The support from ERC through HealInSynergy (306990) and the FPU program AP2009-3626 are acknowledged.

1. ייצור מצעים הגבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקת סרט שטוח של PLLA ידי יציקת ממס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבוד במנדף להכין פתרון של 2% (w / v) PLLA בכלורופורם (2 PLLA גרם ל -100 מיליליטר כלורופורם) על ידי ערבוב בטמפרטורת חדר (RT) עד שהיא נמסה לחלוטין (3 שעות בערך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מנקי בצלחת פטרי מזכוכית. הערה: מכונות כביסה הנירוסטה שימוש עם קוטר פנימי של 10.5 מ&quot;מ (מעט קטן יותר מאשר קוטר מדגם הגחון), כך שמכונת הכביסה מוצבת על גבי מצע הגחון. יכולים לשמש חומרים אחרים כגון polytetrafluoroethylene (PTFE) או מכונות כביסה זכוכית גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של פתרון PLLA במכונת הכביסה ולתת להתאדות לאט למשך 30 דקות ב RT. על מנת לאפשר אידוי איטי של הממס, לסגור את צלחת פטרי עם רדיד אלומיניום עם כמה חורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את הדגימות ב 120 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להתאדות עקבות ממס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו דוגמאות מגניב לעשותwn ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהדגימות התקררו (30 דקות בערך), לכסות עם 18.2 MΩ · מים סנטימטר בצלחת פטרי והדגירה של 8 דקות ב RT. הערה: אם הדגימות לא התקררו לחלוטין, ייתכן שהם תופסים 18.2 MΩ · מים סנטימטר ולאמץ מדינת גומי. בנוסף, דוגרים ב18.2 MΩ · מים סנטימטרים פחות מ -8 דקות עלול לגרום לניתוק לא תקין, ובמשך יותר מ -8 דקות בניתוק ממכונת הכביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם סכין גילוח, לחטט מנקי לקלף אותם מצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל פגמים מהקצה של מכונת הכביסה עם פינצטה ולתת דגימות האוויר יבשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הדגימות בייבוש ואקום (80 mbar) עד ליום של הניסוי כי PLLA הוא מתכלה על ידי הידרוליזה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצור של סיבי PLLA ידי electrospinning. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבוד במנדף להכין פתרון של 8% (w / v) PLLA בhexafluoroisopropanol (PLLA 8 גרם ב 100 מיליליטר hexafluoroisopropanol) על ידי stirring ב RT עד נמס לגמרי (3 שעות בערך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את polytetrafluoroethylene (PTFE) מכונות כביסה בגיליון אלומיניום או בתוף לelectrospinning על מנת לקבל סיבים אקראיים או מיושר בהתאמה. הערה: השתמש polytetrafluoroethylene (PTFE) מכונות כביסה עם קוטר פנימי של 10.5 מ&quot;מ (מעט קטן יותר מאשר קוטר מדגם הגחון), כך שמכונת הכביסה מוצבת על גבי מצע הגחון. יכולים לשמש חומרים אחרים כגון מכונות כביסה פלדת אל-חלד או זכוכית, כמו גם. התוף צריך לסובב במהירות הזוויתית של 160.7 שניות -1 (רדיוס = 7 סנטימטרים) על מנת לקבל סיבים מיושרים. מהירות איטית יותר עשויה שלא לגרום ליישור סיבים ומהירות גבוה יותר תגרום לסיבים השבורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המזרק עם פתרון הפולימר ולמקם אותו על משאבת המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electrospin פתרון PLLA באמצעות קצב זרימה 0.9 מיליליטר / שעה עם מתח של 30 וולט ומרחק אספן של 12 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את התהליך האחורי electrospinningאה 20-30 דקות, פעם בצפיפות סיבים טובה מושגת (מאז תאים צריכים אינטראקציה עם כמה סיבים בו זמנית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את הדגימות ב 120 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להתאדות עקבות ממס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הדגימות בייבוש ואקום (80 mbar) עד ליום של הניסוי כי PLLA הוא מתכלה על ידי הידרוליזה. </li></ol></li></ol> תרבות 2. סנדוויץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את התרבות כמו כריך פעם תאים דבקו במצע 2D הגחון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבודה במנדף תרבות על מנת להבטיח תנאים סטריליים ולעקר את כל החומרים (coverslips זכוכית, מצעי גב, פינצטה, וכו &#39;) על ידי חשיפה לקרינת UV למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל מצע הגחון ועל גב עם פיברונקטין כדי לכוון הידבקות תא חלבון ספציפית. כדי לעשות זאת, דגירה הדגימות ב -20 / מיליליטר מיקרוגרם של פיברונקטין מומס בפוספט שנאגר מלוח של Dulbecco (DPBS) המכיל Ca 2 + וMg 2 + (200 μl / sשפע) במשך שעה 1. הערה: בשל תהליך הייצור, יש לי מצעי גב צדדים העליונים ותחתונים מיועדים כי סיבי סרט וelectrospun ממס יציקה מצורפים לאחד הצדדים של מכונת הכביסה. הצד הזה הוא אפוא אחד מול התאים (איור 3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ציפוי החלבון, לשטוף את הדגימות פעמיים