Il nostro protocollo consente agli utenti di misurare l'attività di ALDH1A1, un biomarcatore di cellule staminali utilizzando diverse modalità che vanno dalla citometria a flusso all'imaging molecolare delle cellule vive. I principali vantaggi di questo approccio sono che l'attivazione della sonda coinvolge la risposta di turnaround caratterizzata da un elevato rapporto segnale/fondo, nonché il rilevamento selettivo dell'isoforma ALDH1A1. A dimostrare questa procedura saranno Michael Lee, Sarah Gardner e Rodrigo Tapia Hernandez studenti laureati del mio laboratorio.
Per iniziare, aspirare i terreni di crescita dalle cellule coltivate di interesse in otto vetrini a camera. Aggiungere 500 microlitri per pozzetto di terreno libero da siero integrato con una sonda fluorogenica selettiva isoforme a due micromolari o una sonda di controllo non reattiva. Incubare il vetrino a temperatura ambiente per 30 minuti.
Dopo l'incubazione, procedere immediatamente all'imaging al microscopio confocale. Individuare le celle con un ingrandimento di 10x. Il canale FITC e i canali di luce trasmessa sono necessari per questo esperimento.
Individuare e focalizzare le cellule utilizzando il canale di luce trasmessa per concentrarsi sullo stesso piano Z per l'intero esperimento per rimuovere la distorsione. Regolare la potenza del laser e il guadagno FITC sull'impostazione appropriata in cui il segnale proveniente dai campioni AlDeSense AM di controllo è minimamente rilevabile, pur continuando a vedere il segnale nei campioni AM AlDeSense. Regola ogni parametro facendo scorrere la barra corrispondente.
Potrebbe essere necessario regolare alcune volte le impostazioni per identificare i parametri corretti. Una volta ottimizzato, completa il resto dell'esperimento all'interno di quella linea cellulare usando parametri identici. Scatta tre immagini per pozzetto per un totale di tre pozzetti per condizione di trattamento e salva le immagini.
Assicurarsi di mettere a fuoco utilizzando il canale di luce trasmessa solo durante il passaggio tra piani e pozzi per evitare distorsioni. Successivamente, utilizzando il software di elaborazione delle immagini, dividere il file CZI in diversi canali e contare il numero totale di celle e celle fluorescenti. Per determinare la percentuale di cellule positive all'aldeide deidrogenasi 1A1, dividere il numero di celle fluorescenti per il numero totale di cellule in ciascuna immagine.
Conta allo stesso modo per ogni immagine per evitare variabili confondenti. Estrarre un pallone per coltura cellulare T25 contenente le cellule conservate nell'incubatore. Aggiungi tripsina per il distacco delle cellule e conta le celle usando un contatore automatico delle celle.
Quindi pellettare le celle in un tubo da centrifuga da 15 millilitri mediante centrifugazione a 180G per cinque minuti a 25 gradi Celsius. Risospendere le cellule in un millilitro di una sonda a due micromolari o di una soluzione di sonda di controllo in PBS. Scuotere le cellule a temperatura ambiente per 60 minuti per garantire un'esposizione uniforme al colorante.
Dopo il periodo di incubazione, pellettare le cellule mediante centrifugazione a 180 G per cinque minuti a 25 gradi Celsius. Quindi risospendere le cellule in 0,5 millilitri di PBS. Far passare le cellule attraverso un filtro cellulare a maglia di nylon di 35 micrometri su un tubo posto sul ghiaccio per rimuovere i grumi cellulari che potrebbero ostruire il citometro a flusso.
Accendere lo strumento del citometro a flusso ed eseguire il protocollo di avvio. Controllare la presenza di liquido della guaina e vita vuota. Fai scorrere le linee con il 10% di candeggina e acqua per cinque minuti ciascuna.
Quindi eseguire perline di controllo qualità per garantire il corretto funzionamento. Nella scheda delle impostazioni, selezionare scatter forward scatter side scatter e FITC per il filtro a fluorescenza. Disegnare un'area di dispersione diretta rispetto a un grafico dell'area di dispersione laterale per la popolazione di celle principali vicino al centro del grafico.
