The authors thank Mr. Masaaki Kaneta, Ms. Hiromi Suzuki, and Ms. Mitsue Kawashima (Department of Regenerative and Infectious Pathology, Hamamatsu University School of Medicine) for their excellent technical assistance. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science, KAKENHI Grant Number 23590445.

すべての実験プロトコルは、医学部の浜松大学の動物実験委員会によって承認されました。 MCMV（スミス株）および組換えの調製M32が強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）-MCMV <ol><li>以前に8を説明し、 -組換えM32-EGFP-MCMVは（1.9 1.2）は以下のような方法に従って生成します。 </li><li>野生型MCMV（：U68299アクセッション番号）のスミス株由来の組換えウイルスを使用してください。挿入EGFP（4361塩基対; bp）の37089および41450塩基対（M32 - M31遺伝子座）との間にMCMVゲノム中の相同組換えによる。 </li><li> M32、5&#39;-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 &#39;（フォワードプライマー）、5：MCMV M32（41450ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅-右、以下のプライマーを用いて配列の遺伝子座に隣接する、39246 BP - 39286 bpのは、フランキング配列およびM31（37089を左「-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 &#39;（リバースプライマー）; M31、5&#39;-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3&#39;（フォワードプライマー）、5&#39;-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3 &#39;（リバースプライマー）。 </li><li> NheIおよびBamHI制限部位を用いてEGFP発現ベクターにM32軌跡を挿入します。 AflIIおよびXbaI部位を用いて、M32-EGFP -recombinantプラスミドにM31遺伝子座を挿入します。 EGFP - - M32からNheIおよびAflIIでM31系列 - EGFP - M32を切断M31組換えプラスミドおよびH 2 Oに溶解し</li><li> MCMVの核に切断構築物をトランスフェクト（スミス株）相同組換えを誘導するためにエレクトロポレーションシステムを使用して、24時間の感染後（HPI）NIH3T3細胞をに感染し。 </li><li> 3日後に感染、感染細胞のEGFP発現病巣のための6ウェルプレートで1 /千の比と、画面で非感染マウス胚繊維芽細胞（MEF）との共培養細胞で。 </li><li>ハーヴ緑色蛍光病巣を含むウェルからSTウイルス含有上清および10倍に希釈します。精製のために、単一の緑色蛍光病巣を表示井戸を選択します。 </li><li>すべての病巣が、限界希釈感染表示EGFPの発現に起因する場合には、ウイルス調製物には、野生型ウイルスが残っていないことを示す、純粋です。以前に17を説明したようにプラークアッセイ法によりウイルスを定量化します。 </li><li>手袋とマスクを着用してバイオセーフティーレベル2の認定安全キャビネット内のMCMVを扱います。 </li><li> 12日齢のICRマウス胚から調製したMEFにおける通過MCMV（スミス株）および組換えMCMVは、以前に17を説明しました。 </li><li> 16℃で20分間、3000×gで遠心分離することにより、感染MEF培養物の上清から細胞を除去します。 </li><li>超遠心機7万×gで40分間上清。トリス緩衝生理食塩水1mlにビリオンを含有するペレットを再懸濁し、予め形成直線Sに転送しますorbitol勾配（25％ - 70％）。 60分18 70,000×gで再び超遠心分離器。 </li><li>シリンジでビリオン含有バンドを収穫。 40分間70,000×gで、追加の超遠心分離工程によって収穫したビリオンをペレット。 </li><li>感染実験まで-80℃でリン酸緩衝生理食塩水（PBS）と店舗1ml中のペレットを再懸濁します。 </li><li>以前19に記載のようにプラークアッセイ法でウイルス力価を定量化します。 </li><li>透過型電子顕微鏡（TEM）8（ 図1B）によって、蛍光顕微鏡（ 図1A）及び粒子構造によって組換えMCMV粒子（489 nmで励起、508 nmでの発光）のEGFP発現を可視化します。 </li></ol>ナイルレッド蛍光マイクロビーズの作製<ol><li>カルボキシル蛍光ナイルレッドマイクロビーズを購入し、直径に応じてチューブにマイクロビーズを500μlを置く（0.04-約0.06ミクロン、3.63×10 12粒子; 0.1から0.3ミクロン、約5.75×10 10粒子;および1.7から2.2ミクロン、約6.85×10 7粒子）。 </li><li>任意のエンドトキシンを除去し、室温で滅菌水でビーズを再懸濁し、約1日0.1 M NaOHを500μlのビーズを扱います。 </li><li>使用前にRTでC57BL / 6マウスから得られた10％マウス血清をビーズO / Nを吸着します。 </li><li>骨材、渦ビーズを分離し、使用前に徹底的に超音波処理するには。 </li></ol>新生児マウスにMCMVおよび蛍光マイクロビーズの3 ICV注射<ol><li> 12時間の明/暗サイクルの下で温度制御施設において通常の妊娠ICRマウスを維持します。新生児は、誕生日にP 0.5に指定されています。 </li><li> 10μlのシリンジと70％アルコールで27 G針を滅菌します。 </li><li> MCMVまたは蛍光マイクロを含む注射液（5μl）をロードします慎重にシリンジのプランジャーを引いて針にビーズ。 </li><li> 4分 - 3氷の上でマウスを置くことによって新生児マウス（P 0.5）を抑制する。動物が麻酔下になると、麻酔の深さを決定するために、つま先ピンチ応答メソッドを使用します。 </li><li>マーク約0.7場所で非毒性実験用ペンで注射部位-新生児ブレグマ（ 図2A）から1.0ミリメートルの尾- 1.0ミリメートルは、矢状縫合と0.7に横。 </li><li>マークされた注射部位で頭蓋骨の表面に対して垂直の深針2ミリメートルを挿入します。参考のために、非毒性メーカーと針の先端から2ミリメートルをマーク。 </li><li>ゆっくりと頭皮（ 図2B）を開くことなく、側脳室へのMCMV（約5×10 5 PFU）の5μLを注入します。 </li><li>マウスの別のグループ、蛍光マイクロビーズを含む5μlの液を注入（0.1から0.3ミクロン、約5.75×10 8粒子）ではにより同じ方法。 </li><li>逆流を防止するために、プランジャの動きを中止した後、20秒 - ゆっくりと針10を除去します。 </li><li>運動や一般応答性が回復されるまで、暖かい容器に10分 - 回復するには、5のためのマウスを保持します。 </li><li>時点（3、12、24、48、及び72時間）、注射後の範囲において第5章に記載されているように脳を収穫。 </li></ol>新生児マウスにMCMVまたは蛍光マイクロビーズの4 IV注入<ol><li> 4分 - 3氷の上でマウスを置くことによって新生児マウス（P 0.5）を抑制する。 </li><li> Pで0.5新生児をMCMVの静脈内注射を行うために35 G針で1-mlの注射器を使用してください。 </li><li>浅側頭（顔）静脈を可視化するためにトランスイルミネーター（静脈ファインダー）を使用します。注射の前に、サージカルテープ（ 図2C）を使用して、トランスイルミネーターに新生児を確保。 </li><li>拡大鏡（1.5X）を装着したまま、ゆっくり（約5.45×MCMVの50μLを注入; 10 9粒子）または蛍光マイクロビーズ（0.04から0.06ミクロン、約3.63×10 11粒子; 0.1から0.3ミクロン、約5.75×10 9粒子;および1.7から2.2ミクロン、約6.85×10 6粒子）浅側頭静脈へ（ 図2D）。 </li><li>針を除去した後、出血が止まるまで、注射部位に圧力を適用するために、70％のアルコールを含むガーゼを使用します。 </li><li>新生児を温かくコンテナはケージに戻す前に回復するには約5分を与えます。 </li><li>時点（3、12、24、及び72時間）、注射後の範囲において第5章に記載されているように脳を収穫。 </li></ol>パラフィン切片5.脳組織サンプルの調製<ol><li>砕いた氷の上の小さなプラスチック皿に注入された新生児を置きます。 </li><li>動物が麻酔下にあると、anesthesの深さを決定するために、つま先ピンチ応答メソッドを使用しIA。 </li><li>胸腔を開くために胸郭を通じて一つの中心または2の端の水平エンドカットを行います。 </li><li>鋭いハサミで心房内のカットを行います。心房中4％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液を注入します。肝臓の自発運動（PFAダンス）と軽く色が​​観察されたときに灌流を停止します。放血しないで​​ください。 </li><li>最初のはさみのペアを使用してヘッドを除去することによって、（以前に20を説明したように）新生児を解剖。 </li><li>頭蓋骨を露出するために鼻に首から外皮に沿って正中切開を行います。 </li><li>慎重に頭蓋骨の内面に沿ってスライドする、片側の大後頭孔にアイリスのはさみのペアの鋭い端を置きます。 </li><li>後部頭蓋骨表面の遠位端まで延びるカットを行い、対側で同一のカットを行います。小脳の周りの頭蓋骨を離れてオフにします。 </li><li>慎重に脳の損傷を防止するために、一方の側に頭蓋骨をバック剥離。これを繰り返し脳の反対側の作業を行います。 </li><li>スパチュラを用いて、脳の腹側表面に沿って嗅球や神経の接続を断ちます。 </li><li>静かにまだハサミを使用して頭蓋骨に脳を接続し、脳を除去し、任意の硬膜をトリミング、頭から脳を分離します。 </li><li> 4％PFAで4℃で24時間のための脳の少なくとも10倍のボリュームを含む固定液のバイアル中に脳を置きます。 </li><li>水を置換するために段階的エタノール浴の一連の組織を脱水してから、ブロックを形成し、パラフィンワックスで潜入。 21 4μmの厚さのスライスにミクロトームでパラフィンブロックをカット。 </li><li>脱パラフィン化し、感染した脳22のスライドを再水和します。パラフィン包埋切片のためのin situハイブリダイゼーションに進んでください。 </li></ol>凍結切片6.脳組織サンプルの調製<ol><li> 5.11から5.1に記載されている手順後の脳を削除してください。 </li><li>蛍光マイクロビーズおよびM32-EGFP-MCMVを観察するために、平底cryomoldsに切除脳を置きます。完全に脳試料をカバーするためにメディアを埋め込む追加。スナップは、チャックに取り付ける前にcryomoldsのエッジを保持するために鉗子を使用して、予備冷却のnヘキサン（-80ºC）でcryomoldsを凍結します。 </li><li>切片については、予冷クライオスタットチャック上に凍結組織ブロックを取り付けます。クライオスタットチャンバ内にチャックで凍結組織を移し、-10〜-20℃に温度を下げ、約8スライスカット- 23厚さ10μmを。 </li><li>噴霧することによりcytofixative（イソプロピルアルコールおよびポリエチレングリコールの混合物）を持つセクションを修正しました。空気はすぐに噴霧した後、室温で30分間のセクションを乾燥し、でそれらを保存する - さらに使用するまで80ºC。 </li><li>バックRTの切片を平衡化し、PBSで3回洗浄します。 </li><li> Gを抱合フルオレセインイソチオシアネート（FITC）を持つセクションを染色1の濃度の100 RTでPBS中で10分間（ 図5）またはPE結合CD31抗体を用いた：riffoniaの1の濃度でB4イソレクチンsimplicifolia 100 RTでPBS中で30分間（ 図6）。 </li><li> PBSで3回のセクションを洗ってください。 </li><li>洗浄後、細胞核を可視化するために4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を用いて切片を染色します。 、EGFP（489 nmで励起、508 nmでの発光）（345 nmで、455 nmでの発光での励起）抗退色試薬および画像DAPIのセクションをマウントし、ナイルレッド（553 nmで励起、637 nmでの発光）蛍光顕微鏡（ 図3、図5、図6）。 </li></ol>パラフィン包埋切片のためのin situハイブリダイゼーション（FISH）7.蛍光<ol><li>全体MCMV DNAの世代を含む細菌人工染色体を使用して、ニックトランスレーションによってin situハイブリダイゼーションDNAのための蛍光体で直接標識FISHプローブを準備しますOME（pSM3fr）19。 FISHプローブの濃度は0.1μgの/μlです。 </li><li>脱パラフィン化し、感染した脳22のスライドを再水和します。 </li><li>ウイルスDNAを検出するためのRNase（PBS中100μg/ mlの）で組織切片を扱います。 </li><li> 20分間98°C - 95で0.05％NP40、0.01 Mクエン酸緩衝液（pH6.0）で抗原回復を実行します。 20分間室温までスライドを冷却します。 </li><li>ガラスコプリン染色ジャーに、2分間純水に各時間で3回スライドを洗浄します。 0.06％ペプシン、37℃で5分間、0.01 N HCl溶液で追加抗原回復手順を実行します。 </li><li>すすぎを2分間ガラスコプリン染色ジャー内のたびに、純水で3回スライド。 </li><li> 85％のエタノール、70％エタノールでスライドを転送することによって、再び組織切片を脱水し、その後、100％エタノール。 </li><li>ハイブリダイゼーション緩衝液10mlを調製するための、in situハイブリダイゼーション塩1.25ミリリットル（3MのNaCl、100mMのTrisを混ぜます-HCl pHは8.0、5ミリリットルと100 mMのリン酸ナトリウムpH6.8の、50mMのEDTA）を脱イオンホルムアミド、2.5ミリリットル50％デキストラン硫酸、250μlの50×デンハルト溶液、125μlの100 mg / mlでのtRNA、および875μlのH 2 O </li><li>直接ハイブリダイゼーション緩衝液中にランダムに全MCMVゲノムを認識する蛍光団で標識されたDNAプローブを希釈します。最終容量は10μlの（7μlのハイブリダイゼーション緩衝液、1μlのプローブ（0.1μgの/μL）、および2μlの蒸留水）でなければなりません。 </li><li>各スライドにプローブミックス（10μl）を加え、カバースリップ（15×15ミリメートル）でカバー。ゴムセメントでカバースリップをシール。 85℃で5分間、プローブミックスを変性させ、そして42℃でのハイブリダイゼーション工程のO / Nを完了する。 </li><li> 2分間73℃で0.3％NP40、0.4×のSSCでスライドを洗浄し; 0.1％NP40、1分間73℃で0.4×のSSCで、そして2×SSCで2回押します。 </li><li> DAPIで核対比染色（10ng / ml）及びカバーガラスとスライドをカバーしています。 </li><li>マウント蛍光顕微鏡（ 図4）を有する抗フェード試薬および画像DAPI（345 nmで励起、455 nmでの発光）とEGFP（489 nmで励起、508 nmでの発光）のセクション。 </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+viral+injection+of+the+neonatal+mouse+brain+for+persistent+and+widespread+neuronal+transduction.">Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction.</a> J Vis Exp. (91), e51863 (2014).</li><li>Glascock, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+therapeutic+agents+through+intracerebroventricular+(ICV)+and+intravenous+(IV)+injection+in+mice.">Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice.</a> J Vis Exp. (56), (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