עם DPBS כדי להסיר חלבון בעודף. אז דגירה דגימות בDPBS עד לשימוש שלהם על מנת למנוע דגימות ממקבלים יבש מאז זה גורם שלילת אזרחות חלבון. DPBS שימוש המכיל Ca 2 + וMg 2 + מאז קטיונים דו ערכיים להסדיר קיפול חלבונים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע על הזכוכית coverslips 13. הערה: כתרבות כמו כריך מבוססת על מצעי 2D, זריעת תאים תבוצע באופן דומה כמו על מדגם 2D. לדוגמא, והיצמדות למנגנון C2C12 הם זורעים ב17,500 תאי סנטימטר -1 לניסויי בידול ופיברובלסטים NIH3T3 הם זורעים ב7,000 גסנטימטר אמות -1 לתרבויות מבודדות ללמוד מורפולוגיה תא והדבקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הדגימות בחממה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 ולאפשר לתאים לדבוק במצע הגחון במשך 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מצע זרע הגחון בבאר חדשה של צלחת 12 רב-היטב (שבו מנקי יתאימו). הערה: הרכבת התרבות כמו כריך בבאר חדשה היא אחת דרכים להיפטר מהתאים שדבקו בתחתית הבאר לאחר הזריעה שכן אלה יצרכו חומרים מזינים ומפרישים גורמי גדילה ופסולת המשפיעים על תאים בתרבית בתוך מערכת כמו כריך. זוהי גם חובה לעקירות סלולריות כדי lyse רק התאים בתרבית בתוך הסביבה כמו הכריך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות ובעזרת פינצטה, כיסוי המצע הגבי בתאים. למלא עם מדיום (1 מיליליטר) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. הערה: המשקל של מכונת הכביסה ימנע תת הגבstrate מצפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות בינוני פעמיים בשבוע כמו בתרבויות 2D סטנדרטיים. אל תזיז את מצע הגב מאז זה עלול לגרום לניזק לתאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את התרבות כמו כריך רק לאחר זריעת תאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבודה במנדף תרבות על מנת להבטיח תנאים סטריליים ולעקר את כל החומרים (coverslips זכוכית, מצעי גב, פינצטה, וכו &#39;) על ידי חשיפה לקרינת UV למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל מצע הגחון ועל גב עם פיברונקטין כדי לכוון הידבקות תא חלבון ספציפית. כדי לעשות זאת, דגירה הדגימות ב -20 מיקרוגרם / מיליליטר של פיברונקטין מומס בDPBS מכיל Ca 2 + וMg 2 + (200 μl / מדגם) במשך שעה 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ציפוי החלבון, לשטוף את הדגימות פעמיים עם DPBS כדי להסיר חלבון בעודף. אז דגירה דגימות בDPBS עד לשימוש שלהם על מנת למנוע דגימות ממקבלים יבש מאז זה גורם שלילת אזרחות חלבון. DPBS שימוש המכיל Ca 2 + Mg ו <sעד&gt; 2 + מאז קטיונים דו ערכיים להסדיר קיפול חלבונים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע על coverslips זכוכית בבאר של צלחת 12 רב-היטב (שבו מנקי יתאימו). כדי לעשות זאת, השתמש השעיה סלולרית מרוכזת מאוד כדי להימנע מאובדן תא לאחר הנחת המצע הגבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות ובעזרת פינצטה, כיסוי המצע הגבי בתאים. למלא עם מדיום (1 מיליליטר) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. הערה: המשקל של מכונת הכביסה ימנע מצע הגבי מצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות בינוני פעמיים בשבוע כמו בתרבויות 2D סטנדרטיים. הערה: אל תזיז את מצע הגב מאז זה עלול לגרום לניזק לתאים. </li></ol></li></ol> 3. ניתוח הערה: תרבויות כמו כריך מבוססות על מצעי 2D, ולכן יכול להיות מנותחת בדרך כלל על ידי נהלים כבר פיתחו לתרבויות 2D סטנדרטיים. לדוגמא, מאז PLLA הוא שקוף וcelLS מוגבל לנוע בתוך המטוס XY, מיקרוסקופיה נעשה כעל מצעי 2D. נדידת תאים ניתן לנתח לכן כלתרבויות 2D, ללא הצורך במעקב אחר תאים בציר z כלתרבויות 3D, אשר מפשטת את ניתוח ניסוי ותמונה. כדי לחקור את assay ריפוי הפצע על ידי assay שריטה מעקב פרוטוקול זה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגירת מחקר תאים (assay ריפוי פצע) בתוך התרבות כמו כריך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבודה במנדף תרבות על מנת להבטיח תנאים סטריליים ולעקר את כל החומרים (coverslips זכוכית, מצעי גב, פינצטה, וכו &#39;) על ידי חשיפה לקרינת UV למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל מצע הגחון ועל גב עם פיברונקטין כדי לכוון הידבקות תא חלבון ספציפית. כדי לעשות זאת, דגירה הדגימות ב -20 מיקרוגרם / מיליליטר של פיברונקטין מומס בפוספט שנאגר מלוח של Dulbecco (DPBS) המכיל Ca 2 + וMg 2 + עבור שעה 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ציפוי החלבון, לשטוף את הדגימות פעמיים עם DPBSכדי להסיר חלבון בעודף. אז דגירה דגימות בDPBS עד לשימוש שלהם על מנת למנוע דגימות ממקבלים יבש מאז זה יכול לגרום לשלילת אזרחות חלבון. DPBS שימוש המכיל Ca 2 + וMg 2 + מאז קטיונים דו ערכיים להסדיר קיפול חלבונים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע על coverslips הזכוכית בצפיפות גבוהה 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הדגימות