يمكن استخدام هذا البروتوكول لإجراء التسليم المعزز بالتحميل الحراري في القوارض الصغيرة باستخدام نظام قسطرة خطوة للضخ الموحد القابل للتعديل لمناطق الدماغ المستهدفة. ميزة التسليم المعزز الحراري هي أنه يسمح بتسليم المواد إلى المنطقة ذات الاهتمام متجاوزة حاجز الدم في الدماغ مع تلف الأنسجة أو الجزر القليل. هذه التقنية مفيدة في المقام الأول لتوصيل المواد العلاجية مثل الأجسام المضادة في الدماغ.
ويمكن بالتالي أن تستخدم لاستهداف العديد من الحالات العصبية. إثبات الإجراء سيكون (ميشال بيفنجر) طبيب ما بعد الدكتوراه من مختبري تبدأ بقطع قطعة من أنابيب الشعيرية السيليكا تنصهر مع القطر الداخلي من 0.1 ملليمتر وسمك الجدار من 0.325 ملليمتر إلى طول 30 ملليمتر.
بعد فحص أنابيب للشقوق استخدام microforge لتسخين نهايات لضمان فتحات الأنابيب لها سطح أملس. المقبل, تحميل إبرة 27 قياس على حقنة 10 ميكرو لتر ووضع الحقنة في الروبوت stereotactic. استخدام الروبوت لتحريك حقنة على سطح صلب ولمس السطح مع طرف إبرة.
بعد الإشارة إلى هذا الموقف رفع الإبرة لتمكين وضع الشعيرية السيليكا تنصهر داخل الإبرة بحيث 20 ملليمتر من شعري يبرز من الإبرة. استخدام ماصة لنشر بالتساوي اثنين من microliters من مادة سياناوكوريلات عالية اللزوجة على مشابع شعرية بدءا من الإبرة المعدنية والانتهاء من عشرة ملليمترات فوق الطرف السفلي من الشعرية. استخدم الروبوت المجسم لخفض الإبرة المعدنية حتى تكون طرف الإبرة ملليمتر واحد فوق السطح المرجعي لإصلاح الشعيرية السيليكا المُندمجة في الإبرة المعدنية التي تشكل خطوة واحدة من طرف الإبرة المعدنية.
إزالة أي الغراء الزائدة تشكيل في نهاية الإبرة المعدنية لتجنب زرع خطوة القسطرة. تحقق من طرف تحت المجهر للتأكد من أن جميع الغراء الزائد قد أزيلت. ثم انتظر 15 دقيقة حتى يصلب الغراء وإزالة الحقنة مع القسطرة من الروبوت.
لخطوة القسطرة اختبار قطع توطدت 0.6٪ agarose هلام في 20 كتل من قبل 20 ملليمتر وملء يدويا حقنة قسطرة خطوة مع 10 ميكرولترات من 0.4٪ محلول أزرق trypan. باستخدام الروبوت المجسم، الاستغناء عن ميكرولتر واحد من الصبغة في 0.2 ميكرو لتر في الدقيقة لتقييم ختم خطوة القسطرة أثناء إجراء التثبيت. يجب أن يكون حل تريبان الأزرق مرئيًا فقط على طرف القسطرة.
مسح بعيدا صبغة مع نسيج الورق ووضع كتلة agarose في الروبوت stereotactic. معايرة الروبوت قال أن يتم الرجوع إلى غيض من القسطرة ضد سطح كتلة agarose. تعيين تسلسل نسبة من وحدات تخزين الحقن وفقا لخطة تجريبية محددة.
لحقن الحل في putamen مورين caudate، تعيين الحقن إلى جبهة ملليمتر واحد واحد ونصف إلى اثنين ملليمترات الجانبي من موقف بريما على عمق 3.5 ملليمتر. عندما الإبرة في موقف بدء إجراء التسليم المعزز الحمل الحراري وحقن خمسة ميكرولترات من محلول تريبان الأزرق في كتلة agarose. تقييم شكل سحابة تريبان الزرقاء في agarose والتسرب المحتمل على طول القناة القسطرة.
لا ينبغي أن يكون أي تدفق خلفي كبير على طرف الإبرة المعدنية مرئيًا. بعد الحقن ترك القسطرة في مكان لمدة دقيقتين قبل سحب الإبرة في ملليمتر واحد في الدقيقة لضمان التشتت السليم للسوائل في الدماغ وختم من المسالك الحقن أثناء عملية الإزالة. ضع كتلة agarose جديدة في الروبوت وابدأ حقنة ثانية من ميكرولتر واحد في 0.2 ميكرو لتر في الدقيقة لتقييم انسداد القسطرة داخل agarose.
