当社のプロトコルにより、ユーザーはフローサイトメトリーから生細胞分子イメージングに至るまでの多様なモダリティを使用して、幹細胞バイオマーカーであるALDH1A1活性を測定できます。このアプローチの主な利点は、プローブの活性化には、高いシグナル対バックグラウンド比を特徴とするターンアラウンド応答と、選択的なALDH1A1アイソフォーム検出が含まれることです。この手順を実演するのは、私の研究室のマイケル・リー、サラ・ガードナー、ロドリゴ・タピア・ヘルナンデスの大学院生です。
はじめに、目的の培養細胞から増殖培地を8ウェルチャンバースライドに吸引する。2マイクロモルアイソフォーム選択蛍光発生プローブまたは非反応性コントロールプローブを添加した無血清培地をウェルあたり500マイクロリットル加えます。スライドを室温で30分間インキュベートします。
インキュベーション後、すぐに共焦点顕微鏡イメージングに進みます。10倍の倍率でセルを見つけます。この実験には、FITCチャネルと透過光チャネルが必要です。
透過光チャンネルを使用してセルを見つけて焦点を合わせ、実験全体にわたって同じZ平面に焦点を合わせ、バイアスを除去します。レーザー出力とFITCゲインを、コントロールAlDeSense AMサンプルからの信号が最小限に抑えられる適切な設定に調整し、AlDeSense AMサンプルの信号は引き続き表示されます。対応するバーをスライドさせて、各パラメータを調整します。
正しいパラメータを識別するために、設定を数回調整する必要がある場合があります。最適化が完了したら、同じパラメーターを使用して、その細胞株内で残りの実験を完了します。1ウェルにつき3枚、処理条件ごとに合計3ウェルの画像をスナップし、画像を保存します。
バイアスを避けるために、平面とウェルを切り替える間のみ、透過光チャネルを使用して焦点を合わせるようにしてください。次に、画像処理ソフトウェアを使用して、CZIファイルを異なるチャンネルに分割し、細胞と蛍光細胞の総数をカウントします。アルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1陽性細胞の割合を決定するために、蛍光細胞の数を各画像中の細胞の総数で割る。
交絡変数を避けるために、各画像に対して同じ方法でカウントします。インキュベーター内に維持された細胞を含むT25細胞培養フラスコを取り出す。細胞剥離のためにトリプシンを加え、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。
次に、15ミリリットルの遠沈管に細胞をペレット化し、摂氏25度で5分間180Gで遠心分離します。細胞を1ミリリットルの2マイクロモルプローブまたはコントロールプローブ溶液にPBSで再懸濁します。細胞を室温で60分間揺り動かして、色素に均一にさらされるようにします。
インキュベーション期間の後、摂氏25度で5分間180Gで遠心分離することにより細胞をペレット化する。次に、細胞を0.5ミリリットルのPBSに再懸濁します。35マイクロメートルのナイロンメッシュセルストレーナーを通して、氷の上に置かれたチューブに細胞を走らせ、フローサイトメーターを詰まらせる可能性のある細胞塊を取り除きます。
フローサイトメーター機器の電源を入れ、起動プロトコルを実行します。シース液と空のウエストを確認してください。10%の漂白剤と水でそれぞれ5分間ラインを実行します。
次に、品質管理ビーズを実行して、適切な機能を確認します。設定タブで、蛍光フィルターの前方散乱側方散乱とFITCを選択します。グラフの中心付近のメインセル集団の前方散乱領域と側方散乱領域プロットを描画します。
次に、シングレットを示す狭い水平バンドの前方散布幅プロットではなく、前方散乱領域を描画します。次に、FITC領域と前方散乱領域プロットを描画して、アイソフォーム選択的蛍光発生ターンオンプローブでソートされた細胞の分布を観察します。次に、FITC面積ヒストグラムを描画して、FITCに基づく集団の変化を観察し、アルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1陽性細胞の割合を決定します。
FITCレーザー出力を最適化するには、ヒストグラム曲線の右裾が最大FITCエリア信号に近づくようにプローブでサンプルを実行します。レーザー出力の最適化ステップを複数回繰り返す必要がある場合がありますが、実験の設定が指定されたら、サンプル間でレーザー出力を変更しないでください。続いて、サンプルをふるいに追加し、コントロールプローブで実行します。
最大ダイナミックレンジを明らかにするために、ポピュレーションシフトを観察できる必要があります。各サンプルを3連で行われた10, 000カウントに対して実行します。サンプル収集が完了したら、10%漂白剤と水でラインをそれぞれ5分間実行し、機器をシャットダウンします。
フローサイトメトリーソフトウェアを使用してデータを処理し、目的の細胞集団を歩きます。長方形のゲート選択を使用して、アルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1陰性歩行を設定し、コントロールプローブサンプルのイベントの99.5%以上がこのゲート内で発生するようにします。残りの細胞はアルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1陽性とみなされる。
同じゲートをプローブサンプルに適用します。アルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1陰性および1A1陽性と考えられる事象の数を定量した。各細胞株の平均倍率ターンオンを測定し、総アルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1活性を定量化した。
アルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1陽性細胞の割合は、レーザー出力およびゲインを同調することによって各細胞株において決定した。コントロールAlDeSense AM処理サンプル中のシグナルを最小化するために、蛍光シグナルをAlDeSense AM処理細胞において最適化した。アルデヒドデヒドロゲナーゼA1A陽性細胞の数をカウントすることにより、アルデヒドデヒドロゲナーゼA1A陽性細胞の割合を求めた。
アイソフォーム選択的蛍光発生プローブの適用により、アルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1陽性細胞集団を、対照AlDeSense AM処理集団内の最も明るい細胞の上位0.5%をゲーティングすることにより、各細胞株内で定量しました。卵巣癌細胞のパネルの分析により、アルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1陽性細胞の割合が明らかになりました。得られた癌細胞株の結果から、BG-1は最も低いアルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1活性を有し、最も低いアルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1陽性集団を有すると結論付けることができる。
さらに、共焦点イメージングとフローサイトメトリーにより、Caov-3細胞におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1陽性細胞の割合が最も大きいことが明らかになりました。しかし、細胞株の全体的な活性は3番目に高かった。あるいは、OVCAR-3細胞は、3番目に高いアルデヒドデヒドロゲナーゼ1A1陽性集団を含んでいたが、最も高い全体的な活性を示した。
AlDeSenseは、不死化細胞株および患者サンプル中のCSCを同定するための汎用性が高く一般化可能なプローブです。臨床現場での予後予測ツールとして期待しています。