בחממה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 ולאפשר לתאים כדי להשיג נקודת המפגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש קצה פיפטה לגרד את monolayer התא על מנת לקבל 2 אוכלוסיות תאים מופרדות בפער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מצע זרע הגחון בחדש גם מתאים לרכישת הזמן לשגות ובי מצעי גב יתאימו (כלומר 12 צלחת רב גם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות ובעזרת פינצטה, כיסוי המצע הגבי על התאים ולאחר מכן למלא עם מדיום (1 ​​מיליליטר לצלחת 12 רב גם). הערה: המשקל של מכונת הכביסה ימנע tהוא מגבה מצע מצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המדגם במיקרוסקופ הזמן לשגות (מוגדר 37 ° C ו 5% CO 2) ולקחת תמונות של סגירת הפער בכל 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את סגירת הפער באמצעות תוכנה ספציפית כגון MiToBo התוסף מImageJ. 14 </li></ol></li></ol> הערה: חלבון וחומצות גרעין חילוץ מתבצע באופן דומה כמו על מצעי 2D. יש רק צעד אחד נוסף שמורכב בפירוק התרבות כמו הכריך להוסיף למאגר תמוגה ישירות על התאים כדי להגביר את יעילות המיצוי. לדוגמא, להפקת mRNA: <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ mRNA מתרבויות כמו כריך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כל המאגרים מהערכה המסחרית בהתאם להוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את התרבות כמו כריך החוצה מהחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את התקשורת והתרבות מהדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הדגימות פעם עם DPBS מכיל Ca2 + וMg 2 + (1 מיליליטר) ולהסיר את כל הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פינצטה, להסיר את מצע הגב ולהוסיף למאגר תמוגה (350 μl) למצע הגחון. כיסוי שוב מצע הגב על מצע הגחון כדי lyse גם התאים דבקו במצע הגבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מצע גב לבודד את פתרון תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר ההוראות של היצרן כדי לקבל את ה- mRNA. </li></ol></li></ol> הערה: immunodetection של חלבונים יכול להיות גם הופיע כעל מצעי 2D. מאז תרבויות כמו כריך יכולות לעכב את דיפוזיה הנכונה של הנוגדנים ומאגרים, יש להגדיל פעמים דגירה. כמו כן, הכריך יכול להיות מפורק לפני תחילת הפרוטוקול מכתים אבל במקרה אחרון זה כמה תאים יישארו צמוד למצע הגב וחלק למצע הגחון. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבוני Immunodetect בתוך תרבות כמו כריך <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המדגם פעם אחת עם DPBS ולתקן עם פורמלין 4% PBS במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: מצע הגבי ניתן להסיר בתהליך הקיבוע, כך שבעיות דיפוזיה נמנעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם DPBS (1 מיליליטר) ולאחר מכן permeabilize עם 0.5% Triton X-100 בDPBS (1 מיליליטר) במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום אתרי קישור הלא ספציפי עם אלבומין 1% בDPBS (1 מיליליטר) במשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדן ראשוני (2 מיקרוגרם / מיליליטר; 1 מיליליטר) בחסימת פתרון לשעה 3 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים במשך 10 דקות עם DPBS / Tween% 0.5 (20 מיליליטר 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 2 שעות עם נוגדנים משני (2 מיקרוגרם / מיליליטר) ו1 מיקרוגרם / מיליליטר DAPI בפתרון חסימה (1 מיליליטר) ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים במשך 10 דקות בDPBS / Tween% 0.5 (20 מיליליטר 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בDPBS. הערה: ניתן להרכיב דוגמאות בשקופית עם Vectashield ואטום עם לק כאשר מצעי גב יוסרו לפני immunodetection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב תחת מייקר הקרינההיקף כלמצעי 2D סטנדרטיים. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+third+dimension:+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues.">Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 13), 3015-3024 (2012).</li><li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rev. Mod. Phys. 31 (1), 11-20 (1959).</li><li>Ruffner, H., Lichtenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+systems--towards+primary+drug+discovery+platforms:+an+interview+with+Heinz+Ruffner+(Novartis)+and+Jan+Lichtenberg+(InSphero).">3D cell culture systems--towards primary drug discovery platforms: an interview with Heinz Ruffner (Novartis) and Jan Lichtenberg (InSphero).</a> Biotechnol J. 7 (7), 833-834 (2012).</li><li>Horning, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+tumor+model+for+in+vitro+evaluation+of+anticancer+drugs.">3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs.</a> Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensation+mechanism+in+tumor+cell+migration:+mesenchymal-amoeboid+transition+after+blocking+of+pericellular+proteolysis.">Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis.</a> J Cell Biol. 160 (2), 267-277 (2003).</li><li>Schor, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+'sandwich'+assay+for+quantifying+chemo-regulated+cell+migration+within+3-dimensional+matrices:+wound+healing+cytokines+exhibit+distinct+motogenic+activities+compared+to+the+transmembrane+assay.">A novel 'sandwich' assay for quantifying chemo-regulated cell migration within 3-dimensional matrices: wound healing cytokines exhibit distinct motogenic activities compared to the transmembrane assay.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 63 (5), 287-300 (2006).</li><li>Lee, E. J., Hwang, C. M., Baek, D. H., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+system+for+the+assessment+of+cell+migration+on+3D+micropatterned+substrates.">Fabrication of microfluidic system for the assessment of cell migration on 3D micropatterned substrates.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009 (2009), 6034-6037 (2009).</li><li>Zaman, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+tumor+cells+in+3D+matrices+is+governed+by+matrix+stiffness+along+with+cell-matrix+adhesion+and+proteolysis.">Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 10889-10894 (2006).</li><li>Ballester-Beltr&#225;n, J., Lebourg, M., Salmer&#243;n-S&#225;nchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+and+ventral+stimuli+in+sandwich-like+microenvironments.+Effect+on+cell+differentiation.">Dorsal and ventral stimuli in sandwich-like microenvironments. Effect on cell differentiation.</a> Biotechnol Bioeng. 110 (11), 3048-3058 (2013).</li><li>Ballester-Beltr&#225;n, J., Lebourg, M., Moratal, D., Salmer&#243;n-S&#225;nchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin-matrix+sandwich-like+microenvironments+to+manipulate+cell+fate.">Fibronectin-matrix sandwich-like microenvironments to manipulate cell fate.</a> Biomater. Sci. 2 (3), 381-389 (2014).</li><li>Ballester-Beltr&#225;n, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmer&#243;n-S&#225;nchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+and+ventral+stimuli+in+cell-material+interactions:+effect+on+cell+morphology.">Dorsal and ventral stimuli in cell-material interactions: effect on cell morphology.</a> Biointerphases. 7 (1-4), 39 (2012).</li><li>Ballester-Beltr&#225;n, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmer&#243;n-S&#225;nchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+within+confined+sandwich-like+nanoenvironments.">Cell migration within confined sandwich-like nanoenvironments.</a> Nanomedicine. , (2015).</li><li>Gla&#223;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration+Analysis:+Segmenting+Scratch+Assay+Images+with+Level+Sets+and+Support+Vector+Machines.">Cell Migration Analysis: Segmenting Scratch Assay Images with Level Sets and Support Vector Machines.</a> Pattern Recogn. 45 (9), 3154-3165 (2012).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li><li>Huebsch, N., Arany, P. R., Mao, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+traction-mediated+manipulation+of+the+cell/matrix+interface+to+control+stem-cell+fate.">Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate.</a> Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).</li><li>Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonpolarized+signaling+reveals+two+distinct+modes+of+3D+cell+migration.">Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration.</a> J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).</li><li>Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulatory+effects+of+a+three-dimensional+microenvironment+on+cell-mediated+fibronectin+fibrillogenesis.">Stimulatory effects of a three-dimensional microenvironment on cell-mediated fibronectin fibrillogenesis.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 19), 4427-4436 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כיום, תרבות 3D הוא נושא חשוב לתעשיית התרופות ביוטכנולוגיות וכמו גם מחקר בביולוגיה של תא, כוללים סרטן ותאי גזע. כתוצאה מכך כמה מערכות תרבות 3D פותחו. למרבה הצער, הבדלים בין מערכות 3D בדרך כלל התוצאה של התנהגות תא שונה, מעכבת את ההבנה של גורל תא. חוץ מזה, הפרוצדורות הן בדרך כ?...