وينبغي أن تكون مرة أخرى الأزرق trypan سحابة من غيض من القسطرة مباشرة بعد بدء الحقن. ثم تقييم ما إذا كان حجم بقايا في حقنة يتوافق مع 3 ميكرولترات كما قد تشير أي اختلافات تسرب السوائل من خلال القسطرة تركيب أو المكبس حقنة. لحقن الأجسام المضادة في المخطط مورين تأكيد عدم وجود استجابة لقرصة الجلد في ماوس تخدير وحلق الرأس مع تشذيب الشعر.
تطهير الجلد مع مسحات القطن غارقة في محلول اليود. استخدم مشرطًا لعمل شق جلدي 10 ملليمترات على طول خط الوسط القحفي على مستوى العين. إصلاح الماوس في إطار stereotactic باستخدام المشبك الأنف والأذن القضبان، مع الحرص على أن سطح الجمجمة هو أفقي ومؤمن بإحكام.
ضع الحقنة في الروبوت المجسم ومزامنة بت الحفر مع طرف القسطرة على نقطة مرجعية. استخدام ملقط لسحب الجلد وتوطين bregma على سطح الجمجمة. bregma المرجعية في البرنامج باستخدام غيض من بت الحفر ونقل الحفر إلى واحد ملليمتر الأمامية واثنين ملليمتر الجانبي من موقف bregma.
حفر حفرة دبر مع الحرص على عدم تلف ماطر دورا ونقل الحقنة فوق حفرة دبر. الاستغناء 0.5 إلى ميكرولتر واحد من الحقنة لضمان عدم ترك فقاعات الهواء في القسطرة. بدء الحمل الحراري تعزيز التسليم كما هو موضح، ومراقبة سطح الجمجمة لأي آثار تدفق السوائل من بقعة الحقن.
في نهاية عملية التسليم وإزالة القسطرة بدء ضخ حقن في 0.2 ميكرو لتر في الدقيقة للتحقق من وجود أدلة على انسداد القسطرة أثناء الحقن. إذا لم يحدث انسداد ينبغي أن يلاحظ على الفور قطرة من مزيج الحقن القادمة من طرف القسطرة. في هذه الصورة من سحابة من تريبان الزرقاء تشكيل بعد حقن واحد ميكرولتر من الصبغة في 0.5 ميكرو لتر في الدقيقة الواحدة باستخدام القسطرة المعززة الحراري كما هو موضح، لم يكن أي ارتجاع على طول القناة الإبر مرئية على مدى بداية خطوة القسطرة.
وشكلت السحابة المشتتة شكلا كرويا مرغوبا فيه. في هذه الصورة باستخدام إبرة نهاية حادة ومع ذلك، يمكن ملاحظة ارتجاع كبير. وتجدر الإشارة إلى أن الحمل الحراري المعزز يمكن من ضخ كميات كبيرة في الدماغ مورين بطريقة موحدة وأقل ضررا الأنسجة مقارنة بالحقن التقليدي.
في كلا النوعين من التسليم هناك ملف تعريف توزيع نموذجي للجسم المضاد وجزيئات ديكستران على الكسوة الإحضارية. ومع ذلك ، فإن ملف تشتت الأجسام المضادة عن طريق الحقن أكثر انتشارًا مما لوحظ لـ dextran الوزن الجزيئي العالي بعد التسليم المعزز الحراري ، مما يجسد الاختلافات في التوزيع بين الضخات المختلفة. كما القسطرة يمكن أن تسد يحتمل خلال ضخ الدماغ, من المهم للتحقق من ذلك مباشرة بعد عن طريق الاستغناء ببطء حجم صغير من التسريب.
يمكن أن يكون هذا الإجراء بمثابة وسيلة لتقديم المركبات النشطة دوائيًا إلى الدماغ ويجب أن يتبعها رصد وثيق لأعراض المرض والآثار الجانبية المتوقعة. هذه التقنية تمكن من ضخ منطقة الدماغ دقيقة مع العلاجات بما في ذلك الأجسام المضادة، وفتح إمكانيات جديدة لتطوير العلاجات المستهدفة الجهاز العصبي المركزي.
