著者は彼らのサポートは、s. a. ミュラー原稿、A. Fecteau-ルフェーブルの EM、リカルド ・ Adaixo、フランク ・ テクニカル サポートを慎重に読み、重要な議論のためのバーゼル大学の Biozentrum のワーク ショップを感謝したいです。膜タンパク質のレーマンは、彼の刺激的な会話のための名誉の大学バーゼル、A. エンゲル (C チナ、Biozentrum、バーゼル大学からのすべて) のサンプルをテストします。テスト サンプルは、p. Ringler、m. a. によって提供された親切マヒマヒ、t. Schwede (Biozentrum、バーゼルの大学)、P. Leiman (スイス連邦工科大学生物物理学、構造生物学研究室)、r. ディアス アバロス (構造生物学センター、米国ニューヨーク)。プロジェクトは、スイスのナノサイエンスの研究所 (SNI プロジェクト P1401 ARGOVIA プロジェクト MiPIS) とスイスの全米科学財団 (SNF、プロジェクト 200021_162521) によって支持されました。

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著者トマス ・ ブラウン、ヘニング スタールバーグ ステファン A. アーノルド宣言次の競合する金利: PCT の特許出願の一部である cryoWriter コンセプト/EP2015/065398 と EP16194230。

'CryoWriter' 楽器との NS- と Cryoem nL サイズ総サンプル ボリュームからサンプル グリッドを準備し、完全に古典的な紙しみが付くことのステップを避けるために必要なプロトコルが表示されます。マイクロ流体原理とマイクロ システムはこれを可能にする cryoWriter に結合されます。
我々 の経験では、本稿で提示された小型のメソッドを使用する場合、EM グリッドの準備のためのパラメーター空間が古典的な方法と厳密なユーザー制御の下でより大きいことを示しています。重要なは、増加の再現性の場合、サンプル バッファー システムは、実際の実験を実行する前にパラメーターの最適値を決定するためのすぐに利用できるテスト蛋白質で補完済み画面することが可能になります。これは最低限絶対に目的の標本の消費を保持し、強くお勧め。両方の NS-70S グリッドの準備のための重要なステップは、: (i) プライミング ポンプ システムのサブ ナノリットル ボリューム調剤、システム液体 (水) 脱、バブルの無料。(グロー放電のプラズマ クリーニングのステップ; ii) 正確な制御EM グリッドの表面特性は、再現可能な結果を得るのために重要です。(iii) サンプルをご利用いただけます。、例えば、ns での調節に必要な時間は、バッファーの種類や塩分濃度 (図 3)、およびマイクロキャピ ラリー24のノズル形状によって異なります。(iv) の定量 EM; NS EM 準備蒸発コーヒー リングの効果は、NS EM 製剤の定量分析を禁止することができ、DP ステージによって制御される遅い蒸発によって抑制する必要があります。
提示されたグリッドの準備方法のさまざまな側面は、特定のサンプルの汎用プロトコルの開発をできるように自由に結合できます。典型的な例であるグリッドに向けて Cryoem; 前にエアコン ステップによる高解像度 EM、例えばグリセロールを阻止する物質の除去グリッドを用意する前にエアコンの配位子などのメディエーター分子の導入または単一細胞ライセートで NS- または -70S (図 6) の検討。