動物モデルでは、ICV、腹腔内、直接胎盤、およびIV感染症はウイルス性脳炎の病因を研究するために使用されてきました。私たちは、手続きの簡単さと標的領域へ​​の粒子の直接注入の利益のために新生児マウスのICVおよびIV注入モデルに焦点を当てました。腹腔内感染が容易な方法であるが、ウイルス粒子は、間接的なプロセス5,24を介して全身に広がります。ダイレクト胎盤感染...

ウイルス性脳炎を研究する際に、ウイルス粒子の最初の分布は、疾患の病因を理解し、脳内のウイルスの標的を同定することが非常に重要です。パンドラウイルス属は、サイズが1以上700 nmであるが、ほとんどのウイルスは、20〜300nm程度の大きさの範囲。感染の急性期におけるウイルス粒子の分布は、粒子の大きさ、細胞受容体の分布、またはウイルスの細胞受容体の親和性に依存し得ます。動物モデル、脳室内（ICV）で、腹腔内、直接胎盤、および静脈内（IV）感染症は、ウイルス性脳炎の病因を研究するために使用されてきました。ウイルスのICV接種は、多くの場合、中枢神経系（CNS）のマウスにおける感染を確立するために使用されます。この技術を用いた研究は、特に脳室周囲のゾーン内の細胞および脳脊髄液（CSF）、similaと直接接触している脳の領域において、広範な感染が報告しますウイルスventriculoencephalitisの影響にrを。アデノ随伴ウイルス（AAV）粒子の小さいサイズ（20 -直径25 nm）はICV感染2-4の脳全体にその普及を促進します。腹腔内5、直接胎盤6、およびIV注射7は、造血全身投与を表します。血液脳関門（BBB）を介してウイルス粒子の侵入は、それらが拡散ミクログリア結節8,9を表し、新生児の脳の柔組織に到達することを可能にします。 サイトメガロウイルス（CMV）は、ヘルペスウイルスファミリーに属する一般的なウイルスです。米国では、50％ - 人の80％が年齢によってCMV感染があった40 CMV感染はまれに有害であるが、免疫不全患者や胎児疾患を引き起こす可能性があります。すべての配送のうち、0.2％ - 2％は、小頭症、脳室周囲石灰化、小脳形成不全、MICRなどの重篤な症状で、その結果、CMV 10を持って生まれています眼炎、視神経萎縮11,12。また、精神遅滞、感音難聴、視覚障害、発作、およびてんかんは非致命的CMV感染の乳児13,14の約10％に起こります。中枢神経系の機能不全は、CMV先天異常の最も一般的な特徴症状です。より多くの子供たちが永久にダウン症候群、胎児性アルコール症候群、または二分脊椎15よりも、先天性CMVが毎年無効になっています。現時点で入手可能なCMVに対しては予防接種は、安全かつ有効なワクチンの必要性を呼びかけ、ありません。感染の初期段階でそれらの受容体とCMV粒子の相互作用を研究することは、ワクチン接種の効果を理解することが重要です。 Ventriculoencephalitisとミクログリアの結節を拡散は、CMV脳炎16の二つの主要な病理学的特徴です。 （ - 300から150nm）感染aの急性期に脳を介して広がるCMV粒子がどのようにそれは不確かされ​​ていますndはどのように細胞受容体の分布やウイルスに対するそれらの親和性は、ウイルスの普及に貢献しています。川崎らは 、感染の初期段階での粒子およびその受容体の分布（β1インテグリン）の観点から、ICVおよびIV感染を評価しました。我々は、CMV粒子の普及とβ1インテグリンの発現がICVおよびIV感染8の両方で感染の初期段階ではよく相関していることを発見しました。 ICV感染はventriculoencephalitisのモデルであり、IV感染が拡散ミクログリア結節のモデルです。ウイルスや蛍光粒子のダイナミクスを研究することは、粒子サイズ、細胞受容体とウイルスの相互作用、および脳内のBBB透過のメカニズムの影響に関する有用な情報を与えるだろう。以下のプロトコルは、CNS内の任意のウイルス感染およびウイルスベクターを調査するために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6791</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-1758</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1 vector&amp;nbsp;</td><td>Clontech</td><td>#6085-1</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1876</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04 - 0.06</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>FP-00556-2</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1 - 0.3</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>FP-0256-2</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7 - 2.2</td><td>Spherotech, inc.&amp;nbsp;</td><td>FP-2056-2</td><td></td></tr><tr><td>10% mouse serum</td><td>DAKO&amp;nbsp;</td><td>X0910</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 mouse</td><td>SLC, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ICR mouse</td><td>SLC, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modified Microliter Syringes (7000 Series)</td><td>Hamilton company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35-gauge needle</td><td>Saito Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A Wee Sight Transilluminator</td><td>Phillips Healthcare</td><td>1017920</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.Compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet(R) P-40</td><td>Nacalai</td><td>25223-04</td><td></td></tr><tr><td>citrate buffer (pH 6) x 10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9999-100ml</td><td></td></tr><tr><td>pepsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>dojindo</td><td>N001</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>TCI</td><td>F0045</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfate sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42867-5G</td><td></td></tr><tr><td>Denhardt&#039;s Solution (50x)</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA (10 mg/ml)</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>AM7119</td><td></td></tr><tr><td>SSC 20x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>n-Hexane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090</td><td></td></tr><tr><td>superfrost plus glass</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>12-55-18</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeep II</td><td>Nippon Shoji Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4</td><td>Vector laboratories, Inc.</td><td>L1104</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE</td><td>ebioscience</td><td>12-0311</td><td></td></tr><tr><td>ProLong&amp;nbsp; Gold</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>BIOREVO</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-9000E</td><td></td></tr></tbody></table>

intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles and fluorescent microbeads into the neonatal brain

ウイルス性脳炎の病因に関する研究では、感染症法が重要です。脳への2つの主な感染経路の最初のは、脳の血管内皮細胞と周皮細胞の感染を伴う血行性経路、です。第二は、脳室内（ICV）ルートです。いったん中枢神経系（CNS）内で、ウイルスは脳脊髄液を介してくも膜下腔、髄膜、および脈絡叢に拡散する可能性があります。実験モデルでは、CNSのウイルス分布の初期段階では十分に特徴付けされていない、そして特定の細胞が最初に感染しているかどうかは不明です。ここでは、感染の急性期サイトメガロウイルス（CMV）の粒子の分布を分析し、新生児マウスの脳にICVまたは血管内（IV）注射の後、一次ウイルス血症と呼ばれます。 ICV注入モデルでは、マウスCMV（MCMV）、または蛍光マイクロビーズの5μlをmidpoiで側脳室に注入しましたntの27 G針を10μlのシリンジを使用して、耳と目の間。 IV注入モデルでは、35 G針を1 mlの注射器を使用しました。トランスイルミネーターは、新生児マウスの浅側頭（顔）静脈を可視化するために使用されました。私たちは、浅側頭静脈にMCMVまたは蛍光マイクロビーズの50μLを注入しました。脳を異なる時点注射後に回収しました。 MCMVゲノムは、in situハイブリダイゼーション法において使用して検出しました。組換えMCMV粒子を発現する蛍光マイクロビーズまたは緑色蛍光タンパク質を蛍光顕微鏡で観察しました。これらの技術は、脳炎の病因を研究するために、多くの他の病原体にも適用することができます。

