このプロトコルは、標的脳領域の調節可能な均一灌流のためのステップカテーテルシステムを使用して小さなげっ歯類で対流強化送達を行うために使用することができる。対流強化送達の利点は、組織の損傷や逆流をほとんど伴わない血液脳関門を迂回して、関心領域への物質の送達を可能にすることです。この技術は、主に抗体などの治療物質を脳に送達するのに有用である。
したがって、多くの神経学的状態を標的にするために使用することができる。手順を実証することは、私の研究室のポストドクターであるミハル・ベフフィンガーです。まず、内径0.1ミリメートル、壁厚0.325ミリメートルの長さ30ミリメートルの融合シリカキャピラリーチューブを切断します。
亀裂のためのチューブを調べた後、チューブ開口部が滑らかな表面を持っていることを確認するために、端部を加熱するためにマイクロフォージを使用しています。次に、27ゲージの針を10マイクロリットルのシリンジに取り付け、シリンジを立体性ロボットに入れる。ロボットを使用して、硬い表面上に注射器を移動し、針の先端で表面に触れます。
この位置に目を通した後、針の中に20ミリメートルの毛細血管が突き出るように針の中に融合したシリカ毛細血管を配置できるように針を上昇させる。ピペットを使用して、金属針から始まり、毛細血管の下端から10ミリメートル上に仕上げる毛細血管の上に高粘度シアノアクリル酸接着剤の2マイクロリットルを均等に広げます。金属針の先端から1ミリメートルのステップを形成する金属針に融合したシリカ毛細血管を固定するために、針の先端が参照面の上に1ミリメートルになるまで、金属針を下げる立体戦術ロボットを使用します。
カテーテルステップの植え付けを避けるために、金属針の端に形成される余分な接着剤を除去します。顕微鏡の下の先端を確認して、余分な接着剤がすべて取り除かれたことを確認します。その後、接着剤が硬化し、ロボットからカテーテルで注射器を取り除くのを15分待ちます。
ステップカテーテル試験のために切断された0.6%アガロースゲルを20 20ミリメートルブロックに固め、手動で濾過された0.4%トリパンブルー溶液の10マイクロリットルでステップカテーテルシリンジを充填します。定位ロボットを使用して、1分間に0.2マイクロリットルで1マイクロリットルの色素を分配し、固定手順中にカテーテルのステップのシールを評価します。トリパンブルーの溶液は、カテーテルの先端にのみ見えるはずです。
紙のティッシュで染料を拭き取り、立体戦術ロボットにアガロースブロックを置きます。ロボットの較正は、カテーテルの先端がアガロースブロックの表面に対して参照されると述べた。特定の実験計画に従って、射出量の割合の系列を設定します。
この溶液をマウスケーデートプタメンに注入するには、注射を3.5ミリメートルの深さでブレグマ位置から1ミリメートル前頭および1ミリメートルから2ミリメートルの側面にセットする。針が位置にあるときに対流強化配信手順を開始し、アガロースブロックにトリパンブルー溶液の5マイクロリットルを注入します。アガロースのトリパンブルー雲の形状とカテーテル管に沿った漏れの可能性を評価します。
金属針の先端に大きな逆流は見えないはずです。注射後、カテーテルを2分間所定の位置に置き、針を1分あたり1ミリメートルで引き込み、取り外し中に脳への液体の適切な分散と注射管のシールを確実にする。ロボットに新しいアガロースブロックを入れ、1マイクロリットルの2回目の注射を毎分0.2マイクロリットルで開始し、アガロース内のカテーテルの詰まりを評価します。
トリパンブルーは、注射開始直後にカテーテルの先端から再び雲を形成する必要があります。次に、シリンジの残り量が3マイクロリットルに対応しているかどうかを評価し、任意のバリエーションがカテーテル取り付けまたはシリンジプランジャーを通して流体の漏れを示す可能性があります。マウスの線条体への抗体注射のために麻酔マウスの皮膚ピンチに対する応答の欠如を確認し、ヘアトリマーで頭を剃る。
ヨウ素溶液に浸した綿棒で皮膚を消毒します。メスを使用して、目の高さで頭蓋中線仕上げに沿って10ミリメートルの皮膚切開を行います。鼻クランプとイヤーバーを使用して、マウスを立体フレームに固定し、頭蓋骨の表面が水平でしっかりと固定されていることを確認します。
シリンジを立体性ロボットに入れ、ドリルビットを基準点のカテーテル先端と同期させます。鉗子を使用して皮膚を引き込み、頭蓋骨表面のブレグマを局地化します。ドリルビットの先端を使用してソフトウェア内のブレグマを参照し、ブレグマ位置から1ミリメートルの正面と2ミリメートルの側面にドリルを移動します。
硬膜を損傷しないようにバリ穴を開け、バリ穴の上に注射器を移動します。0.5~1マイクロリットルのシリンジを塗布し、カテーテルに気泡が残らないようにします。示されているように対流の強化された送達を開始し、注入スポットからの流体逆流の痕跡について頭蓋骨表面を観察します。
送達およびカテーテル除去の終わりに注入ポンプは、注射の間にカテーテルが詰まる証拠を確認するために毎分0.2マイクロリットルで開始する。詰まりが発生しなかった場合は、注射液の滴は、カテーテル先端から来てすぐに観察されるべきである。示されているように、対流強化カテーテルを使用して1分間に0.5マイクロリットルで1マイクロリットルの色素を注入した後に形成されるトリパンブルーの雲のこの画像では、針路に沿った逆流はカテーテルステップの開始時に見えませんでした。
そして分散した雲は所望の球形を形成した。しかし、鈍い端針を用いたこの画像では、有意な逆流が観察された。特に、対流強化送達は、従来の注射に比べて均一かつ少ない組織損傷様式でマウス脳への大量の灌流を可能にする。
どちらのタイプの送達でも、脳梁の上に抗体およびデキストラン粒子の典型的な分布プロファイルがある。しかしながら、注入された抗体の分散プロファイルは、対流強化送達後の高分子量デキストランに対して観察されるよりも拡散し、異なる注入物間の分布の相違を例示する。カテーテルは脳の注入中に詰まらせる可能性がありますので、少量の注入物をゆっくりと分配することによって、すぐにそれをチェックすることが重要です。
この手順は、脳に薬理学的に活性な化合物を提供する方法として役立つ可能性があり、病気の症状と期待される副作用の綿密な監視に続く必要があります。.この技術は、抗体を含む治療薬を用いた正確な脳領域の注入を可能にし、中枢神経系標的療法の開発に新たな可能性を開く。