マイクロ流体システムと示された方法で最小限のサンプル量の使用は完全に紙しみが付くことのステップの必要性を削除します。これは、タンパク質、可能性のある不要なイオン サンプルの汚染および本質的に大規模なサンプル損失につながる過酷な治療は、あぶらとり紙ため大きな利点です。その一方で、cryoWriter が使用される場合、Cryoem 試料は古典的な方法で準備されるときに、薄いサンプルの膜の気水界面による潜在的影響は避けられない。Cryoem に適したグリッドは、サンプル アプリケーションとガラス化 (データは示されていない) 間未満 0.2 秒待機時間で用意できます。ただし、タンパク質は、拡散によって数ナノ秒でナノメートルの少数の tenths を旅行、あるまだ数回 100 nm 厚のサンプル フィルムの水面に衝突するそれらのための十分な時間。ただし、空気-水界面に付着蛋白質の量これらの短時間ギャップ大幅削減されるだろうし、タンパク質変性を防ぐ可能性がありますまたは粒子の方向を制限します。水空気インターフェイスから機密性の高いタンパク質を保護するかもしれないもう一つの有望なアプローチは、低分子量界面活性物質によるサンプル フィルムをカバーすることです。これらの化合物は、グリッドの準備する前に cryoWriter でご利用いただけますステップによって急速に導入できます。マイクロ流体システムの表面に容積率は、cryoWriter の更なる制限サンプル潜在的マイクロキャピ ラリー表面に非特異的吸着が失われることし、粒子のカウントによって定量分析を妨げます。2 つの方法で問題に対処: 最初に、サンプルは、マイクロキャピ ラリー内で長い距離を移動しません。確かに、処理全体で先端部にキャピラリー ナノリットル サンプル ボリュームのままです。第二に、容積の比率に表面をさらに削減して第三に比較的大きな内径、例えば180 μ m microcapillaries を使用して、必要な場合に、microcapillaries の表面することができます簡単にパッシベーションなど、それらを扱うことによって。市販のポリリジン エタノール グリコール (PLL PEG)。
EM に使用されている単一粒子アプローチによるタンパク質の高分解能解析には、個々 のタンパク質粒子像の数百万に 100,000 だけ必要があります。これは、マイクロ流体技術が構造の調査のための十分な蛋白質の複合体を提供できることを意味します。最小セル量 (約 40,000 セル) からタンパク質複合体 (約 1 時間) の高速分離の小型免疫沈殿法は、以前28を開発されました。このメソッドは今、cryoWriter の小型サンプル準備段階に直接リンクされます。最終的な目標は、すべて 2 時間未満を必要とするタンパク質の超高速分離と Cryoem グリッド準備のための統合されたマイクロ パイプラインを開発します。さらに、図 6分量とサンプルの準備およびほぼ可逆エアコンとグリッドの準備の手順、cryoWriter を使用して達成のために必要な材料の量によって示されるようにそれを可能にする蛋白質を研究するには個々 の細胞の複合体。一緒に、小型免疫沈澱法と、cryoWriter は、我々 が最近熱衝撃実験24よう「単細胞 visual プロテオミクス」と呼ばれる新しいプロテオミクス手法の基盤を築きます。「Visual プロテオミクス」画像の解析に連動データ解析アルゴリズムは現在テスト中です。