באופן מסורתי, תרבית תאים בוצעה על מצעים דו-ממדיים (2D), שרוב microenvironments הסלולרי in vivo יש לי טבע תלת ממדי (3D). סביבת 2D לא טבעית זה גורמת לשינויים בהתנהגות תא כדרך של הסתגלות עצמית לעולם שטוח, המשפיעה ישירות על תא גורל 1,2. לפיכך, תוצאות שהתקבלו בתרביות תאי 2D לא תמיד לשחזור in vivo. זה עודד את הפיתוח של מערכות תרבות הרלוונטיות חדשות המבקשות לספק תנאים כמו-פיסיולוגיים יותר כדי לקבל תובנות נוספות כל 3,4 מנגנון ביולוגי ממד תלוי. אחד ההבדלים העיקריים בין תרבות 2D ו3D בסביבת vivo הוא ההפצה של קולטני תא מעוגן למטריצה ​​תאית (ECM): בעוד ב2D מצעי תאים לדבוק ventrally, רוב התאים בגוף חי מוקפות לחלוטין על ידי ECM ו כך לסה&quot;נהידבקות ll מתרחשת באמצעות הפצת 3D של הקולטנים. זה מעורר מסלולי איתות הידבקות תאים שונים ובכך ויסות תהליכים חשובים כגון צמיחת תאים, התמיינות תאים וביטוי גנים. במהלך העשורים האחרונים, מערכות תרבות 3D שונות הוקמו 5-8, אם כי שונות והמורכבות שלהם לעכב סטנדרטיזציה שלהם בהליכי תרבות תא משותף. יתר על כן מערכות 3D הן בדרך כלל לא קלה לטפל ופרוצדורות הנוכחיות על מצעי 2D לא ניתן לקבוע בקלות לתרבויות 3D. בנוסף, רק לעתים נדירות ספרות משווה תרבויות 3D עם מצב 2D שווה הערך או מערכות אחרות 3D, פוגע ההבנה הנכונה של התנהגות תא במודלים אלה. ברגע שיש את התאים דבקים על מצע 2D, העירור של קולטני גב - על ידי שכיסה סרט של חומר חדש (תרבות כמו כריך) - יכול לעורר תגובות תא אחד סביבות 3D. המחשבהבן מאחורי זה הוא ההפעלה בו זמנית של שני גב וגחון קולטנים לדבוק והתפשט בתוך סביבת הכריך (איור 1) 9,10. כתוצאה מכך, תאים עוברים שינויים חשובים ביחס לתרבויות 2D 11,12. כך, גורל תא נקבע במהלך עצרת בגלל תרבות הכריך, מאז גירוי הגב מפעיל שינויים במסלולים סלולריים מפתח. לכן, גורל התא נקבע מאוד על ידי הזמן שבו התרבות כמו הכריך מורכבת 11. בשל אופייה של המערכת, תרבות כמו כריך היא כלי פשוט ורב-תכליתי שמאפשר הלימוד של פרמטרים שונים באינטראקציות תא / חומר כגון ציפויי כימיה, טופוגרפיה, נוקשות וחלבון בשני הצדדים הגחון ועל גב. זו מציעה רמה גבוהה יותר של גמישות בהשוואה למערכות אחרות 3D (איור 2) בשל הגב העצמאי ושילוב הגחון של נ &#39;רחבariety של תנאי שטח. בנוסף, ניתן ללמוד שורות תאים שונות ובזמנים שונים כדי להרכיב את התרבות כמו כריך, הגדלת הספקטרום הרחב של אפשרויות. פרוטוקול סטנדרטי של התרבות כמו כריך מפורט להלן או באמצעות פולי-L-לקטית סיבי electrospun חומצה (PLLA) או סרטים כמו מצעי גב, coverslip זכוכית כמצע הגחון ופיברונקטין כציפוי חלבון. תרבויות כמו כריך נאספו רק לאחר זריעת תאים או אחרי 3 שעות של תרבות 2D. עם זאת, שימו לב שיכולים לשמש מערכות חומר אחרות וחלבונים; כמו כן התרבות כמו כריך ניתן להרכיב בנקודות זמן שונות.

