Authors have nothing to disclose.

動物実験、根拠や研究の目的を実行するためのプロトコルは、南カリフォルニア機関動物実験委員会の大学から提出され、承認された。 デ·同定されたヒト食道切除標本から初代培養を確立するためのプロトコルは、南カリフォルニア大学倫理委員会で承認されました。 1.マウスまたはヒト食道を入手<ol><li> マウス食道を取得します。 <ol><li>頸椎脱臼に続いて2％イソフルラン吸入過剰摂取で8〜12日齢のマウスを安楽死させる。 </li><li>上下に面する腹動物を固定し、70％エタノールで腹側表面を濡らす。鉗子で、つかみ、ピンセットで尿道口に皮膚の前方を持ち上げる。あごに尿道口から腹側正中に沿って切断するための標準的なストレート外科用ハサミを使用してください。皮膚のみをカットするように注意してください。&lt;/ LI&gt; <li> &quot;Y&quot;逆さまを形成する、動物の両側の膝に下向きに開いて尿道から切開を行います。胸郭に沿って動物の両側に別の切開を行います。 </li><li>慎重に根本的な腹膜と胸郭のオフを、両側の皮をはがし、そして両側に横たわっていた。胸腔と腹腔の上にある腹膜の上にある胸郭を調べます。 <ol><li>鉗子で腹膜を持ち上げ、横隔膜と肋骨ケージにそれをカットアップ、腹部の内容への損傷を防ぐために上向きにハサミを指している。静かに、肝臓の左葉を持ち上げ、基礎となる胃、食道·胃接合部と食道の腹部部分を露出させる。 </li></ol></li><li>子宮頸ガードルまでの正中線に沿って胸骨と肋骨を切断するためにオートクレーブ処理外科用ハサミを使用してください。胸部内容への損傷を防ぐために上向きにハサミを向け。完全に内容を公開する両側に胸郭を引いて胸腔。 </li><li>静かに心臓や肺の両葉を取り除く。 Q-ヒント過剰な血液を吸収する。胸部食道は胸椎に気管と前の後方に横たわって狭い、フレキシブルチューブです。 NOTE：食道、マウス新生児識別することは困難である。食道·胃接合部のローカライズは、食道の識別は簡単になります。 </li><li>慎重に周囲の血管系、脂肪を解剖、胃から食道をフォローアップし、子宮頸キャビティ内の食道の原点までのすべての方法を腸間膜。鈍い先端を有する外科用ハサミは、この目的のために最適に動作。 </li><li>食道の全長を切除し、以下に説明するさらなる処理のためにハンクス平衡塩溶液（HBSS）中に置く。必要に応じて、方向付けのために胃の一部を削除します。 注：小さな組織サイズのため、筋肉から固有筋層の分離粘膜は、マウス新生児食道達成できないし、全体の食道は、下記の処理が行われる。 </li></ol></li><li> 人間の食道を取得します。 <ol><li> HBSSで食道切除標本（典型的には、5 cm以下）を洗って接続されているすべての結合組織、脂肪、または血管系を削除します。 </li><li>標本の一部を切除し、必要に応じて将来の組織学的検査のためにホルマリン中に置く。 </li><li>鋭い切開によって、基礎となる固有筋層から残りの粘膜を分離する。 </li><li>サブセンチフラグメントおよび以下に記載されているプロトコルの対象に粘膜をカット。 注：ヒト食道切除は、後述する処理の前に、最大6時間、PBS中で保存することができる。食道標本の供給源は、試料サイズが決まると実験依存することになる。 </li></ol></li></ol> 2.アイソマウスおよびヒト食道間質細胞<ol><li> fは食道の間質細胞を単離する機械的および酵素消化の組み合わせにより、ROMのマウスおよびヒト組織。 <ol><li>機械的にHBSSではさみと複数回の洗浄で組織を切り刻むことでダイジェスト。酵素的に300 U / mlのコラゲナーゼXIおよび0.1mg / 25分（マウス組織）のために、または最大6時間（ヒト組織）mlのディスパーゼで組織をインキュベートすることにより、ダイジェスト。ミンチに使用する器具はオートクレーブし、滅菌されていることを確認します。 NOTE：コラゲナーゼは、コラーゲン、一緒に動物組織を保持する責任細胞外マトリックスタンパク質を分解する酵素である。コラゲナーゼXIは、高いコラゲナーゼ活性を有しており、この分離プロトコルの成功を見ている。ディスパーゼは、細胞膜活性を保持し、二次酵素としてコラゲナーゼと組み合わせて使用​​される穏やかなタンパク質分解解離活性を有する細菌酵素である。 </li><li> HBSSを含む、それぞれ1.7ミリリットルマイクロ遠心または5 mlチューブでマウスまたはヒト組織から得た粘膜の断片を置きます。さらに組織をみじん切りそれぞれのチューブに収まるオープン先端幅とハサミを使用して2〜3ミリメートル片に。食道粘膜の断片は、チューブの底に沈殿さを可能にするために十分な時間を確保してください。 </li><li>ゆっくりと不注意に組織を破棄しないように注意しながら、HBSSをデカント。穏やかに振とうすることにより、以下の新鮮なHBSSで交換してください。別の方法として、1ミリリットルピペットでHBSSを削除します。 </li><li>穏やかに食道断片は、各洗浄の間に沈降する時間を得るための洗浄の間で振とうしながら、このように8回の合計を組織を洗ってください。 注：ヒト組織は、よりその新生児のマウス組織を刻みが必要になります。 </li></ol></li><li> 300 U / mlのコラゲナーゼXIし、室温で低速でロッキングシェーカーセットで25分間0.1 mg / mlのディスパーゼを有するマウス組織をインキュベートする。 <ol><li>室温で低速に設定したロッキングシェーカー上、最大で6時間300 U / mlの第XIコラゲナーゼ及び0.1 mg / mlのディスパーゼでヒト組織をインキュベートします。 