemical stimuli. They have been commonly used for in vitro cell studies by providing in vivo like surroundings. Especially, how cells response to chemical gradients, electrical fields, and shear stresses has drawn many interests since these phenomena are important in understanding cellular properties and functions. These microfluidic chips can be made of glass substrates, silicon wafers, polydimethylsiloxane (PDMS) polymers, polymethylmethacrylate (PMMA) substrates, or polyethyleneterephthalate (PET) substrates. Out of these materials, PMMA substrates are cheap and can be easily processed using laser ablation and writing. Although a few microfluidic devices have been designed and fabricated for generating multiple, coexisting chemical and electrical stimuli, none of them was considered efficient enough in reducing experimental repeats, particular for screening purposes. In this report, we describe our design and fabrication of two PMMA-based microfluidic chips for investigating cellular responses, in the production of reactive oxygen species and the migration, under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli. The first chip generates five relative concentrations of 0, 1/8, 1/2, 7/8, and 1 in the culture regions, together with a shear stress gradient produced inside each of these areas. The second chip generates the same relative concentrations, but with five different electric field strengths created within each culture area. These devices not only provide cells with a precise, controllable micro-environment but also greatly increase the experimental throughput.

Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

Progettazione di dispositivi microfluidici per lo studio Risposte cellulare in singolo o Coesistenza chimico / elettrico / Shear stress stimoli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

Patterning of Microorganisms and Microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, including studies of microbial physiology and interactions. At the simplest level, accurate spatial patterning of microorganisms would enable reliable, long-term imaging of large numbers of individual cells and transform the ability to quantitatively study distance-dependent microbe-microbe interactions. More uniquely, coupling accurate spatial patterning and full control over environmental conditions, as offered by microfluidic technology, would provide a powerful and versatile platform for single-cell studies in microbial ecology. 
This paper presents a microfluidic platform to produce versatile and user-defined patterns of microorganisms within a microfluidic channel, allowing complete optical access for long-term, high-throughput monitoring. This new microfluidic technology is based on capillarity-assisted particle assembly and exploits the capillary forces arising from the controlled motion of an evaporating suspension inside a microfluidic channel to deposit individual microsized objects in an array of traps microfabricated onto a polydimethylsiloxane (PDMS) substrate. Sequential depositions generate the desired spatial layout of single or multiple types of micro-sized objects, dictated solely by the geometry of the traps and the filling sequence. 
The platform has been calibrated using colloidal particles of different dimensions and materials: it has proven to be a powerful tool to generate diverse colloidal patterns and perform surface functionalization of trapped particles. Furthermore, the platform was tested on microbial cells, using Escherichia coli cells as a model bacterium. Thousands of individual cells were patterned on the surface, and their growth was monitored over time. In this platform, the coupling of single-cell deposition and microfluidic technology allows both geometric patterning of microorganisms and precise control of environmental conditions. It thus opens a window into the physiology of single microbes and the ecology of microbe-microbe interactions, as shown by preliminary experiments.

We present a technology that uses capillarity-assisted assembly in a microfluidic platform to pattern micro-sized objects suspended in a liquid, such as bacteria and colloids, into prescribed arrays on a polydimethylsiloxane substrate.

Modellazione di microrganismi e microparticelle attraverso l'assemblaggio sequenziale assistito da capillarità

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, ...

Ingegneria

A Microfluidics Approach for the Functional Investigation of Signaling Oscillations Governing Somitogenesis

Periodic segmentation of the presomitic mesoderm of a developing mouse embryo is controlled by a network of signaling pathways. Signaling oscillations and gradients are thought to control the timing and spacing of segment formation, respectively. While the involved signaling pathways have been studied extensively over the last decades, direct evidence for the function of signaling oscillations in controlling somitogenesis has been lacking. To enable the functional investigation of signaling dynamics, microfluidics is a previously established tool for the subtle modulation of these dynamics. With this microfluidics-based entrainment approach endogenous signaling oscillations are synchronized by pulses of pathway modulators. This enables modulation of, for instance, the oscillation period or the phase-relationship between two oscillating pathways. Furthermore, spatial gradients of pathway modulators can be established along the tissue to study how specific changes in the signaling gradients affect somitogenesis.
The present protocol is meant to help establish microfluidic approaches for the first-time users of microfluidics. The basic principles and equipment needed to set up a microfluidic system are described, and a chip design is provided, with which a mold for chip generation can conveniently be prepared using a 3D printer. Finally, how to culture primary mouse tissue on a microfluidic chip and how to entrain signaling oscillations to external pulses of pathway modulators are discussed.
This microfluidic system can also be adapted to harbor other in vivo and in vitro model systems such as gastruloids and organoids for functional investigation of signaling dynamics and morphogen gradients in other contexts.

A protocol for the culture and manipulation of mouse embryonic tissue on a microfluidic chip is provided. By applying pulses of pathway modulators, this system can be used to externally control signaling oscillations for the functional investigation of mouse somitogenesis.

Un approccio microfluidico per l'indagine funzionale delle oscillazioni di segnalazione che governano la somitogenesi

Periodic segmentation of the presomitic mesoderm of a developing mouse embryo is controlled by a network of signaling pathways. Signaling oscillations and ...

Biologia dello sviluppo

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Fabbricazione di una matrice di multiplex artificiale microambiente cellulare

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

Analisi 3D delle risposte multi-cellulari ai gradienti chemoattractant

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Generazione di condizioni ambientali dinamiche utilizzando un dispositivo microfluidico ad alta produttività

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

Realizzazione e utilizzo di microarrays microambiente (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...