Name: isolation of myofibroblasts from mouse and human esophagus
Uploaded: 2015-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
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Authors have nothing to disclose.

O protocolo para realizar experimentos com animais, a lógica e os objetivos da pesquisa, foram submetidos e aprovados pela University of Southern California Institutional Animal Care e do Comitê Use. O protocolo para estabelecimento de culturas primárias de identificados de-esofagectomia espécimes humanos foi aprovado pela University of Southern California Institutional Review Board. 1. Obtenha Mouse ou Esôfago Humano <ol><li> Obter Rato Esôfago: <ol><li> Eutanásia do rato velho 8-12 dias com 2% de isoflurano sobredosagem inalante seguido por deslocação cervical. </li><li> Pin o animal para baixo com a barriga voltada para cima e molhar a superfície ventral com etanol 70%. Com uma pinça, agarrar e levantar a pele anterior à abertura da uretra com uma pinça. Use uma tesoura cirúrgica retas padrão para cortar ao longo da linha média ventral a partir da abertura da uretra até o queixo. Tenha cuidado para cortar somente a pele. &lt;/ Li&gt; <li> Fazer uma incisão da abertura uretral para baixo para o joelho em ambos os lados do animal, que formam uma cabeça para baixo &quot;Y&quot;. Fazer uma outra incisão em ambos os lados do animal ao longo da caixa toráxica. </li><li> Retire cuidadosamente a pele em ambos os lados, fora do peritônio subjacente e da caixa torácica, e se deitou para os lados. Examinar a caixa torácica que se sobrepõe à cavidade torácica e o peritoneu que se sobrepõe à cavidade abdominal. <ol><li> Levante o peritônio com uma pinça e cortar por ele até a gaiola diafragma e costela, apontando uma tesoura para cima para evitar danos ao conteúdo abdominal. Suavemente levantar o lobo esquerdo do fígado, do estômago expor subjacente, a junção esôfago-gástrica e a porção abdominal do esófago. </li></ol></li><li> Use uma tesoura cirúrgica autoclavados para cortar o esterno e costelas ao longo da linha média até a cintura cervical. Ponto de tesoura para cima, para evitar danos ao conteúdo torácicos. Totalmente expor o conteúdo docavidade torácica, puxando a caixa torácica para os lados. </li><li> Suavemente remover o coração e os dois lobos dos pulmões. Absorve o excesso de sangue com cotonetes. O esôfago torácico é uma, tubo deitado posterior estreito flexível para a traquéia e anterior à vértebra torácica. NOTA: O esôfago pode ser difícil de identificar em recém-nascidos de murino. Localização da junção esôfago-gástrica torna a identificação do esôfago simples. </li><li> Siga cuidadosamente o esôfago acima do estômago, dissecando a vasculatura, gordura ao redor e do mesentério todo o caminho até a origem da dor na cavidade cervical. Tesouras cirúrgicas com ponta romba funcionam melhor para esta finalidade. </li><li> Ressecção de todo o comprimento do esófago e do lugar em solução salina equilibrada de Hanks (HBSS) para posterior processamento descrito abaixo. Retirar uma porção do estômago para fins de orientação, se desejado. NOTA: Devido ao tamanho pequeno tecido, a separação das muscular própria do muscularé mucosa não é viável dentro murino esôfago recém-nascido e de todo o esôfago é submetido ao processamento descrito abaixo. </li></ol></li><li> Obter Esôfago Humano: <ol><li> Lave espécimes ressecção do esôfago (tipicamente 5 cm ou menos) com HBSS e remover qualquer anexo do tecido conjuntivo, tecido adiposo, ou vasculatura. </li><li> Ressecção de uma porção da amostra e colocam-se em formalina para exame histológico futuro, se desejado. </li><li> Separe os mucosa restantes do subjacente muscular própria dissecadas. </li><li> Corte mucosa em fragmentos centímetros sub e sujeito com o protocolo descrito abaixo. NOTA: ressecções esófago humanos podem ser armazenadas em PBS durante até 6 h antes do processamento descrito abaixo. Fonte de espécimes esofagectomia vai ditar o tamanho da amostra e será laboratório dependente. </li></ol></li></ol> 2. Isolar Murino e esôfago humano células estromais <ol><li> Isolar células estromais esofágicas fmurino rom e tecidos humanos por uma combinação de digestão enzimática e mecânica. <ol><li> Mecanicamente digerir picando o tecido com uma tesoura e múltiplas lavagens com HBSS. Enzimaticamente digerir o tecido, por incubação com 300 U / ml de colagenase XI e 0,1 mg / ml de dispase durante 25 min (tecido de murino) ou de até 6 horas (tecido humano). Certifique-se de que os instrumentos utilizados para picar foram autoclavados e esterilizado. NOTA: As colagenases são enzimas que quebram o colágeno, uma proteína de matriz extracelular responsável pela realização de tecido animal juntos. Colagenase XI tem alta atividade da colagenase e tem visto o sucesso neste protocolo de isolamento. Dispase é uma enzima bacteriana com actividade proteolítica