ハードウェアと透過電子顕微鏡 (TEM) によるタンパク質複合体の構造解析のためのソフトウェアは、近年中に進んでいる超。強化した「解像度革命」1,2へ道舗装し、構造研究を根本的に変更します。革命開始クライオ電子顕微鏡 (Cryoem)3,4、放射線感受性を短縮し、予防しながら生理条件に近いの下で生物学的試料の調製を可能の出現で透過電子顕微鏡5の高真空での蒸発をサンプル。次の年では、増分の技術進歩は達成可能な解像度を徐々 に増加。これらの技術革新の間で電界放射銃6、7のアプリケーションより最近では、最尤法8,9などのデータ解析のアルゴリズムを改善します。直接電子検出器カメラ10、11,12,13、ムービー モード イメージングおよびそれに伴うソフトウェアの開発14,15,16,17日 (レビューを参照してくださいチェン、Grigorieff、らの単粒子解析による生体試料の原子分解能を達成するために必要な最終的なブレークスルーを提供18). Cryoem の重要性は最近開拓者の 3 つの化学のノーベル賞の受賞によって認識されました。
電子顕微鏡による生体試料を画像にサンプル (その後「グリッドの準備」と呼ばれる) と EM グリッドを読み込むためのメソッドする必要があります結果サンプル層 (i) 十分に薄いことを確認 (< 100 nm) 散乱弾性によって広範なノイズを避けるため、または乗算するには電子、(ii) 電子顕微鏡の高真空に耐えるし、(iii) が放射線障害から、生体分子を保護します。2 つの主な方法は、これらの条件を満たすために使用される: 否定的な汚れ(NS)19,20プロシージャ (図 1A) 炭素薄膜フィルム サンプルを吸着、非晶質重金属の生体分子を埋め込むし、空気で乾燥するアセンブリを許可します。これはシンプルで簡単なと (その後、「サンプル グリッド」と呼ばれる) 読み込まれている EM グリッド簡単にして保存し時間の長期間にわたって保つことができる (一般に年).TEM、準備 NS による高コントラストを展示し、クライオ準備よりも高い電子線量を容認するが、解像度が約 20 Å。 Cryoem プロシージャ (図 1B) 採用ホーリーファイバー炭素をサポートに限定。試料溶液の薄膜が穴にまたがってスパンされてし、EM グリッドは、寒剤、-150 ° C 以下それを急速に冷却するため、通常液化エタンに陥って結果は非晶質、ビトリファイド、サポートする穴のソリューションの 50 に 100 nm 厚のフィルムです。この薄い非晶質膜は電子顕微鏡で高真空に耐えるし、理想的なケースで、自然な状態での生物学的構造を保持します。プロシージャでは、生体試料の高解像度イメージを作成することができます。ただし、グリッドのサンプル保たれなければならない温度より低い温度で-150 ° C 失透を避けるためにすべての回で。それは低温ですが、コントラストのための比較的高い電子線量を使ってイメージ化されることし、信号対雑音比が低いにもかかわらず。したがって、コントラストを高める平均化技術を採用し、高解像度三次元 (3 D) 地図を再構築できるサンプルは、さまざまな角度からイメージを作成、提供。最もよく使用され、今の三次元再構成のための非常に成功したメソッドは単一の粒子のアプローチ。最近のレビューら18チェンを参照してください。
ネガティブ染色 TEM (NS EM) はスクリーニングと品質管理の重要なコントラストが必要な場合、またはサンプルの限られた量だけ利用可能な場合 (炭素膜への吸着は、一般的にサンプルを集中)。タンパク質立体構造の高解像度の 3 D 復元を目指した場合、単一粒子の低温電子顕微鏡がゴールド スタンダード方法です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig1.jpg"> 図 1: 原則の TEM グリッド準備とクラシック (パネル A、B) とマイクロ アプローチ (パネル C、D) の比較。A)古典的な NS エマージング グリッド準備: 約 3 μ L のサンプルが (その後、「NS EM グリッド」と呼ばれる) 連続炭素膜で覆われている EM グリッド上に手で戻 (i)。約 10 のためのインキュベーション後離れて薄い水膜に吸着した分子を残して側 (ii) から余分な液体を消し去るため s、ろ紙を使用します。重金属塩溶液、例えば20, 2% の酢酸ウランのタンパク質の培養後、s (iii) と再び液体がろ紙 (iv) を使用する側からしみが付くことによって削除されます。最後に、EM グリッドは、空気の乾燥に残っています。B)クラシック Cryoem グリッド準備: サンプルの約 3 μ L、ホーリーファイバーの炭素膜に手で戻します。薄いサンプル フィルムを形成するには、余分な液体が紙あぶらとり顔の片側または両側 (ii) からによって削除されます。最後に、グリッドが急速に液体エタン ガラス化 (iii) のために急落しました。C) cryoWriter セットアップを使用して NS エマージング グリッド準備: A 5 nL ボリューム (i) マイクロキャピ ラリーを使用してサンプル素材から吸気です。サンプルはエアコン、マイクロキャピ ラリー チップはエアコン解決、例えば2% 酢酸アンモニウムに没頭しています。イオンや小分子拡散 (ii) で交換されます。マイクロキャピ ラリーの寸法は、全体のプロセスが拡散駆動型であることを確認注意してください。タンパク質は塩イオンよりも多くの低い拡散定数し、24が大幅に失われない。最後に、サンプルはグリッド上に分配される、(iii) を乾燥します。D) cryoWriter 法を用いた低温エマージング グリッド準備の原則: ホーリーファイバーの炭素膜で覆われて、EM グリッドを温度制御プラットフォームの表面に置かれ、ピンセットで開催。プラットフォームの温度は、グリッド環境の露点温度からのオフセットで制御されます。サンプルを含むマイクロキャピ ラリー基準グリッドを移動、それはグリッドの上のいくつかのマイクロメートルまでのマイクロキャピ ラリーを下げます。スパイラル パターンでステージを移動しながらその後、サンプルのいくつかの nanoliters を調剤しそれから余分な液体は再吸気 (i)。EM グリッド プライミング後、マイクロキャピ ラリーを撤回、グリッドは、蒸発するためにサンプル量を制御できるように短時間の温度制御プラットフォーム (その後露点 (DP) のステージと呼ばれる)。凍結急落、グリッドは急速にピンセット (ii) を使用して、ステージから撤退、垂直方向の位置に 90 度反転および寒剤お風呂 (iii) (' ピック プランジ ' メカニズムとその後呼ばれる) に突入します。<a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