<table><tbody><tr><td>Ploy(lactic acid)</td><td>NatureWorks</td><td>4042D</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Cover glasses (12 mm&amp;Oslash;)</td><td>Marienfeld</td><td>631-0666</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Scharlab</td><td>CL0200</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td><td>Sigma</td><td>105228</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Syringe (1 ml)</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010-200V0</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE1000</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>High Voltage DC Power Supply</td><td>Glassman High Voltage</td><td>Series FC</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Hucoa-Herl&amp;ouml;s</td><td>3111</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Laminar flow&amp;nbsp; hood</td><td>Telstar</td><td>AV30/70</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Human Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMI 6000</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7409</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>Reagent</td></tr></tbody></table>

sandwich-like microenvironments to harness cell/material interactions

תרבית תאים בוצעה באופן מסורתי על מצעים דו-ממדי (2D) שבו תאים לדבוק באמצעות קולטנים הגחון אל פני השטח בחומר ביולוגי. עם זאת in vivo, רוב התאים מוקפים לחלוטין על ידי מטריקס (ECM), וכתוצאה מכך הפצה תלת ממדי (3D) של קולטנים. זה עלול לעורר הבדלים במחוץ-במסלולי איתות וכך בהתנהגות תא. מאמר זה מראה שגירוי קולטני הגב של תאים כבר דבקו מצע 2D ידי כיסה סרט של חומר חדש (תרבות כמו כריך) מפעיל שינויים חשובים ביחס לתרבויות 2D סטנדרטיים. יתר על כן, העירור הזמני של קולטני הגחון ועל גב משמרות התנהגות תא קרוב יותר לזה שנמצא בסביבות 3D. בנוסף, בשל אופייה של המערכת, תרבות כמו כריך הוא כלי רב-תכליתי שמאפשר הלימוד של פרמטרים שונים בתא / inte חומרractions, למשל, טופוגרפיה, נוקשות וציפוי חלבון שונה בשני הצדדים הגחון ועל גב. לבסוף, מאז תרבויות כמו כריך מבוססות על מצעי 2D, מספר הליכי ניתוח כבר פיתחו לתרבויות 2D סטנדרטיים יכול לשמש בדרך כלל, להתגבר על הליכים מורכבים יותר הנדרשים למערכות 3D.