注：人間esophaの可用性GUSは可変である。初代培養の成功した世代で最大6時間の結果のための酵素とインキュベートしたヒト食道粘膜。 </li></ol></li><li>酵素消化した後、10分間200×gではさみや遠心分離機とのさらなるミンチ組織。 </li><li>上清を捨てる。非生存細胞および破片を除去するために、2％ソルビトールを添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で5回の5mlチューブに混合細胞懸濁液からなるペレットを移し、洗浄する。 </li><li> 10％ウシ胎児血清（FBS）を含むDMEM中で6ウェルプレートに、培養中の種子細胞、10mg / mlのインスリン、10μg/ mlのトランスフェリン、10μg/ mlのゲンタマイシン、および2 / mlの上皮成長因子（EGF） 。真空フィルター（0.22μm）で濾過した後に添加することができるEGF以外のすべてのコンポーネント。切除サイズに応じて、複数の6ウェルプレートの中で人間の切除標本から得られた細胞を分配する。 </li><li>井戸が80％コンフルエントになったら、T25への通路接着細胞は私たちをフラスコる0.05％トリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）。 400×gでメディアやスピンで中和。 <ol><li> 1：1の比率でのT25フラスコ、継代細胞に6ウェル通過のため。 2または1：3の比率コンフルエントT25フラスコ1に継代することができる。 1の比率：T75フラスコにT25フラスコから通路に、1を使用。関係なく、容器の2〜3日おきにメディアを変更します。 </li><li>メディアは、上述の筋線維芽細胞において、加湿5％CO 2インキュベーターと培養液中で37ºCで細胞を増殖させる。 注：上皮細胞はこれらの培養または継代条件下では生存しない。特徴づけのために、以下に記載の研究に用いた細胞は、継代5と15の間である。 </li><li>筋線維芽細胞の培地に10％ジメチルスルホキシドを添加することにより、液体N 2中で細胞を凍結保存する。 </li></ol></li></ol> 3.特徴付けマウスおよびヒト食道間質細胞<ol><li>倒立顕微鏡で細胞の形態を調べます。紡錘形を守って接着性細胞の形態（ 図1）。 </li><li> α-SMA、ビメンチン、デスミン、およびサイトケラチン：以下の細胞骨格のマーカーを評価することによって培養細胞を特徴づける。筋線維芽細胞様の表現型との間質細胞は、α-SMAおよびビメンチン（ 図2）細胞骨格筋線維芽細胞マーカーを発現する。 <ol><li>さらにデスミンための免疫染色筋細胞から培養された間質細胞を区別する。培養細胞での免疫染色を行うために、4ウェルチャンバースライド中で1.5×10 4個の細胞をプレーティングし、24時間、筋線維芽細胞の培地中で成長する。筋線維芽細胞様の表現型との間質細胞が弱いか存在しないデスミンの発現を持つことになります。間質細胞は、上皮マーカーパンサイトケラチンの発現を欠く（データは示さず）。 注：培養物の評価は、フローサイトメトリー、免疫細胞化学及び細胞表面マーカーによる細胞骨格マーカーの評価を含む。免疫細胞化学は、元のように特性化の主な方法として使用されている細胞骨格タンパク質のPRESSIONプロファイルは、線維芽細胞、筋線維芽細胞や筋細胞のためにユニークです。フローサイトメトリーは、上皮、内皮および造血細胞マーカーの細胞表面発現を評価することにより、培養純度を確立します。 CD90は​​、それがヒト線維芽細胞および筋線維芽細胞の両方で発現されるヒト間質細胞を同定する補助的方法として有用である。それはまた、マウスT細胞によって発現されるCD90は​​、マウス間質細胞の特徴付けに有用ではない。 </li></ol></li><li>細胞が60％コンフルエンスに達した後、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でスライドをリンスし、メタノールで固定する。 -20℃で10分間、メタノール中で細胞をインキュベートし、その後、使用するまで4℃でPBS中に保存する。 </li><li>標準の免疫染色プロトコルに従ってください。 </li><li>簡単に言えば、一次抗体を適用する前、PBS中の5％goatserumで固定した細胞をブロックする。同様に、5％ヤギ血清で一次および二次抗体を希釈します。 <ol><li> α-SMAおよびビメンチンの検出のために、使用する以下の抗体および濃度：マウスmAbは、α-SMAを次のように1：500希釈：1でのビメンチンに250希釈し、ウサギたpAB。 </li><li> 1の希釈で200およびCy2とコンジュゲートヤギ抗ウサギ：PBSで3回洗浄し、1の希釈で二次抗体ローダミン結合ヤギ抗マウスを追加し、4℃で一晩室温で一次抗体と共にインキュベートし、1時間1,000室温で。 </li><li>次に、対比の1分間に1μg/ mlの濃度で4核 &#39;、6-ジアミジノ-2Phenylindole（DAPI）およびPBSで洗浄した。倒立顕微鏡でスライドを分析します。 </li></ol></li><li>造血のためのマウスおよびヒトの食道細胞の検査（CD45）およびフローサイトメトリーによる内皮細胞（CD31）の細胞表面マーカー（ 図3）によって、培養物の純度を確立する。間質細胞表面マーカーCD90の発現によって、ヒト細胞を特徴づける。 NOTE：CD90は​​、マウスTセルネズミ間質細胞を同定するために使用することができないLSはまた、CD90を発現する。 <ol><li> 10分間37℃で非酵素的細胞解離溶液で処理することにより培養フラスコから培養マウス食道の間質細胞を切り離し、二回FACS緩衝液で洗浄し、関連するアイソタイプコントロールでFITC-CD45およびAPC-CD31を用いて計数し、染色し、従っ標準染色手順に。 </li><li> FACSキャリバーを用いて細胞を収集し、FlowJoソフトウェアを使用してデータを分析する。細胞を染色する前に、抗体を最適化し、アイソタイプ対照、正常マウスの脾臓および骨髄細胞を用いて濃度を滴定する。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+stromal+stem+cells+in+tissue+regeneration+and+wound+repair.">The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair.</a> Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).</li><li>Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cells+of+the+intestinal+lamina+propria.">Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria.</a> Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).</li><li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Helper+2+Cytokines,+Transforming+Growth+Factor+beta1,+and+Eosinophil+Products+Induce+Fibrogenesis+and+Alter+Muscle+Motility+in+Patients+With+Eosinophilic+Esophagitis.">T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis.</a> Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).</li><li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+cells+important+in+health+and+disease.">Paracrine cells important in health and disease.</a> The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).</li><li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+subepithelial+myofibroblasts.">Intestinal subepithelial myofibroblasts.</a> The American Journal of Physiology. 277 (2 Pt. 1), C183-201 (1999).</li><li>Shaker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cells+participate+in+the+murine+esophageal+mucosal+injury+response.">Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).</li><li>Shaker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epimorphin+deletion+protects+mice+from+inflammation-induced+colon+carcinogenesis+and+alters+stem+cell+niche+myofibroblast+secretion.">Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).</li><li>Kalabis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mouse+and+human+esophageal+epithelial+cells+in+3D+organotypic+culture.">Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture.</a> Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).</li><li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue.">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li><li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastroesophageal+reflux+disease-associated+esophagitis+induces+endogenous+cytokine+production+leading+to+motor+abnormalities.">Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities.</a> Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).</li></ol>