ウイルス性脳炎の病因の研究では、感染症法が重要です。 ICV経路が髄膜および脈絡叢に達し、クモ膜下腔を通してCSFを介して拡散する急性感染を表しながら血行性経路は、脳の血管内皮細胞と周皮細胞の急性感染を表します。 MCMVゲノム及びM32-EGFP-MCMV粒子または蛍光マイクロビーズの直接観察を検出するインサイチュハイブリダイゼーション急性脳炎中の粒子...

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Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.

新生児の脳へのウイルス粒子と蛍光マイクロビーズの脳室内および血管内注入

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the ...

intracerebroventricular-intravascular-injection-viral-particles

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.3K ビュー.  Hamamatsu University School of Medicine. Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization. 

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Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific subsets of cells in different brain regions both in vivo and in brain sections. Unlike the injection of fluorescent dyes, viral labeling offers targeting of individual cell types and is less expensive and time consuming than establishing transgenic mouse lines. In this technique, an adeno-associated viral (AAV) vector is injected intracranially using stereotaxic coordinates, a micropipette and an automated pump for precise delivery of AAV to the desired area with minimal damage to the surrounding tissue. Injection parameters can be tailored to individual experiments by adjusting the animal age at injection, injection location, volume of injection, rate of injection, AAV serotype and the promoter driving gene expression. Depending on the conditions chosen, virally-induced transgene expression can allow visualization of groups of cells, individual cells or fine cellular processes, down to the level of dendritic spines. The experiment shown here depicts an injection of double-stranded AAV expressing green fluorescent protein for the labeling of neurons and glia in the mouse primary visual cortex.

Here we present the intracranial injection of AAV vectors for fluorescent labeling of neurons and glia in the visual cortex.

アデノ随伴ウイルスベクターの頭蓋内注射

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

神経科学

Delivery of Therapeutic Agents Through Intracerebroventricular (ICV) and Intravenous (IV) Injection in Mice

Despite the protective role that blood brain barrier plays in shielding the brain, it limits the access to the central nervous system (CNS) which most often results in failure of potential therapeutics designed for neurodegenerative disorders 1,2. Neurodegenerative diseases such as Spinal Muscular Atrophy (SMA), in which the lower motor neurons are affected, can benefit greatly from introducing the therapeutic agents into the CNS. The purpose of this video is to demonstrate two different injection paradigms to deliver therapeutic materials into neonatal mice soon after birth. One of these methods is injecting directly into cerebral lateral ventricles (Intracerebroventricular) which results in delivery of materials into the CNS through the cerebrospinal fluid 3,4. The second method is a temporal vein injection (intravenous) that can introduce different therapeutics into the circulatory system, leading to systemic delivery including the CNS 5. Widespread transduction of the CNS is achievable if an appropriate viral vector and viral serotype is utilized. Visualization and utilization of the temporal vein for injection is feasible up to postnatal day 6. However, if the delivered material is intended to reach the CNS, these injections should take place while the blood brain barrier is more permeable due to its immature status, preferably prior to postnatal day 2. The fully developed blood brain barrier greatly limits the effectiveness of intravenous delivery. Both delivery systems are simple and effective once the surgical aptitude is achieved. They do not require any extensive surgical devices and can be performed by a single person. However, these techniques are not without challenges. The small size of postnatal day 2 pups and the subsequent small target areas can make the injections difficult to perform and initially challenging to replicate.

Delivery of Therapeutic Agents Through Intracerebroventricular ICV and Intravenous IV Injection in Mice

This article demonstrates two very different methods of injection: 1) into the brain (intracerebroventricular) and 2) systemic (intravenous) to introduce the therapeutic agents into the central nervous system of neonatal mice.

マウスの脳室内（ICV）と静脈（IV）注入による治療薬のデリバリー

Despite the protective role that blood brain barrier plays in shielding the brain, it limits the access to the central nervous system (CNS) which most ...