残念なことに、彼らが発明されたので NS と低温電子顕微鏡用グリッドの作製法が大幅に改善しないしています。現在の欠点は、高いサンプル消費量 (1 mg/mL のタンパク質の約 3 μ L) とサンプルの大量 (> 99%) を失った (図 1a, B)。さらに、低温電子顕微鏡用グリッドを準備するための古典的な方法は蛋白質のための過酷な手順: 最初に、それを含む、広範な顔に紙あぶらとりステップ (図 1B、ii) と、第二に、蛋白質は、空気-水界面にさらされています。21時間のかなりの量。ここでは、サンプルの前処理方法、試料グリッドと NS EM (図 1C) または 70S (図 1D) の後処理 (グリッドの乾燥またはガラス) が表示されます。"CryoWriter"と呼ばれる、社内構築されたセットアップ条件を吸引し、サンプル、回避紙完全にしみが付くことおよび薄いサンプルのための代替手段を提供することを分配する小型サンプル処理技術とマイクロ流体の原則を使用してください。CRYOEM。それは大幅サンプル消費を低減し、試料全体としてのユーザー コントロールを向上します。さらに、メソッドにより実験的応用;などの「単一のセルのビジュアル プロテオミクス」22,23,24,25と呼ばれる方法では個々 の細胞の生体成分の分離の準備。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Liquid handling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcapillary tip</td><td>New Objective</td><td>FS360-100-30-N-20</td><td>SilicaTips 30 &amp;micro;m tip ID, 100 &amp;micro;m ID , pk. 20</td></tr><tr><td></td><td></td><td>FS360-150-30-N-20</td><td>SilicaTips 30 &amp;micro;m tip ID, 150 &amp;micro;m ID , pk. 20</td></tr><tr><td>Conductive sleeve</td><td>New Objective</td><td>CONGAS-1&amp;nbsp;</td><td>Conductive Elastomer for HV contact, 12&quot; long</td></tr><tr><td>Fused silica tubing</td><td>BGB-Analytik</td><td>TSP-150375</td><td>TSP Standard FS Tubing, 150 &amp;micro;m ID, 363 &amp;micro;m OD, 5 meter</td></tr><tr><td>PressFit Connector</td><td>BGB-Analytik</td><td>2525LD</td><td>Deact. PressFit Connector 0.25 to 0.25 mm ID, pk. 25&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Syringe 10 &amp;micro;l</td><td>BGB-Analytik</td><td>HA-80001</td><td>Hamilton 1701 LT - Luer Tip (needle not included)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Syringe pump controller</td><td>Cetoni</td><td>A3921000093</td><td>neMESYS controller</td></tr><tr><td>Syringe pump dosing unit</td><td>Cetoni</td><td>A3921000095</td><td>neMESYS dosing unit</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Temperature control&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dew point sensor</td><td>Meltec</td><td>UFT75-AT</td><td>Humidity/Temperature sensor, dew point calculation, USB and embedded DLL</td></tr><tr><td>Temperature sensor</td><td>Sensorshop24.ch</td><td>LS7-PT1000-1.0-3L</td><td>Surface mountable temperature sensor Pt1000</td></tr><tr><td>Peltier controller</td><td>Cooltronic</td><td>TC2812&amp;nbsp;</td><td>PID temperature controller for activation of Peltier driven systems with constant voltage output</td></tr><tr><td>Peltier element</td><td>Distrelec.ch</td><td>PE-127-14-15-S</td><td>40x40 mm</td></tr><tr><td>Water-cooling block</td><td>-</td><td>-</td><td>Water cooling block for 40x40 mm peltier element, copper base</td></tr><tr><td>Water pump</td><td>Digitec.ch</td><td>294877</td><td>XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Black V4</td></tr><tr><td>Water heat exchanger block</td><td>-</td><td>-</td><td>Water heat exchanger block with 2 fans to cool down circulating water</td></tr><tr><td>Small water coolers</td><td>PCHC.ch</td><td>223050</td><td>Alphacool MCX ram copper edition 2 pcs</td></tr><tr><td>Small