Notre protocole permet aux utilisateurs de mesurer l’activité d’ALDH1A1, un biomarqueur de cellules souches en utilisant diverses modalités allant de la cytométrie en flux à l’imagerie moléculaire de cellules vivantes. Les principaux avantages de cette approche sont que l’activation de la sonde implique la réponse de retournement caractérisée par un rapport signal / bruit de fond élevé, ainsi qu’une détection sélective des isoformes ALDH1A1. Michael Lee, Sarah Gardner et Rodrigo Tapia Hernandez feront la démonstration de cette procédure, des étudiants diplômés de mon laboratoire.
Pour commencer, aspirez le milieu de croissance des cellules cultivées d’intérêt dans huit lames de chambre de puits. Ajouter 500 microlitres par puits de milieu libre de sérum complété par une sonde fluorogénique sélective isoforme à deux micromolaires ou une sonde témoin non réactive. Incuber la lame à température ambiante pendant 30 minutes.
Après l’incubation, procéder immédiatement à l’imagerie au microscope confocal. Localisez les cellules à un grossissement de 10 x. Le canal FITC et les canaux lumineux transmis sont nécessaires pour cette expérience.
Localisez et focalisez les cellules à l’aide du canal lumineux transmis pour faire la mise au point sur le même plan Z pendant toute l’expérience afin d’éliminer les biais. Ajustez la puissance laser et le gain FITC au réglage approprié où le signal des échantillons AlDeSense AM de contrôle est détectable au minimum, tout en voyant le signal dans les échantillons AlDeSense AM. Ajustez chaque paramètre en faisant glisser la barre correspondante.
Les paramètres devront peut-être être ajustés plusieurs fois pour identifier les paramètres corrects. Une fois optimisé, complétez le reste de l’expérience au sein de cette lignée cellulaire en utilisant des paramètres identiques. Prenez trois images par puits pour un total de trois puits par condition de traitement et enregistrez les images.
Assurez-vous de faire la mise au point en utilisant le canal lumineux transmis uniquement lors de la commutation entre les plans et les puits pour éviter les biais. Ensuite, à l’aide du logiciel de traitement d’image, divisez le fichier CZI en différents canaux et comptez le nombre total de cellules et de cellules fluorescentes. Pour déterminer le pourcentage de cellules positives à l’aldéhyde déshydrogénase 1A1, divisez le nombre de cellules fluorescentes par le nombre total de cellules dans chaque image.
Comptez de la même manière pour chaque image afin d’éviter de confondre les variables. Sortir une fiole de culture cellulaire T25 contenant les cellules maintenues dans l’incubateur. Ajoutez de la trypsine pour le détachement cellulaire et comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.
Ensuite, pelletez les cellules dans un tube centrifuge de 15 millilitres par centrifugation à 180G pendant cinq minutes à 25 degrés Celsius. Re-suspendre les cellules dans un millilitre d’une sonde à deux micromolaires ou d’une solution de sonde témoin dans du PBS. Balancez les cellules à température ambiante pendant 60 minutes pour assurer une exposition uniforme au colorant.
Après la période d’incubation, granuler les cellules par centrifugation à 180 G pendant cinq minutes à 25 degrés Celsius. Ensuite, re-suspendez les cellules dans 0,5 millilitre de PBS. Faites passer les cellules à travers une crépine à mailles de nylon de 35 micromètres sur un tube placé sur de la glace pour éliminer les amas cellulaires qui peuvent obstruer le cytomètre en flux.
Allumez l’instrument de cytomètre en flux et exécutez le protocole de démarrage. Vérifiez s’il y a du liquide de gaine et une taille vide. Faites fonctionner les lignes avec 10% d’eau de Javel et d’eau pendant cinq minutes chacune.
Ensuite, exécutez des perles de contrôle de la qualité pour assurer le bon fonctionnement. Dans l’onglet Paramètres, sélectionnez Diffusion latérale vers l’avant et FITC pour le filtre de fluorescence. Tracez une zone de diffusion vers l’avant par rapport à un graphique de zone de diffusion latérale pour la population cellulaire principale près du centre du graphique.