医学

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in vivo gene control of neocortical projection neuron morphology. This method is based on (1) in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors as "test" and "control" cells, (2) their co-transplantation into wild-type brains, and (3) paired morphometric evaluation of their neuronal derivatives. Specifically, E12.5 pallial precursors from panneuronal, genetically labeled donors, are employed for this purpose. They are engineered to take advantage of selected promoters and tetON/OFF technology, and they are free-hand transplanted into neonatal lateral ventricles. Later, upon immunofluorescence profiling of recipient brains, silhouettes of transplanted neurons are fed into NeurphologyJ open source software, their morphometric parameters are extracted, and average length and branching index are calculated. Compared to other methods, this one offers three main advantages: it permits achieving of fine control of transgene expression at affordable costs, it only requires basic surgical skills, and it provides statistically reliable results upon analysis of a limited number of animals. Because of its design, however, it is not adequate to address non cell-autonomous control of neuroarchitecture. Moreover, it should be preferably used to investigate neurite morphology control after completion of neuronal migration. In its present formulation, this method is exquisitely tuned to investigate gene control of glutamatergic neocortical neuron architecture. Taking advantage of transgenic lines expressing EGFP in other specific neural cell types, it can be re-purposed to address gene control of their architecture.

Based on in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors, their co-transplantation into wild-type brains and paired morphometric evaluation of "test" and "control" derivatives, this method allows accurate modeling of in vivo gene control of neocortical neuron morphology in a simple and affordable way.

生化神経建築研究における工学的神経前駆体の脳内移植

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

遺伝学

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal infection, the virus can infect and replicate in the developing brain, which may induce severe neurological damage, including deafness and mental retardation. Despite the potential severity of the symptoms, the therapeutic options are limited by the unavailability of a vaccine and the absence of a specific antiviral therapy. Furthermore, a precise description of the molecular events occurring during infection of the central nervous system (CNS) is still lacking since observations mostly derive from the autopsy of infected children. Several animal models, such as rhesus macaque CMV, have been developed and provided important insights into CMV pathogenesis in the CNS. However, despite its evolutionary proximity with humans, this model was limited by the intracranial inoculation procedure used to infect the animals and consistently induce CNS infection. Furthermore, ethical considerations have promoted the development of alternative models, among which neonatal infection of newborn mice with mouse cytomegalovirus (MCMV) has recently led to significant advances. For instance, it was reported that intraperitoneal injection of MCMV to Balb/c neonates leads to infection of neurons and glial cells in specific areas of the brain. These findings suggested that experimental inoculation of mice might recapitulate the deficits induced by HCMV infection in children. Nevertheless, a dynamic analysis of MCMV infection of neonates is difficult to perform because classical methodology requires the sacrifice of a significant number of animals at different time points to analyze the viral burden and/or immune-related parameters. To circumvent this bottleneck and to enable future investigations of rare mutant animals, we applied in vivo imaging technology to perform a time-course analysis of the viral dissemination in the brain upon peripheral injection of a recombinant MCMV expressing luciferase to C57Bl/6 neonates.

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV) infection of neonates represents an important cause of mental retardation, yet the molecular events leading to virus-induced pathogenesis are still poorly understood. To investigate the dynamics of brain infection, we adapted whole-animal in vivo imaging to perform time-course analysis of neonates infected with a luciferase-recombinant virus.

活用<em生体内で&gt;</em新生児の実験マウスサイトメガロウイルス感染の進行を監視する&gt;イメージング

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

免疫・感染学

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

によって胚および成体神経幹細胞の拡大<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーションまたはウイルス定位注射

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

永続かつ広範な神経伝達のための新生児マウス脳の脳室内ウイルス注射

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly and additional brain abnormalities. However, the mechanism underlying the pathogenesis of ZIKV in the developing brain remains unclear. Intracerebral surgical methods are frequently used in neuroscience research to address questions about both normal and abnormal brain development and brain function. This protocol utilizes classical surgical techniques and describes methods that allow one to model ZIKV-associated human neurological disease in the mouse nervous system. While direct brain inoculation does not model the normal mode of virus transmission, the method allows investigators to ask targeted questions concerning the consequence after ZIKV infection of the developing brain. This protocol describes embryonic, neonatal, and adult stages of intraventricular inoculation of ZIKV. Once mastered, this method can become a straightforward and reproducible technique that only takes a few hours to perform.