peltier elements</td><td>Distrelec.ch</td><td>PE-031-10-15-S</td><td>Laird 15x15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 &amp;deg;C, 2 pcs</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mechanics&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linear stage z-axis</td><td>Dyneos AG</td><td>M-404.2PD</td><td>High-load precision translational stage, 50 mm travel range, DC motor</td></tr><tr><td>Stage controller</td><td>Dyneos AG</td><td>C-863</td><td>Mercury Servo Controller</td></tr><tr><td>Microscope xy-axis stage</td><td>Prior Scientific</td><td>H117EIL5</td><td>Motorized stage for Zeiss Axiovert 200 inverted microscope</td></tr><tr><td>Small permanent magnets</td><td>Supermagnete</td><td>S-05-08-N</td><td>Rod magnet &amp;Oslash; 5 mm, height 8.47 mm, neodymium, N45, nickel-plated, pk. 10</td></tr><tr><td>Small electromagnet</td><td>Schramme</td><td>EG1025A02/110</td><td>Electromagnet 24V 220 N 150 N 2,5 W</td></tr><tr><td>Controller electromagnet</td><td>Conrad.ch</td><td>MST-1630.001 7</td><td>Electromagnet control PCB board</td></tr><tr><td>Solenoid hub</td><td>Distrelec.ch</td><td>HD8286-R-F-24V100%</td><td>Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W</td></tr><tr><td>Mini tweezers</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>0302-M5S-PS</td><td>Dumont Type 5 mini, super thin tips</td></tr><tr><td>Various optomechanical parts</td><td>Thorlabs</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Various mechanical parts</td><td>Workshop Biozentrum, University Basel</td><td>-</td><td>Custom designed adapter plates, holders, etc. see attached CAD files</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Optics&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser diode</td><td>Thorlabs</td><td>CPS780S</td><td>780 nm laser diode module 2.5 mW</td></tr><tr><td>Photo detector</td><td>Thorlabs</td><td>PDA100A-EC</td><td>Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mm2</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EM grids&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DURASIN FILM TEM</td><td>emsdiasum.com</td><td>DTF-03523</td><td>30 nm DuraSiN&amp;trade; silicon nitride membranes for TEM, pack of 5</td></tr><tr><td>Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffers / Neg. stain&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537&amp;nbsp;SIGMA</td><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td></tr><tr><td>NanoVan 2%</td><td>nanoprobes.com</td><td></td><td>Negative stain vanadium based</td></tr><tr><td>NanoW 2%</td><td>nanoprobes.com</td><td></td><td>Negative stain tungsten based</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>openBEB</td><td></td><td></td><td>The openBEB 2 framework is avaible upon request, version 3 will be downloadable</td></tr><tr><td>CryoWriter control software (openBEB plugin)</td><td></td><td>Avaible upon request, extra fees for 3rd party driver software might apply.</td><td></td></tr></tbody></table>

