Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Konvektions-verstärkte Abgabe bei kleinen Nagetieren mit einem Step-Katheter-System für die einstellbare gleichmäßige Perfusion von Zielhirnregionen durchzuführen. Der Vorteil der konvektionsverstärkten Abgabe ist, dass sie die Abgabe von Substanzen in den Bereich von Interesse ermöglicht, die die Blut-Hirn-Schranke mit wenig Gewebeschäden oder Reflux umgehen. Diese Technik ist in erster Linie nützlich für die Lieferung von therapeutischen Substanzen wie Antikörper in das Gehirn.
Und kann daher verwendet werden, um viele neurologische Erkrankungen zu zielen. Demonstriert wird das Verfahren von Michal Beffinger, einem Post-Doc aus meinem Labor. Beginnen Sie mit dem Schneiden eines Stücks geschmolzener Kieselsäurekapillarrohre mit einem Innendurchmesser von 0,1 Millimetern und einer Wandstärke von 0,325 Millimetern auf eine Länge von 30 Millimetern.
Nach der Untersuchung der Schläuche auf Risse verwenden Sie eine Mikroschmiede, um die Enden zu polieren, um sicherzustellen, dass die Rohröffnungen eine glatte Oberfläche haben. Als nächstes montieren Sie eine 27-Spur-Nadel auf eine 10-Mikro-Liter-Spritze und legen Sie die Spritze in einen stereotaktischen Roboter. Verwenden Sie den Roboter, um die Spritze über eine harte Oberfläche zu bewegen und berühren Sie die Oberfläche mit der Nadelspitze.
Nach dem Betrachten dieser Position heben Sie die Nadel, um die Platzierung der geschmolzenen Kieselsäure Kapillare innerhalb der Nadel zu ermöglichen, so dass 20 Millimeter der Kapillare aus der Nadel herausragt. Verwenden Sie eine Pipette, um zwei Mikroliter hochviskosen Cyanoacrylatklebers gleichmäßig über die Kapillare zu verteilen, beginnend mit der Metallnadel und der Veredelung von zehn Millimetern über dem unteren Ende der Kapillare. Verwenden Sie den stereotaktischen Roboter, um die Metallnadel zu senken, bis die Spitze der Nadel einen Millimeter über der Referenzoberfläche liegt, um die geschmolzene Kieselsäurekapillare in der Metallnadel zu fixieren, die einen Millimeter Schritt von der Spitze der Metallnadel bildet.
Entfernen Sie überschüssige Leimbildung am Ende der Metallnadel, um das Anpflanzen des Katheterschritts zu vermeiden. Überprüfen Sie die Spitze unter dem Mikroskop, um zu bestätigen, dass der gesamte überschüssige Kleber entfernt wurde. Warten Sie dann 15 Minuten, bis der Kleber aushärtet und entfernen Sie die Spritze mit dem Katheter aus dem Roboter.
Für Schrittkathetertests verfestigte 0,6%Agarose-Gel in 20 mal 20 Millimeter Blöcke und befüllt die Schrittkatheterspritze manuell mit 10 Mikrolitergefilterter 0,4%Trypan-Blaulösung. Geben Sie mit dem stereotaktischen Roboter einen Mikroliter Farbstoff mit 0,2 Mikroliter pro Minute aus, um die Abdichtung des Katheterswährend während des Fixierungsvorgangs zu bewerten. Die Trypan-Blaulösung sollte nur auf der Spitze des Katheters sichtbar sein.
Wischen Sie den Farbstoff mit einem Papiergewebe ab und legen Sie einen Agarose-Block in den stereotaktischen Roboter. Kalibrieren Sie den Roboter sagte, dass die Spitze des Katheters auf die Oberfläche des Agarose-Blocks verwiesen wird. Legen Sie eine Proportionssequenz der Injektionsvolumina gemäß dem spezifischen Versuchsplan fest.
Um die Lösung in das murine Caudate Putamen zu injizieren, stellen Sie die Injektion auf einen Millimeter frontal und eineinhalb bis zwei Millimeter seitlich aus Bregma-Position in einer Tiefe von 3,5 Millimetern. Wenn die Nadel in Position ist, starten Sie die Konvektion verbesserte Abgabeverfahren und injizieren fünf Mikroliter Trypan blau Lösung in den Agarose-Block. Bewerten Sie die Form der Trypanen-Blauen Wolke in der Agarose und mögliche Leckagen entlang des Kathetertraktes.