Here we describe a method for establishing a model of Zika virus-induced microcephaly in mouse. This protocol includes methods for embryonic, neonatal, and adult-stage intracerebral inoculation of the Zika virus.

脳内注入戦略を使用してジカ ウイルス性神経疾患のマウスモデルの確立: 胎生期、新生児、およびアダルト

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.

新生児マウスにおける静脈注射

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are ...

生物学

新生児マウスに髄腔内注射を実施するための包括的なプロトコル

Intrathecal Injection of Newborn Mouse for Genome Editing and Drug Delivery

Intrathecal injection is a commonly employed procedure in both pediatric and adult clinics, serving as an effective means to administer medications and treatments. By directly delivering medications and treatments into the cerebrospinal fluid of the central nervous system, this method achieves higher localized drug concentrations while reducing systemic side-effects compared to other routes such as intravenous, subcutaneous, or intramuscular injections. Its importance extends beyond clinical settings, as intrathecal injection plays a vital role in preclinical studies focused on treating neurogenetic disorders in rodents and other large animals, including non-human primates. However, despite its widespread application, intrathecal injection in young, particularly neonatal pups, poses significant technical challenges due to their small size and fragile nature. Successful and reliable administration of intrathecal injections in newborn mice requires meticulous attention to detail and careful consideration of various factors. Thus, there is a crucial need for a standardized protocol that not only provides instructions but also highlights key technical considerations and good laboratory practices to ensure procedural consistency, as well as the safety and welfare of the animals.
To address this unmet need, we present a detailed and comprehensive protocol for performing intrathecal injections specifically in newborn pups on postnatal day 1 (P1). By following the step-by-step instructions, researchers can confidently perform intrathecal injections in neonatal pups, enabling the accurate delivery of drugs, antisense oligos, and viruses for gene replacement or genome editing-based treatments. Furthermore, the importance of adhering to good laboratory practices is emphasized to maintain the well-being of animals and ensure reliable experimental outcomes. This protocol aims to address the technical challenges associated with intrathecal injections in neonatal mice, ultimately facilitating advances in the field of neurogenetic research that aims to develop potential therapeutic interventions.

著者スポットライト:髄腔内注射 – 新生児マウスの脳における遺伝子編集の有効性をテストするための効率的で信頼性の高い送達方法

The present protocol outlines step-by-step instructions for performing intrathecal injections in neonatal mice for gene editing and drug delivery.

ゲノム編集とドラッグデリバリーのための新生児マウスの髄腔内注射

Intrathecal injection is a commonly employed procedure in both pediatric and adult clinics, serving as an effective means to administer medications and ...

新生児の脳へのウイルス粒子と蛍光マイクロビーズの脳室内および血管内注入

要約

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この動画の章

アデノ随伴ウイルスベクターの頭蓋内注射

マウスの脳室内（ICV）と静脈（IV）注入による治療薬のデリバリー

生化神経建築研究における工学的神経前駆体の脳内移植

活用

によって胚および成体神経幹細胞の拡大

永続かつ広範な神経伝達のための新生児マウス脳の脳室内ウイルス注射

脳内注入戦略を使用してジカウイルス性神経疾患のマウスモデルの確立: 胎生期、新生児、およびアダルト

新生児マウスにおける静脈注射

ゲノム編集とドラッグデリバリーのための新生児マウスの髄腔内注射

ゲノム編集とドラッグデリバリーのための新生児マウスの髄腔内注射

新生児の脳へのウイルス粒子と蛍光マイクロビーズの脳室内および血管内注入

要約

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アデノ随伴ウイルスベクターの頭蓋内注射

マウスの脳室内（ICV）と静脈（IV）注入による治療薬のデリバリー

生化神経建築研究における工学的神経前駆体の脳内移植

活用

によって胚および成体神経幹細胞の拡大

永続かつ広範な神経伝達のための新生児マウス脳の脳室内ウイルス注射

脳内注入戦略を使用してジカ ウイルス性神経疾患のマウスモデルの確立: 胎生期、新生児、およびアダルト

新生児マウスにおける静脈注射

ゲノム編集とドラッグデリバリーのための新生児マウスの髄腔内注射

ゲノム編集とドラッグデリバリーのための新生児マウスの髄腔内注射

脳内注入戦略を使用してジカウイルス性神経疾患のマウスモデルの確立: 胎生期、新生児、およびアダルト