この作品は、NIH / NCI K08CA153036-01A1（AS）、健康のAGA-ゼネラル·ミルズベル研究所ガット生理学と健康で栄養研究員賞（AS）とライト財団パイロット賞（AS）によってサポートされています。

組織のサイズに適合さミンチ消化時間で、マウスまたはヒト組織を使用するときに初代培養生成のための技術は、一般的に類似している。マウス組織での経験は、上記の方法を使用して一貫して一次培養物の確立に成功をもたらすことを示唆している。プロトコル内の重要なステップは、手術器具の滅菌を含む組織培養の標準的な滅菌技術に従って。マウスの年齢も重要なステップです。 8?...

上皮-間質相互作用は、粘膜の再生、修復、線維症、および発癌1,2-含む胃腸管の様々な機能の調節に関与する。これらの相互作用は、最高の小腸および結腸において研究されており、同様に食道粘膜障害3において役割を果たし得る。腸および結腸の間質細胞と呼ばれる筋線維芽細胞の亜集団は、組織損傷、炎症の媒介に関与し、4,5を修復することが実証されている。遠位の胃腸管では、これらの紡錘形細胞が上皮及び固有層の間の界面での基底膜に隣接して配置されており、α-SMAおよびビメンチン陽性の、汎サイトケラチン陰性、及び弱陽性またはデスミン陰性5として定義される。 食道ストロマ厳密セルラーまたは分子レベルで特徴付けられていない。ネズミの食道における私たちの仕事は、デを持って扁平上皮6に時折下にある、食道間質におけるα-SMAおよびビメンチン細胞monstrated。上皮-間質相互作用は、そのような胃食道仲介傷害6と好酸球性食道炎3として食道粘膜障害に関係している。線維性狭窄はまた、胃腸線維症の病因に関与していた食道の傷害および間質細胞の既知の合併症である。これらの細胞の単離は、錯乱シグナル伝達経路を調査するために必要な研究を達成するの​​に役立ちます。 この投稿は、これらの相互作用を媒介するシグナル伝達経路に関する知識の既存のギャップに対処することができるように、α-SMA陽性の、ビメンチン陽性の筋線維芽細胞の初代培養を確立するために必要な技術を提供する。記載された技術が正常初代マウス結腸筋線維芽細胞7及びfurtheを確立するために、著者らによって使用されているRは、マウス6と人間の筋線維芽細胞のような食道間質細胞の確立のために適合した。 】ここで我々は、将来の機能研究に使用する前に、マウスまたはヒト食道から確立これらの培養を確立し、特徴づけるために必要な条件について説明します。培養物を増殖させ、最大で15継代のために利用することができる。以下に概説する方法を経由して一次培養物の単離と確立は、筋線維芽細胞表現型を有する間質細胞を生成します。 、正のビメンチン-SMA、α、および​​デスミン弱陽性または陰性、及びサイトケラチン陰性であった。この表現型は3負または粘膜筋板6のα-SMA陽性の、ビメンチン陰性表現型α-SMA、主にビメンチン陽性である食道線維芽細胞の表現型とは区別される。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tissue culture reagents</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>GIBCO, Invitrogen</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F42442</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Roche</td><td>10-652-202-001</td><td></td></tr><tr><td>trypsin/EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagents for immunostaining</td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Mouse mAB to &amp;alpha;-SMA&amp;nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab7817</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit pAB to vimentin</td><td>abcam</td><td>ab45939</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 conjugated Goat anti Rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-225-144</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>CD31 conjugated to eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0319-41</td><td></td></tr><tr><td>CD90 conjugated to APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0909-41</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V and 7AAD</td><td>BD Pharmigen</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Fc block for CD16/CD32</td><td>BD