Unser Protokoll ermöglicht es Anwendern, die Aktivität von ALDH1A1, einem Stammzell-Biomarker, mit verschiedenen Modalitäten zu messen, die von der Durchflusszytometrie bis hin zur molekularen Bildgebung lebender Zellen reichen. Die Hauptvorteile dieses Ansatzes bestehen darin, dass die Sondenaktivierung die Turnaround-Reaktion beinhaltet, die durch ein hohes Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis gekennzeichnet ist, sowie die selektive Detektion von ALDH1A1-Isoformen. Dieses Verfahren wird von Michael Lee, Sarah Gardner und Rodrigo Tapia Hernandez, Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert.
Saugen Sie zunächst die Wachstumsmedien aus den kultivierten Zellen von Interesse in einem Objektträger mit acht Brunnenkammern ab. Fügen Sie pro Vertiefung 500 Mikroliter serumfreies Medium hinzu, ergänzt durch eine selektive fluorogene Sonde mit zwei mikromolaren Isoformen oder eine nicht reaktive Kontrollsonde. Inkubieren Sie den Objektträger 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Nach der Inkubation ist sofort mit der konfokalen mikroskopischen Bildgebung fortzufahren. Lokalisieren Sie die Zellen bei 10-facher Vergrößerung. Für dieses Experiment werden der FITC-Kanal und die Durchlichtkanäle benötigt.
Lokalisieren und fokussieren Sie die Zellen mithilfe des Durchlichtkanals, um während des gesamten Experiments auf dieselbe Z-Ebene zu fokussieren und Verzerrungen zu beseitigen. Stellen Sie die Laserleistung und die FITC-Verstärkung auf die entsprechende Einstellung ein, bei der das Signal von den AlDeSense AM-Samples minimal detektierbar ist, während das Signal in den AlDeSense AM-Samples weiterhin sichtbar ist. Passen Sie jeden Parameter an, indem Sie den entsprechenden Balken verschieben.
Die Einstellungen müssen möglicherweise einige Male angepasst werden, um die richtigen Parameter zu identifizieren. Nach der Optimierung schließen Sie den Rest des Experiments innerhalb dieser Zelllinie mit identischen Parametern ab. Nehmen Sie drei Bilder pro Well auf, um insgesamt drei Wells pro Behandlungsbedingung zu erhalten, und speichern Sie die Bilder.
Stellen Sie sicher, dass Sie nur mit dem Durchlichtkanal fokussieren, wenn Sie zwischen Ebenen und Vertiefungen wechseln, um Verzerrungen zu vermeiden. Als nächstes teilen Sie die CZI-Datei mit der Bildverarbeitungssoftware in verschiedene Kanäle auf und zählen die Gesamtzahl der Zellen und fluoreszierenden Zellen. Um den Prozentsatz der Aldehyddehydrogenase-1A1-positiven Zellen zu bestimmen, teilen Sie die Anzahl der fluoreszierenden Zellen durch die Gesamtzahl der Zellen in jedem Bild.
Zählen Sie für jedes Bild auf die gleiche Weise, um verwirrende Variablen zu vermeiden. Nehmen Sie einen T25-Zellkulturkolben mit den im Inkubator aufbewahrten Zellen heraus. Fügen Sie Trypsin für die Zellablösung hinzu und zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler.
Anschließend pelletieren Sie die Zellen in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen durch Zentrifugieren bei 180 G für fünf Minuten bei 25 Grad Celsius. Resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter einer zweimikromolaren Sonde oder einer Kontrollsondenlösung in PBS. Schaukeln Sie die Zellen 60 Minuten lang bei Raumtemperatur, um eine gleichmäßige Einwirkung des Farbstoffs zu gewährleisten.
Nach der Inkubationszeit pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 180 G für fünf Minuten bei 25 Grad Celsius. Anschließend werden die Zellen in 0,5 Milliliter PBS resuspendiert. Führen Sie die Zellen durch ein 35-Mikrometer-Nylonnetz-Zellsieb auf ein auf Eis gelegtes Röhrchen, um Zellklumpen zu entfernen, die das Durchflusszytometer verstopfen könnten.
Schalten Sie das Durchflusszytometer ein und führen Sie das Startprotokoll aus. Prüfen Sie, ob die Scheidenflüssigkeit vorhanden ist und die Taille leer ist. Lassen Sie die Leitungen mit 10% Bleichmittel und Wasser für jeweils fünf Minuten laufen.
Führen Sie dann Qualitätskontrollperlen durch, um eine ordnungsgemäße Funktion sicherzustellen. Wählen Sie auf der Registerkarte "Einstellungen" die Option "Vorwärtsstreuung, Seitenstreuung" und "FITC" für den Fluoreszenzfilter aus. Zeichnen Sie eine Vorwärtsstreufläche im Vergleich zu einem Seitenstreuflächendiagramm für die Hauptzellenpopulation in der Nähe der Mitte des Diagramms.