miniaturized sample preparation for transmission electron microscopy

最近の技術の進歩によりクライオ電子顕微鏡 (Cryoem) は急速に原子分解能するタンパク質複合体の構造解析のための標準的な方法となっています。ただし、蛋白質の分離技術と EM 試料作製法ボトルネックのまま。タンパク質の高分解能解析の単一粒子処理手法とマイクロ流体原則小型サンプルを作る EM アプローチでイメージを作成する必要があります個々 のタンパク質粒子の比較的小さい数 (数百万に 100,000)実現可能。
小型化、紙あぶらとり無料 EM グリッド法サンプル前処理、EM グリッド プライミングおよびサンプルのナノリットル ボリュームを消費するだけのポスト処理が表示されます。メソッドが調剤システムを使用して sub ナノリットル精度制御液体吸収と EM グリッド プライミング、プラットフォームと EM グリッドをピックアップ-・-プランジ-機構とサンプルの上の相対湿度を決定グリッド温度を制御します。ガラス化。Cryoem 温度制御ステージ上 EM グリッドに配置し、キャピラリーに試料を吸引します。キャピラリーの先端は、グリッド表面に近接して位置、サンプルにグリッドが読み込まれ、過剰は、マイクロキャピ ラリーに再吸引。その後、サンプル フィルムは安定し、若干結露点基準プラットフォーム温度のオフセットによって規制制御水蒸発による間伐です。特定の時点で急速に液体エタンのサンプル ガラス化のために発動を促された EM グリッドを転送する選択-プランジ機構がトリガーされます。サンプルご利用方法も、否定的な汚れ (NS) EM のナノリットル サイズ サンプル ボリュームを準備する利用できます。
方法論は大きくサンプル消費量を減らすし、従来で使用されるあぶらとり紙など蛋白質、潜在的に有害なアプローチを避けます。さらに、必要なサンプルのほんのわずかな量により高速サンプル エアコン、「visual プロテオミクス、」単一セル換散またはの定量分析のための「ロスレス」総試料との組み合わせなど、新規の実験的戦略複雑なサンプル。

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Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

楽器と透過型電子顕微鏡のためのナノリットル サイズ サンプル ボリュームの準備のためのメソッドが表示されます。これは蛋白質の大幅にサンプルの損失を削減し、単一細胞ライセート visual プロテオミクス解析を有効にするために持つことができます有害な結果を回避するため、必要な紙しみが付くことのステップはありません。

透過電子顕微鏡用小型サンプル準備

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

miniaturized-sample-preparation-for-transmission-electron-microscopy

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

19.5K ビュー.  University of Basel. 楽器と透過型電子顕微鏡のためのナノリットル サイズ サンプル ボリュームの準備のためのメソッドが表示されます。これは蛋白質の大幅にサンプルの損失を削減し、単一細胞ライセート visual プロテオミクス解析を有効にするために持つことができます有害な結果を回避するため、必要な紙しみが付くことのステップはありません。