Pharmigen</td><td>2136662</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>5 ml tube</td><td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Motic</td><td>AE31</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety cabinet and incubators</td><td>Nuaire</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.nuaire.com/products/&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://www.nuaire.com/products/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>4-well chamber slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Vacuum-Driven Filter System</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE300</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>T25 Flasks</td><td>TRP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>T75 Flasks</td><td>Corning</td><td>43064</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single tipped Q-Tips</td><td>Kendall</td><td>540500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>Metamorph software (Molecular Devices)</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSCAlibur</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of myofibroblasts from mouse and human esophagus

マウスおよびヒト食道筋線維芽細胞は、酵素消化を介して生成されます。新生児（8-12日齢）マウス食道は、収穫みじん切り、洗浄し、そして25分間、コラゲナーゼおよびディスパーゼによる酵素消化に供される。人間の食道切除標本は、固有筋層と外膜を剥奪され、残りの粘膜はミンチされ、最大6時間、コラゲナーゼとディスパーゼとの酵素消化にかけた。培養した細胞は、α-SMAおよびビメンチンを発現させ、全く弱いかデスミンを発現する。培養条件は、上皮、造血、または内皮細胞の成長に貢献しない。培養物の純度は、さらに潜在的な汚染造血および内皮細胞の細胞表面マーカー発現のフローサイトメトリー評価によって確認される。記載された技術は、簡単であり、非hematopoieitc、非内皮間質細胞の一貫した生成をもたらす。この技術の制限事項の使用に固有のものである分子生物学の研究で初代培養、 すなわち 、避けられないばらつきが異なるマウスまたはヒトを越えて確立の文化の中で発生しました。初代培養は、しかし細胞株に比べて、生体内の状態をより代表反映している。これらの方法はまた、群間の比較を可能にする、研究者に異なる臨床および実験条件からストロマ細胞を単離し、培養する能力を提供する。特徴付け食道間質細胞はまた、食道疾患における上皮 - 間質相互作用を調査する機能的研究に用いることができる。

機械的および酵素消化を用いて単離し食道間質細胞は、最初に6ウェルプレートに播種し、培養する。めっき時間以内に倒立顕微鏡を用いた細胞の検査は、プレート底部（ 図1A）に緩く付着混合細胞懸濁液を実証する。次の24時間にわたり、プレート底部にしっかりと付着した紡錘状の細胞は、細胞がウェル内の5日間の全領域をカバーし、形態を維持し、正常に継代することがで?...

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Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express &#945;-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.

マウスおよびヒト食道から筋線維芽細胞の単離

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

isolation-of-myofibroblasts-from-mouse-and-human-esophagus

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K ビュー.  Keck School of Medicine, University of Southern California. We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express α-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions. 