Kein größerer Rücklauf über die Spitze der Metallnadel sollte sichtbar sein. Nach der Injektion den Katheter für zwei Minuten an Ort und Stelle lassen, bevor Sie die Nadel mit einem Millimeter pro Minute zurückziehen, um eine ordnungsgemäße Dispersion der Flüssigkeit in das Gehirn und die Abdichtung des Injektionstraktes während der Entfernung zu gewährleisten. Legen Sie einen neuen Agarose-Block in den Roboter und starten Sie eine zweite Injektion von einem Mikroliter bei 0,2 Mikroliter pro Minute, um die Verstopfung des Katheters innerhalb der Agarose zu beurteilen.
Das Trypanblau sollte unmittelbar nach Beginn der Injektion wieder eine Wolke von der Spitze des Katheters bilden. Bewerten Sie dann, ob das Restvolumen in der Spritze 3 Mikroliter entspricht, da Abweichungen auf ein Auslaufen von Flüssigkeit durch die Kathetermontage oder den Spritzenkolben hindeuten könnten. Für Antikörper-Injektion in das murine Striatum bestätigen einen Mangel an Reaktion auf die Haut kneifen in einer anästhesierten Maus und rasieren den Kopf mit einem Haarschneider.
Desinfizieren Sie die Haut mit Wattestäbchen, die in Jodlösung getränkt sind. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen 10-Millimeter-Hautschnitt entlang der Schädel-Mittellinie zu machen, der auf Augenhöhe endet. Fixieren Sie die Maus im stereotaktischen Rahmen mit der Nasenklammer und Ohrleisten, wobei darauf geachtet wird, dass die Schädeloberfläche horizontal und fest gesichert ist.
Legen Sie die Spritze in den stereotaktischen Roboter und synchronisieren Sie den Bohrer mit der Spitze des Katheters auf einem Referenzpunkt. Verwenden Sie Zangen, um die Haut zurückzuziehen und Bregma auf der Schädeloberfläche zu lokalisieren. Referenzbregma in der Software mit der Spitze des Bohrers und bewegen Sie den Bohrer auf einen Millimeter frontal und zwei Millimeter seitlich aus Bregma-Position.
Bohren Sie ein Gratloch, wobei darauf zu achten ist, dass die Dura mater nicht beschädigt wird, und bewegen Sie die Spritze über das Bohrloch. Geben Sie 0,5 bis einen Mikroliter aus der Spritze, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen im Katheter zurückbleiben. Starten Sie die Konvektion verbesserte Lieferung wie gezeigt, beobachten Sie die Schädeloberfläche für alle Spuren von Flüssigkeit Rückfluss aus dem Injektionspunkt.
Am Ende der Lieferung und Katheterentfernung beginnen Sie die Einspritzpumpe bei 0,2 Mikroliter pro Minute, um nach Beweisen für katheter verstopfung während der Injektion zu überprüfen. Wenn keine Verstopfung aufgetreten ist, sollte sofort ein Tröpfchen der Injektionsmischung von der Katheterspitze aus beobachtet werden. In diesem Bild einer Wolke von Trypanblau, die sich nach der Injektion eines Mikroliters Farbstoff mit 0,5 Mikroliterpro Minute mit einem konvektionsverstärkten Katheter bildet, wie gezeigt, war kein Rückfluss entlang des Nadeltraktes zu Beginn des Katheterschritts sichtbar.
Und die dispergierte Wolke bildete eine gewünschte kugelförmige Form. In diesem Bild mit einer stumpfen Endnadel konnte jedoch ein signifikanter Reflux beobachtet werden. Insbesondere, Konvektion verbesserte Lieferung ermöglicht die Durchblutung von großen Volumina in das murine Gehirn in einer einheitlichen und weniger gewebeschädigenden Weise im Vergleich zu herkömmlichen Injektion.
Bei beiden Lieferarten gibt es ein typisches Verteilungsprofil von Antikörpern und Dextranpartikeln über dem Corpus callosum. Das Dispersionsprofil des injizierten Antikörpers ist jedoch diffuser als bei der hochmolekularen Dextran nach konvektionserhöhter Abgabe beobachtet wird, was Unterschiede in der Verteilung zwischen verschiedenen Infusaten veranschaulicht. Da der Katheter während der Gehirninfusion möglicherweise verstopfen kann, ist es wichtig, ihn sofort danach zu überprüfen, indem man langsam ein kleines Volumen infusate ausgibt.
Dieses Verfahren kann als eine Möglichkeit dienen, pharmakologisch aktive Verbindungen an das Gehirn zu liefern und sollte von einer genauen Überwachung der Krankheitssymptome und erwarteten Nebenwirkungen gefolgt werden. Diese Technik ermöglicht die Infusion einer präzisen Hirnregion mit Therapeutika einschließlich Antikörpern und eröffnet neue Möglichkeiten für die Entwicklung von gezielten Therapien des zentralen Nervensystems.