Ensuite, tracez une zone de dispersion vers l’avant, par opposition à un tracé de largeur de dispersion vers l’avant pour les bandes horizontales étroites indiquant des singulettes. Dessinez ensuite une zone FITC en fonction d’un diagramme de zone de diffusion vers l’avant pour observer la distribution des cellules triées par la sonde fluorogénique sélective isoforme. Ensuite, dessinez un histogramme de zone FITC pour observer le changement de population basé sur FITC et déterminer le pourcentage de cellules positives à l’aldéhyde déshydrogénase 1A1.
Pour optimiser la puissance laser FITC, exécutez un échantillon avec la sonde de sorte que la queue droite de la courbe de l’histogramme soit proche du signal de zone FITC maximal. L’étape d’optimisation de la puissance laser peut devoir être répétée plusieurs fois, mais la puissance laser ne doit pas être modifiée d’un échantillon à l’autre, une fois qu’un réglage a été désigné pour une expérience. Ensuite, ajoutez un échantillon au tamis et exécutez-le avec la sonde de contrôle.
Un déplacement de population doit être observable pour révéler la plage dynamique maximale. Exécutez chaque échantillon pour 10 000 comptages effectués en trois exemplaires. Une fois le prélèvement d’échantillons terminé, faites fonctionner les conduites avec 10 % d’eau de Javel et d’eau pendant cinq minutes chacune, puis éteignez l’instrument.
Traitez les données à l’aide d’un logiciel de cytométrie en flux et effectuez la démarche de la population cellulaire souhaitée. À l’aide de la sélection de la porte rectangulaire, définissez la démarche négative de l’aldéhyde déshydrogénase 1A1, de sorte que plus de 99,5 % des événements dans les échantillons de sonde de contrôle se produisent à l’intérieur de cette porte. Les cellules restantes seront considérées comme positives à l’aldéhyde déshydrogénase 1A1.
Appliquez les mêmes portes à l’échantillon de sonde. Quantifier le nombre d’événements considérés comme aldéhyde déshydrogénase 1A1 négatifs et 1A1 positifs. Les activations moyennes de plis pour chaque lignée cellulaire ont été déterminées pour quantifier l’activité totale de l’aldéhyde déshydrogénase 1A1.
Le pourcentage de cellules positives à l’aldéhyde déshydrogénase 1A1 a été déterminé dans chaque lignée cellulaire en réglant la puissance et le gain du laser. Pour minimiser le signal dans l’échantillon de contrôle traité AlDeSense AM, le signal de fluorescence a été optimisé dans les cellules traitées AlDeSense AM. En comptant le nombre de cellules positives à l’aldéhyde déshydrogénase A1A, le pourcentage de cellules positives à l’aldéhyde déshydrogénase A1A a été déterminé.
Avec l’application de la sonde fluorogénique sélective isoforme, la population cellulaire positive à l’aldéhyde déshydrogénase 1A1 a été quantifiée dans chaque lignée cellulaire en évaluant les 0,5 % des cellules les plus brillantes de la population témoin traitée par AlDeSense AM. L’analyse du panel de cellules cancéreuses de l’ovaire a révélé le pourcentage de cellules positives à l’aldéhyde déshydrogénase 1A1. À partir des résultats obtenus des lignées cellulaires cancéreuses testées, on peut conclure que BG-1 a la plus faible activité aldéhyde déshydrogénase 1A1 et la plus faible aldéhyde déshydrogénase 1A1 population positive.
De plus, l’imagerie confocale et la cytométrie en flux ont révélé le plus grand pourcentage de cellules positives à l’aldéhyde déshydrogénase 1A1 dans les cellules Caov-3. Mais l’activité globale de la lignée cellulaire n’était que la troisième plus élevée. Alternativement, les cellules OVCAR-3 contenaient la troisième population positive à l’aldéhyde déshydrogénase 1A1 la plus élevée, mais présentaient l’activité globale la plus élevée.
AlDeSense est une sonde polyvalente et généralisable pour identifier les CSC dans les lignées cellulaires immortalisées et dans les échantillons de patients. Nous espérons le voir comme un outil pronostique en milieu clinique.