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Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and promotion of the tumor microenvironment. While there are currently many techniques for the isolation of MFs from gastrointestinal (GI) tissues, this protocol introduces a novel element of isolation of these stromal cells from frozen tissue. Freezing GI tissue specimens not only allows the researcher to acquire samples from worldwide collaborators, biobanks, and commercial vendors, it also permits the delayed processing of fresh samples. The described protocol will consistently yield characteristic spindle-shaped cells with the MF phenotype that express the markers CD90, &#945;-SMA and vimentin. As these cells are derived from patient samples, the use of primary cells also confers the benefit of closely mimicking MFs from disease states-namely cancer and inflammatory bowel diseases. This technique has been validated in gastric, small bowel, and colonic MF primary culture generation. Primary MF cultures can be used in a vast array of experiments over a number of passage and their purity assessed by both immunocytochemistry and flow cytometry analysis.

Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, &#945;-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.

人間の冷凍消化管標本からCD 90 +線維芽細胞/筋線維芽細胞の単離


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

発生生物学

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

生産、特性評価および3D組織工学ヒト食道粘膜モデルの使用可能性

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

生物工学

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

マウスおよびヒト結腸組織からの一次筋線維芽細胞の分離

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

生物学

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary fibroblasts cannot divide indefinitely due to myofibroblast differentiation or senescence induction, new cultures must be established regularly. However, there are several obstacles to overcome during the processes of developing a reliable isolation protocol and primary fibroblast isolation itself: the method&#8217;s degree of difficulty (especially for beginners), the risk of bacterial contamination, the required time until primary fibroblasts can be used for experiments, and subsequent cell quality and viability. In this study, a fast, reliable and easy-to-learn protocol to isolate and culture primary adult fibroblasts from mouse heart, lung, liver and kidney combining enzymatic digestion and ultrasonic agitation is provided.

We present a protocol to isolate primary adult fibroblasts in an easy, fast and reliable way, performable by beginners (e.g., students). The procedure combines enzymatic tissue digestion and mechanical agitation with ultrasonic waves to obtain primary fibroblasts. The protocol can easily be adapted to specific experimental requirements (e.g., human tissue).

超音波増強原発性成人線維芽細胞分離

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

医学

人間の食道オルガノイドおよび気液界面の培養のプロトコール

Three-Dimensional Cell Culture Models to Investigate the Epithelial Barrier in Eosinophilic Esophagitis

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and microbes. Maintaining the integrity of the epithelial barrier is critical for preventing infections and avoiding inflammation caused by harmless food-derived antigens. This article provides simplified protocols for generating human esophageal organoids and air-liquid interface cultures from patient biopsies to study the epithelial compartment of the esophagus in the context of tissue homeostasis and disease. These protocols have been significant scientific milestones in the last decade, describing three-dimensional organ-like structures from patient-derived primary cells, organoids, and air-liquid interface cultures. They offer the possibility to investigate the function of specific cytokines, growth factors, and signaling pathways in the esophageal epithelium within a three-dimensional framework while maintaining the phenotypic and genetic properties of the donor. Organoids provide information on tissue microarchitecture by assessing the transcriptome and proteome after cytokine stimulation. In contrast, air-liquid interface cultures allow the assessment of the epithelial barrier integrity through transepithelial resistance (TEER) or macromolecule flux measurements. Combining these organoids and air-liquid interface cultures is a powerful tool to advance research in impaired esophageal epithelial barrier conditions.

著者スポットライト:好酸球性食道炎の病態生理学の調査

Here, a protocol for the culture of human esophageal organoids and air-liquid interface culture is provided. Esophageal organoids' air-liquid interface culture can be used to study the impact of cytokines on the esophageal epithelial barrier.

好酸球性食道炎における上皮バリアを調べるための三次元細胞培養モデル 

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and ...