Quindi, disegnate un'area di dispersione in avanti, rispetto a un grafico della larghezza di dispersione in avanti per le bande orizzontali strette che indicano le canottiere. Quindi disegnare un'area FITC rispetto a un grafico dell'area di dispersione in avanti per osservare la distribuzione delle cellule ordinate dalla sonda fluorogenica selettiva isoform. Successivamente, disegnare un istogramma dell'area FITC per osservare lo spostamento della popolazione basato su FITC e determinare la percentuale di cellule positive all'aldeide deidrogenasi 1A1.
Per ottimizzare la potenza del laser FITC, eseguire un campione con la sonda in modo che la coda destra della curva dell'istogramma sia vicina al segnale dell'area FITC massima. La fase di ottimizzazione della potenza del laser potrebbe dover essere ripetuta più volte, ma la potenza del laser non dovrebbe essere alterata tra i campioni, una volta che è stata designata un'impostazione per un esperimento. Successivamente, aggiungere un campione al setaccio ed eseguirlo con la sonda di controllo.
Uno spostamento della popolazione dovrebbe essere osservabile per rivelare la gamma dinamica massima. Esegui ogni campione per 10.000 conteggi eseguiti in triplice copia. Dopo aver completato la raccolta dei campioni, eseguire le linee con candeggina al 10% e acqua per cinque minuti ciascuna, quindi spegnere lo strumento.
Elaborare i dati utilizzando il software di citometria a flusso e percorrere la popolazione cellulare desiderata. Utilizzando la selezione del gate rettangolare, impostare l'andatura negativa dell'aldeide deidrogenasi 1A1, in modo che oltre il 99,5% degli eventi nei campioni della sonda di controllo si verifichi all'interno di questo gate. Le cellule rimanenti saranno considerate aldeide deidrogenasi 1A1 positiva.
Applicare le stesse porte al campione di sonda. Quantificare il numero di eventi considerati aldeide deidrogenasi 1A1 negativi e 1A1 positivi. I turn-on medi di piegatura per ciascuna linea cellulare sono stati determinati per quantificare l'attività totale dell'aldeide deidrogenasi 1A1.
La percentuale di cellule positive all'aldeide deidrogenasi 1A1 è stata determinata in ciascuna linea cellulare regolando la potenza e il guadagno del laser. Per ridurre al minimo il segnale nel campione di controllo trattato con AlDeSense AM, il segnale di fluorescenza è stato ottimizzato nelle celle trattate con AlDeSense AM. Contando il numero di cellule A1A positive dell'aldeide deidrogenasi, è stata determinata la percentuale di cellule A1A positive dell'aldeide deidrogenasi.
Con l'applicazione della sonda fluorogenica selettiva isoform, la popolazione cellulare positiva all'aldeide deidrogenasi 1A1 è stata quantificata all'interno di ciascuna linea cellulare mediante il gating per lo 0,5% delle cellule più brillanti all'interno della popolazione di controllo trattata con AlDeSense AM. L'analisi del pannello di cellule tumorali ovariche ha rivelato la percentuale di cellule positive all'aldeide deidrogenasi 1A1. Dai risultati ottenuti delle linee cellulari tumorali testate, si può concludere che BG-1 ha la più bassa attività dell'aldeide deidrogenasi 1A1 e la più bassa aldeide deidrogenasi 1A1 popolazione positiva.
Inoltre, l'imaging confocale e la citometria a flusso hanno rivelato la più grande percentuale di cellule aldeidi deidrogenasi 1A1 positive nelle cellule Caov-3. Ma l'attività complessiva della linea cellulare era solo la terza più alta. In alternativa, le cellule OVCAR-3 contenevano la terza più alta popolazione positiva all'aldeide deidrogenasi 1A1, ma mostravano la più alta attività complessiva.
AlDeSense è una sonda versatile e generalizzabile per identificare le CSC in linee cellulari immortalizzate e in campioni di pazienti. Speriamo di vederlo come uno strumento prognostico in ambito clinico.
