本研究は、エピゲノムエディターを設計し、ヒト細胞に導入することを目的としています。これは、クロマチンエフェクターをdCas9に融合させることで、毒性のあるDNA切断を導入することなく標的遺伝子を調節することで実現します。課題は、エピゲノムエディターを効率的に細胞に導入し、正確な標的特異性を確保することを中心に展開しています。
さらに、安定的または一過性の遺伝子抑制を達成することは依然として困難です。このプロトコルは、切断メカニズムを回避し、毒性とゲノムの不安定性を軽減します。本稿では、DNA配列を恒久的に変化させることなく、制御された遺伝子発現調節のための2つの導入方法について説明しています。
これらの方法は、dCas9へのさまざまな融合の試験や基本的なクロマチン生物学の研究に適用できます。現在のエピゲノムエディターは、ゲノムワイドなスクリーニングに使用でき、治療への応用の可能性を秘めています。まず、K-562細胞をフラスコ内に保持し、10%FBSとペニシリンストレプトマイシングルタミンを添加したRPMI培地を添加します。
ヌクレオフェクションの日には、滅菌済みのRNAseフリーの微量遠心チューブでCRISPRoff mRNAを解凍し、チューブを穏やかにボルテックスします。氷上に置いたPCRストリップチューブの各ウェルの5細胞の累乗で、2.0×10あたり2マイクログラムのmRNAを使用します。製造元の指示に従ってヌクレオフェクション溶液を調製し、ヌクレオフェクションの前に15分間室温まで温めます。
トリパンブルーの生/死染色を施した自動セルカウンターを使用して、K-562細胞を回収し、カウントします。ストリップキュベットでのヌクレオフェクションの場合、サンプルあたり5細胞の累乗で約2倍10を滅菌マイクロ遠心チューブに分注します。細胞を500 Gで室温で5分間遠心分離します。
上清を捨てます。細胞ペレットに室温のPBSを加え、再度500 Gで5分間遠心分離します。上清を捨てます。
細胞を適切な量のヌクレオフェクター溶液に再懸濁します。計算した量の細胞溶液を2マイクログラムのCRISPRoff溶液に加えます。細胞とmRNA溶液をキュベットに移し、気泡が形成されないようにします。これにより、核形成効率が損なわれる可能性があります。
Nucleocuvetteを軽くたたいて、下部の細胞を沈着させます。次に、適切なパルスコードを持つ4D-Nucleofectorシステムを使用して細胞を核分離します。パルスコードは、細胞タイプごとに最適化する必要があるかもしれません。
追加の最適化が必要な場合は、製造元にご相談ください。ヌクレオフェクション後、Nucleocuvetteの各使用済みウェルに80マイクロリットルのRPMI培地を加えます。細胞懸濁液を、400マイクロリットルの予熱済みRPMI培地を含む24ウェルプレートのウェルに移します。
すべてのフローサイトメトリー標準ファイル(FSCファイル)をFlowJoにロードするには、新しいワークシートにドラッグアンドドロップします。すべてのサンプルをクリックして、ゲートの作成を開始します。対応するファイルをダブルクリックして、コントロールサンプルを開きます。
ポリゴンツールを使用して、FSC-A対SSC-Aプロットで生細胞のゲートを作成します。すべてのサンプルのリストで、サンプル名の下に[Live cells]タブが表示されます。このゲートを右クリックし、[解析をグループにコピー]を選択して、このゲートをすべてのサンプルに適用します。
生細胞のゲートをダブルクリックして、生細胞のみを選択します。軸をFSC-HとFSC-Aに変更します。1 つのセルのみをゲートするポリゴンを描画します。
ガイド発現細胞のゲートを作成するには、シングルセルゲートをダブルクリックしてシングルセルのみを選択します。軸をFSC-AとPE-CF594-Aに変更します。ポリゴンツールを使ってセルを表現するガイド用のゲートを描きます。
最後にセットアップしたゲート(単一細胞またはガイド発現細胞)をダブルクリックします。エピゲノムエディターが青色蛍光タンパク質をコードするプラスミドトランスフェクション、またはBFP融合を行う場合は、2日目のサンプルに対してBFP陽性細胞のゲートを作成します。BB515-AをFSC-Aに対してプロットし、GFPネガティブセルを同定してゲートすることにより、レポーター発現のゲートを作成します。
次に、このゲートをすべてのサンプルに適用します。ゲートの設定が完了したら、上部パネルのテーブルエディターをクリックします。BFP陽性細胞やGFP陰性細胞などの解析用集団をドラッグします。
テーブルエディターパネルで、「テーブルの作成」をクリックし、データをコピーしてから、正規化計算のためにスプレッドシートに貼り付けます。次に、コントロールサンプルのレポーターネガティブセル(GFPネガティブなど)の数を他のすべてのサンプルから減算します。これにより、レポーターのバックグラウンドの無音化が修正されます。
トランスフェクションを行う場合は、各値を2日目に測定したBFP陽性細胞の割合で割って、すべての値をBFP陽性細胞の割合に正規化し、100を掛けます。これにより、編集された細胞のトランスフェクション効率の正規化値が得られます。データをプロットして、エピゲノム編集の時間経過全体にわたる変化を表す折れ線グラフを作成します。
すべてのエピゲノム編集実験において、標的遺伝子座の変化がエピゲノムエディターの過剰発現や非特異的結合ではなく、エピゲノム編集によるものであることを確認するために、ノンターゲティングガイドコントロールが推奨されます。エピゲノムエディターの送達方法を考えることが大切です。プラスミドDNAトランスフェクションまたはmRNAヌクレオフェクションは、実験の状況を考慮すると好ましい場合があります。
細胞の種類、実験のタイムライン、送達の読み出し、および送達の有効性を考慮すると、好ましい送達方法に影響を与える可能性があります。トランスフェクションの2日後に高レベルのBFPを発現する細胞は、エピゲノムエディターによるトランスフェクションが成功したことを示しています。CRISPRoffとCRISPRiはどちらも、トランスフェクション後5日目に遺伝子のピークサイレンシングを示します。
mRNAヌクレオフェクション実験では、CRISPRoffによるヌクレオフェクション後3日目までに強力な遺伝子サイレンシングが観察されます。