הגירוי של הקולטנים גב בתוך התרבות כמו הכריך מפעיל שינויים במורפולוגיה תא, הידבקות תא ומסלולי איתות תאיות (למשל קינאז מוקדי הדבקה, FAK) 10-12. כדוגמא, fibroblasts תרבית בתוך המערכת כמו כריך ביטוי יתר למקטע integrin α 5 לעומת 2D, כפי שנצפה לתרבויות אחרות 3D 15,16. <p...

Watch this Scientific Journal Video about Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions at JoVE.com

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

כמו כריך microenvironments לרתום ניידים / חומרי אינטראקציות

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

sandwich-like-microenvironments-to-harness-cellmaterial-interactions

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K Views.  Universitat Politècnica de València. The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Video: Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

פלטפורמות microfabricated לתרבות Cell דינמי מכאני

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Silicon Microchips for Manipulating Cell-cell Interaction

The role of the cellular microenvironment is recognized as crucial in determining cell fate and function in virtually all mammalian tissues from development to malignant transformation.&nbsp; In particular, interaction with neighboring stroma has been implicated in a plethora of biological phenomena; however, conventional techniques limit the ability to interrogate the spatial and dynamic elements of such interactions.
In Micromechanical Reconfigurable Culture (RC), we employ a micromachined silicon substrate with moving parts to dynamically control cell-cell interactions through mechanical repositioning. Previously, this method has been applied to investigate intercellular communication in co-cultures of hepatocytes and non-parenchymal cells, demonstrating time-dependent interactions and a limited range for soluble signaling 1.
Here, we describe in detail the preparation and use of the RC system. We begin by demonstrating the handling of the device parts using tweezers, including actuating between the gap and contact configurations (cell populations separated by a narrow 80-&micro;m gap, or in direct intimate contact). Next, we detail the process of preparing the substrates for culture, and the multi-step cell seeding process required for obtaining confluent cell monolayers. Using live microscopy, we then illustrate real-time manipulation of cells between the different possible experimental configurations. Finally, we demonstrate the steps required in order to regenerate the device surface for reuse: toluene and piranha cleaning, polystyrene coating, and oxygen plasma treatment.

This article describes an experimental approach for dynamic regulation of cell-cell interactions between adherent cells on a micrometer scale. Manipulation of intercellular communication between hepatocytes and stromal cell is demonstrated. The developed platform enables investigation of cell-cell interactions in a variety of biological processes, including development and pathogenesis.

הסיליקון מיקרוצ&#39;יפים עבור מניפולציה Cell-cell אינטראקציה

The role of the cellular microenvironment is recognized as crucial in determining cell fate and function in virtually all mammalian tissues from ...

Biology

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

Microfabrication של שבב בגודל פיגומים לעיבוד תלת ממדי נייד

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other physical or chemical stimuli. They have been commonly used for in vitro cell studies by providing in vivo like surroundings. Especially, how cells response to chemical gradients, electrical fields, and shear stresses has drawn many interests since these phenomena are important in understanding cellular properties and functions. These microfluidic chips can be made of glass substrates, silicon wafers, polydimethylsiloxane (PDMS) polymers, polymethylmethacrylate (PMMA) substrates, or polyethyleneterephthalate (PET) substrates. Out of these materials, PMMA substrates are cheap and can be easily processed using laser ablation and writing. Although a few microfluidic devices have been designed and fabricated for generating multiple, coexisting chemical and electrical stimuli, none of them was considered efficient enough in reducing experimental repeats, particular for screening purposes. In this report, we describe our design and fabrication of two PMMA-based microfluidic chips for investigating cellular responses, in the production of reactive oxygen species and the migration, under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli. The first chip generates five relative concentrations of 0, 1/8, 1/2, 7/8, and 1 in the culture regions, together with a shear stress gradient produced inside each of these areas. The second chip generates the same relative concentrations, but with five different electric field strengths created within each culture area. These devices not only provide cells with a precise, controllable micro-environment but also greatly increase the experimental throughput.

Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

עיצוב מכשירי microfluidic ללימוד ותגובות ניידות תחת בית או להתאבדות כימית / חשמל / שאר מתח גירויים

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

Patterning of Microorganisms and Microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, including studies of microbial physiology and interactions. At the simplest level, accurate spatial patterning of microorganisms would enable reliable, long-term imaging of large numbers of individual cells and transform the ability to quantitatively study distance-dependent microbe-microbe interactions. More uniquely, coupling accurate spatial patterning and full control over environmental conditions, as offered by microfluidic technology, would provide a powerful and versatile platform for single-cell studies in microbial ecology. 
This paper presents a microfluidic platform to produce versatile and user-defined patterns of microorganisms within a microfluidic channel, allowing complete optical access for long-term, high-throughput monitoring. This new microfluidic technology is based on capillarity-assisted particle assembly and exploits the capillary forces arising from the controlled motion of an evaporating suspension inside a microfluidic channel to deposit individual microsized objects in an array of traps microfabricated onto a polydimethylsiloxane (PDMS) substrate. Sequential depositions generate the desired spatial layout of single or multiple types of micro-sized objects, dictated solely by the geometry of the traps and the filling sequence. 
The platform has been calibrated using colloidal particles of different dimensions and materials: it has proven to be a powerful tool to generate diverse colloidal patterns and perform surface functionalization of trapped particles. Furthermore, the platform was tested on microbial cells, using Escherichia coli cells as a model bacterium. Thousands of individual cells were patterned on the surface, and their growth was monitored over time. In this platform, the coupling of single-cell deposition and microfluidic technology allows both geometric patterning of microorganisms and precise control of environmental conditions. It thus opens a window into the physiology of single microbes and the ecology of microbe-microbe interactions, as shown by preliminary experiments.

We present a technology that uses capillarity-assisted assembly in a microfluidic platform to pattern micro-sized objects suspended in a liquid, such as bacteria and colloids, into prescribed arrays on a polydimethylsiloxane substrate.

דפוס של מיקרואורגניזמים ומיקרו-חלקיקים באמצעות הרכבה בסיוע נימים רציפים

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, ...

Engineering

A Microfluidics Approach for the Functional Investigation of Signaling Oscillations Governing Somitogenesis

Periodic segmentation of the presomitic mesoderm of a developing mouse embryo is controlled by a network of signaling pathways. Signaling oscillations and gradients are thought to control the timing and spacing of segment formation, respectively. While the involved signaling pathways have been studied extensively over the last decades, direct evidence for the function of signaling oscillations in controlling somitogenesis has been lacking. To enable the functional investigation of signaling dynamics, microfluidics is a previously established tool for the subtle modulation of these dynamics. With this microfluidics-based entrainment approach endogenous signaling oscillations are synchronized by pulses of pathway modulators. This enables modulation of, for instance, the oscillation period or the phase-relationship between two oscillating pathways. Furthermore, spatial gradients of pathway modulators can be established along the tissue to study how specific changes in the signaling gradients affect somitogenesis.
The present protocol is meant to help establish microfluidic approaches for the first-time users of microfluidics. The basic principles and equipment needed to set up a microfluidic system are described, and a chip design is provided, with which a mold for chip generation can conveniently be prepared using a 3D printer. Finally, how to culture primary mouse tissue on a microfluidic chip and how to entrain signaling oscillations to external pulses of pathway modulators are discussed.
This microfluidic system can also be adapted to harbor other in vivo and in vitro model systems such as gastruloids and organoids for functional investigation of signaling dynamics and morphogen gradients in other contexts.

A protocol for the culture and manipulation of mouse embryonic tissue on a microfluidic chip is provided. By applying pulses of pathway modulators, this system can be used to externally control signaling oscillations for the functional investigation of mouse somitogenesis.

גישה מיקרופלואידיקה לחקירה פונקציונלית של איתות תנודות השולטות בסמיטוגנזה

Periodic segmentation of the presomitic mesoderm of a developing mouse embryo is controlled by a network of signaling pathways. Signaling oscillations and ...

Developmental Biology

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

ייצור של מערך מרובבת MicroEnvironment הסלולר מלאכותי

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

ניתוח תלת-מימד של תגובות מרובות-סלולר לקבוצת מעברי כימוסטנט

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

יצירת תנאי סביבה דינמיים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי בעל תפוקה גבוהה

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

ייצור ושימוש של microarrays Microenvironment (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...