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A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin sections of the specimen. Although preparing serial ultrathin sections is considered to be very difficult, it is rather easy if the proper method is used. In this paper, we show a step-by-step procedure for safely obtaining serial ultrathin sections of microorganisms. The key points of this method are: 1) to use the large part of the specimen and adjust the specimen surface and knife edge so that they are parallel to each other; 2) to cut serial sections in groups and avoid difficulty in separating sections using a pair of hair strands when retrieving a group of serial sections onto the slit grids; 3) to use a 'Section-holding loop' and avoid mixing up the order of the section groups; 4) to use a 'Water-surface-raising loop' and make sure the sections are positioned on the apex of the water and that they touch the grid first, in order to place them in the desired position on the grids; 5) to use the support film on an aluminum rack and make it easier to recover the sections on the grids and to avoid wrinkling of the support film; and 6) to use a staining tube and avoid accidentally breaking the support films with tweezers. This new method enables obtaining serial ultrathin sections without difficulty. The method makes it possible to analyze cell structures of microorganisms at high resolution in 3D, which cannot be achieved by using the automatic tape-collecting ultramicrotome method and serial block-face or focused ion beam scanning electron microscopy.

This study presents reliable and easy procedures for obtaining serial ultrathin sections of a microorganism without expensive equipment in transmission electron microscopy.

透過型電子顕微鏡における微生物の連続超薄切片を得る方法

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

工学

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been developed to solve structures of proteins and small molecules using standard electron cryo-microscopy (cryo-EM) equipment. In this way, small molecules, peptides, soluble proteins, and membrane proteins have recently been determined to high resolutions. Protocols are presented here for preparing grids of small-molecule pharmaceuticals using the drug carbamazepine as an example. Protocols for screening and collecting data are presented. Additional steps in the overall process, such as data integration, structure determination, and refinement are presented elsewhere. The time required to prepare the small-molecule grids is estimated to be less than 30 min.

Here, we describe the procedures developed in our laboratory for preparing powders of small molecule crystals for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments.

低分子の微小結晶電子回折

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

生化学

Sample Preparation and Experimental Design for In Situ Multi-Beam Transmission Electron Microscopy Irradiation Experiments

There is a need to understand materials exposed to overlapping extreme environments such as high temperature, radiation, or mechanical stress. When these stressors are combined there may be synergistic effects that enable unique microstructural evolution mechanisms to activate. Understanding of these mechanisms is necessary for the input and refinement of predictive models and critical for engineering of next generation materials. The basic physics and underlying mechanisms require advanced tools to be investigated. The in situ ion irradiation transmission electron microscope (I&#179;TEM) is designed to explore these principles.
To quantitatively probe the complex dynamic interactions in materials, careful preparation of samples and consideration of experimental design is required. Particular handling or preparation of samples can easily introduce damage or features that obfuscate the measurements. There is no one correct way to prepare a sample; however, many mistakes can be made. The most common errors and things to consider are highlighted within. The I&#179;TEM has many adjustable variables and a large potential experimental space, therefore it is best to design experiments with a specific scientific question or questions in mind.
Experiments have been performed on large number of sample geometries, material classes, and with many irradiation conditions. The following are a subset of examples that demonstrate unique in situ capabilities utilizing the I3TEM. Au nanoparticles prepared by drop casting have been used to investigate the effects of single ion strikes. Au thin films have been used in studies on the effects of multibeam irradiation on microstructure evolution. Zr films have been exposed to irradiation and mechanical tension to examine creep. Ag nanopillars were subjected to simultaneous high temperature, mechanical compression, and ion irradiation to study irradiation induced creep as well. These results impact fields including: structural materials, nuclear energy, energy storage, catalysis, and microelectronics in space environments.

Sample preparation techniques are outlined with specific considerations for in situ ion irradiation TEM experiments. Ion species, energy, and fluence are discussed with methods for how to select and compute them. Finally, procedures for conducting an experiment are described and accompanied by the representative results.

There is a need to understand materials exposed to overlapping extreme environments such as high temperature, radiation, or mechanical stress. When these ...