Zeichnen Sie als Nächstes einen nach vorne gerichteten Streubereich im Gegensatz zu einem Diagramm der vorwärts gerichteten Streubreite für die schmalen horizontalen Bänder, die Singuletts anzeigen. Zeichnen Sie dann ein FITC-Flächendiagramm im Vergleich zu einem Vorwärtsstreuflächendiagramm, um die Verteilung der Zellen zu beobachten, die nach der isoformselektiven fluorogenen Einschaltsonde sortiert sind. Zeichnen Sie als Nächstes ein FITC-Flächenhistogramm, um die Verschiebung der Population basierend auf FITC zu beobachten und den Prozentsatz der Aldehyddehydrogenase-1A1-positiven Zellen zu bestimmen.
Um die FITC-Laserleistung zu optimieren, führen Sie eine Probe mit der Sonde so aus, dass sich das rechte Ende der Histogrammkurve in der Nähe des maximalen FITC-Flächensignals befindet. Der Schritt zur Optimierung der Laserleistung muss möglicherweise mehrmals wiederholt werden, aber die Laserleistung sollte nicht über die Proben hinweg verändert werden, sobald eine Einstellung für ein Experiment festgelegt wurde. Fügen Sie anschließend eine Probe zum Sieb hinzu und führen Sie sie mit der Kontrollsonde aus.
Eine Populationsverschiebung sollte beobachtbar sein, um den maximalen Dynamikumfang zu ermitteln. Führen Sie jede Probe für 10.000 Zählungen in dreifacher Ausführung durch. Lassen Sie die Leitungen nach Abschluss der Probenentnahme jeweils fünf Minuten lang mit 10 % Bleichmittel und Wasser laufen und schalten Sie das Gerät dann aus.
Verarbeiten Sie die Daten mit einer Durchflusszytometrie-Software und ermitteln Sie die gewünschte Zellpopulation. Stellen Sie unter Verwendung der Rechteck-Gate-Auswahl den negativen Gang der Aldehyddehydrogenase 1A1 so ein, dass mehr als 99,5 % der Ereignisse in den Kontrollsondenproben innerhalb dieses Gates auftreten. Die verbleibenden Zellen gelten als Aldehyddehydrogenase-1A1-positiv.
Wenden Sie die gleichen Gatter auf die Sondenprobe an. Es sollte die Anzahl der Ereignisse quantifiziert werden, die als Aldehyddehydrogenase 1A1 negativ und 1A1 positiv angesehen werden. Die durchschnittlichen Faltungseinschaltungen für jede Zelllinie wurden bestimmt, um die Gesamtaktivität der Aldehyddehydrogenase 1A1 zu quantifizieren.
Der prozentuale Anteil an Aldehyddehydrogenase-1A1-positiven Zellen wurde in jeder Zelllinie durch Abstimmung der Laserleistung und -verstärkung bestimmt. Um das Signal in der mit AlDeSense AM behandelten Kontrollprobe zu minimieren, wurde das Fluoreszenzsignal in den mit AlDeSense AM behandelten Zellen optimiert. Durch Zählen der Anzahl der Aldehyddehydrogenase-A1A-positiven Zellen wurde der prozentuale Anteil der Aldehyddehydrogenase-A1A-positiven Zellen bestimmt.
Mit Hilfe der isoformselektiven fluorogenen Sonde wurde die Aldehyddehydrogenase-1A1-positive Zellpopulation innerhalb jeder Zelllinie quantifiziert, indem die besten 0,5 % der hellsten Zellen innerhalb der mit AlDeSense AM behandelten Kontrollpopulation angesteuert wurden. Die Analyse des Panels von Eierstockkrebszellen hat den Prozentsatz der Aldehyddehydrogenase-1A1-positiven Zellen ergeben. Aus den erhaltenen Ergebnissen der getesteten Krebszelllinien kann geschlossen werden, dass BG-1 die niedrigste Aldehyddehydrogenase-1A1-Aktivität und die niedrigste Aldehyddehydrogenase-1A1-positive Population aufweist.
Darüber hinaus zeigten konfokale Bildgebung und Durchflusszytometrie den größten Anteil an Aldehyddehydrogenase-1A1-positiven Zellen in Caov-3-Zellen. Die Gesamtaktivität der Zelllinie war jedoch nur die dritthöchste. Alternativ enthielten OVCAR-3-Zellen die dritthöchste Aldehyddehydrogenase-1A1-positive Population, wiesen aber die höchste Gesamtaktivität auf.
AlDeSense ist eine vielseitige und generalisierbare Sonde zur Identifizierung von CSCs in immortalisierten Zelllinien und in Patientenproben. Wir hoffen, dass wir es als prognostisches Instrument im klinischen Umfeld sehen können.