免疫・感染学

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate filament proteins that sustain the nuclear envelope and the components of the nucleoplasm. We recently reported that muscle wasting in EDMD can be ascribed to intrinsic epigenetic dysfunctions affecting muscle (satellite) stem cells regenerative capacity. Isolation and culture of single myofibers is one of the most physiological ex-vivo approaches to monitor satellite cells behavior within their niche, as they remain between the basal lamina surrounding the fiber and the sarcolemma. Therefore, it represents an invaluable experimental paradigm to study satellite cells from a variety of murine models. Here, we describe a re-adapted method to isolate intact and viable single myofibers from post-natal hindlimb muscles (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius and Soleus). Following this protocol, we were able to study satellite cells from Lamin &#916;8-11 -/- mice, a severe EDMD murine model, at only 19 days after birth.
We detail the isolation procedure, as well as the culture conditions for obtaining a good amount of myofibers and their associated satellite-cells-derived progeny. When cultured in growth-factors rich medium, satellite cells derived from wild type mice activate, proliferate, and eventually differentiate or undergo self-renewal. In homozygous Lamin &#916;8-11 -/- mutant mice these capabilities are severely impaired.
This technique, if strictly followed, allows to study all processes linked to the myofiber-associated satellite cell even in early post-natal developmental stages and in fragile muscles.

Here, we propose a method to efficiently obtain single muscle fibers at early post-natal developmental stages from homozygous mutant Lamin &#916;8-11 mouse model, a very severe model for Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD).

出生後初期の発達におけるエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーのマウスモデルからの単一の筋繊維の分離と培養

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, fibroblasts, myofibroblasts, smooth muscle cells, immune cells, and the recently identified cell type, telocytes. Telocytes are unique mesenchymal cells with long cytoplasmic processes, reaching a distance of tens to hundreds of microns from the cell body. Telocytes have recently emerged as an important intestinal stem cell niche component, providing Wnt proteins that are essential for stem and progenitor cell proliferation.
Although protocols on how to isolate mesenchyme from the mouse intestine are available, it is not clear whether these procedures allow the efficient isolation of telocytes. Isolating telocytes efficiently requires special protocol adjustments that would allow dissociation of the strong cell-cell contact between telocytes and neighboring cells without affecting their viability. Here, available intestinal mesenchyme isolation protocols were adjusted to support the successful isolation and culture of mesenchyme containing a relatively high yield of viable single-cell telocytes.
The obtained single-cell suspension can be analyzed by several techniques, such as immunostaining, cell sorting, imaging, and mRNA experiments. This protocol yields mesenchyme with sufficiently conserved antigenic and functional properties of telocytes, and can be used for several applications. For example, they can be used for co-culture with mouse- or human-derived organoids to support organoid growth with no growth factor supplementation, to better reflect the situation in the original tissue.

Here, we present a protocol to isolate murine intestinal mesenchyme, including telocytes. These can be used for several applications, such as co-culture with mouse or human-derived organoids, to support growth and better reflect the situation in the original tissue.

マウス腸間葉系の単離により、テロサイトの高収率が得られます

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

成人心臓線維芽細胞と筋線維芽細胞の分離と特徴付け

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

マウスおよびヒト食道から筋線維芽細胞の単離

要約

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人間の冷凍消化管標本からCD 90 +線維芽細胞/筋線維芽細胞の単離

生産、特性評価および3D組織工学ヒト食道粘膜モデルの使用可能性

マウスおよびヒト結腸組織からの一次筋線維芽細胞の分離

超音波増強原発性成人線維芽細胞分離

好酸球性食道炎における上皮バリアを調べるための三次元細胞培養モデル

好酸球性食道炎における上皮バリアを調べるための三次元細胞培養モデル

好酸球性食道炎における上皮バリアを調べるための三次元細胞培養モデル

出生後初期の発達におけるエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーのマウスモデルからの単一の筋繊維の分離と培養

マウス腸間葉系の単離により、テロサイトの高収率が得られます

成人心臓線維芽細胞と筋線維芽細胞の分離と特徴付け