Optimizing Sample Preparation for Cryogenic Electron Microscopy

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native conditions, suspended in vitreous ice. This technique allows for the high-resolution visualization of proteins and other biomolecules without the need for crystallization, offering significant insights into their function and mechanism. Recent advancements in single-particle analysis, coupled with improved computational data processing, have made cryo-EM an indispensable tool in modern structural biology. Despite its growing adoption, cryo-EM faces persistent challenges that can limit its effectiveness, particularly uneven particle distribution. This issue often leads to poor resolution and reduced accuracy in reconstructed protein structures. This article outlines a simple, practical approach to address this challenge, using the small heat-shock protein from Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example. The method optimizes sample preparation to minimize preferential adsorption, ensuring more homogeneous particle distribution and higher-quality protein cryo-EM structures. This technique offers valuable guidance for researchers aiming to overcome similar challenges in structural studies.

This protocol presents a practical method using Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example to address uneven particle distribution through sample preparation optimization, providing a reference for researchers to efficiently elucidate macromolecular structures using cryogenic electron microscopy (cryo-EM).

極低温電子顕微鏡のためのサンプル調製の最適化

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native ...

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at the Drosophila NMJ enables researchers to acquire synaptic information, encompassing both quantitative data on synapse abundance and detailed insights into their morphology. However, the diffuse distribution and limited visual range of the TEM present challenges for the ultrastructural analysis. This study introduces an innovative and efficient sample preparation method that surpasses the conventional approach. The procedure begins by placing a metal mesh at the base of a flat-bottomed bottle or test tube, followed by positioning fixed larvae samples onto the mesh. An additional mesh is placed over the samples, ensuring that they are positioned between the two meshes. The fixed samples are thoroughly dehydrated and infiltrated before proceeding with the embedding procedure. Then embedding of the samples in epoxy resin is performed in a flat sheet manner, which allows for the preparation of muscles for positioning and sectioning. Benefiting from these steps, all the muscles of Drosophila larvae can be visualized under light microscopy, therey facilitating subsequent positioning and sectioning. Excess resin is removed after locating the 6th and 7th muscles of body segments A2 and A3. Serial ultra-thin sectioning of the 6th or 7th muscle is performed.

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

This report provides a new sample preparation procedure for visualizing neuromuscular junctions in Drosophila Larvae. This method is more effective in preventing the curling of the samples compared to the traditional method and is particularly useful for Drosophila neuromuscular junction ultrastructural analysis.

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部の透過型電子顕微鏡法のためのサンプル調製プロセスの最適化

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at ...

神経科学

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

TEM分析のための低細胞数とサンプル調製のための代替的アプローチ

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

生物学

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

走査型透過電子トモグラフィーにより太い生物学的サンプルの調製と観察

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

サンプル準備および透過電子顕微鏡によるエクソソームのイメージ投射

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

<meta charset="utf8"></head><body>TEM用のレチナールオルガノイドサンプル調製のための最適化されたプロトコール

Preparing Retinal Organoid Samples for Transmission Electron Microscopy

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) under specific conditions. Synapse development and maturation in ROs have been studied immunocytochemically and functionally. However, the direct evidence of the synaptic contact ultrastructure is limited, containing both special ribbon synapses and conventional chemical synapses. Transmission electron microscopy (TEM) is characterized by high resolution and a respectable history elucidating retinal development and synapse maturation in humans and various species. It is a powerful tool to explore synaptic structure in ROs and is widely used in the research field of ROs. Therefore, to better explore the structure of RO synaptic contacts at the nanoscale and obtain high-quality microscopic evidence, we developed a simple and repeatable method of RO TEM sample preparation. This paper describes the protocol, reagents used, and detailed steps, including RO fixation preparation, post fixation, embedding, and visualization.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:TEMを使用した成熟Retinalオルガノイドのシナプス超微細構造の解析

This protocol provides an optimized and elaborate preparation procedure for retinal organoid samples for transmission electron microscopy. It is suitable for applications that involve the analysis of synapses in mature retinal organoids.

透過型電子顕微鏡法のためのレチナールオルガノイドサンプルの調製

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem ...

透過電子顕微鏡用小型サンプル準備

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サンプル準備および透過電子顕微鏡によるエクソソームのイメージ投射

透過型電子顕微鏡法のためのレチナールオルガノイドサンプルの調製

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