dissociação suave que preserva a actividade da membrana celular e é usada em combinação com uma enzima colagenase como secundário. </li><li> Coloque fragmentos de mucosa obtidos a partir do mouse ou tecido humano em 1,7 ml micro-centrífuga ou tubos de 5 ml, respectivamente, contendo HBSS. Tecido Mince maisem 2-3 pedaços mm usando uma tesoura com uma largura de ponta aberta que se encaixam em seus respectivos tubos. Permitir tempo suficiente para permitir a fragmentos de mucosa esofágica para sedimentar para o fundo do tubo. </li><li> Lentamente decantar HBSS, tomando cuidado para não inadvertidamente descartar o tecido. Substituir com HBSS seguinte por agitação suave. Como alternativa, remova HBSS com uma pipeta de 1 ml. </li><li> Lave o tecido dessa forma um total de 8 vezes com agitação suave entre lavagens dar tempo aos fragmentos de esôfago para sedimentar entre cada lavagem. NOTA: O tecido humano vai exigir mais picados que o tecido recém-nascido mouse. </li></ol></li><li> Incubar tecido murino com 300 U / ml de colagenase XI e 0,1 mg / ml de dispase durante 25 min num agitador de balanço regulada para uma velocidade lenta, à temperatura ambiente. <ol><li> Incubar o tecido humano com 300 U / ml de colagenase XI e 0,1 mg / ml de dispase durante até 6 horas, num agitador de balanço regulada para uma velocidade lenta, à temperatura ambiente. NOTA: A disponibilidade de esopha humanogus é variável. Mucosa esofágica Human incubadas com enzimas para até 6 horas resulta em uma geração bem sucedida de culturas primárias. </li></ol></li><li> Após a digestão enzimática de tecido tritura ainda com uma tesoura e centrifugar a 200 xg durante 10 min. </li><li> Descartar o sobrenadante. Transferir o sedimento, que consiste de uma suspensão mista de células para um tubo de 5 ml e lava-se 5 vezes em Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 2% de sorbitol para eliminar as células não viáveis ​​e detritos. </li><li> Semear as células em placas de 6 poços e cultura em DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS), 10 mg / ml de insulina, 10 ng / ml de transferrina, 10 ug / ml de gentamicina, e factor de crescimento epidérmico 2 ng / ml (EGF) . Filtro de vácuo (0,22 mm) todos os componentes, com excepção de EGF que podem ser adicionados após a filtração. Distribuir as células obtidas a partir de amostras de ressecção humanos entre múltiplas placas de 6 poços, dependendo do tamanho da ressecção. </li><li> Depois de os poços são 80% confluentes, passagem células aderentes a T25 nos frascosção de 0,05% de tripsina / ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Neutralizar com a mídia e rotação a 400 x g. <ol><li> Para uma passagem de 6 poços para um frasco T25, as células de passagem na proporção de 1: 1. Frascos T25 confluentes podem ser passadas a uma proporção de 1: 3: 2 ou 1. Para a passagem de um frasco de T25 a um frasco T75, utilizar uma proporção de 1: 1. Troca de mídia a cada 2-3 dias, independentemente do navio. </li><li> Crescer as células a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO2 e cultura de miofibroblastos nos meios descritos acima. NOTA: As células epiteliais não sobrevivem sob estas condições de cultura ou de passagem. As células utilizadas para a caracterização e nos estudos descritos abaixo são passagens entre 5 e 15. </li><li> Cryo-preservar células em N2 líquido, adicionando 10% de dimetilsulfóxido à mídia myofibroblast. </li></ol></li></ol> 3. Caracterizar Murino e esôfago humano células estromais <ol><li> Examinar a morfologia das células com um microscópio invertido. Observe a-fusiformesmorfologia de células aderentes (Figura 1). </li><li> Caracterizar células cultivadas pela avaliação dos seguintes marcadores do citoesqueleto: α-SMA, vimentina, desmina, e cytokeratin. As células estromais com um fenótipo myofibroblast-like expressam marcadores miofibroblastos do citoesqueleto α-SMA e vimentina (Figura 2). <ol><li> Para diferenciar ainda mais as células do estroma cultivadas a partir de células musculares, imunocoloração para desmina. Para realizar a imunocoloração em células cultivadas, placa 1,5 x 10 4 células em lâminas de câmara de 4 cavidades e crescem em meios de miofibroblastos durante 24 h. As células estromais com um fenótipo myofibroblast-like terá fraco ou ausente expressão desmina. As células estromais não ter expressão do marcador pan-epitelial citoqueratina (dados não mostrados). NOTA: Avaliação de culturas inclui avaliação de marcadores do citoesqueleto por marcadores imunocitoquímica e da superfície celular por citometria de fluxo. A imunocitoquimica é utilizado como o principal método de caracterização como o expression perfil de proteínas do citoesqueleto é único para o fibroblasto, miofibroblastos ou células do músculo. A citometria de fluxo estabelece que a cultura de pureza por avaliação de expressão na superfície celular de células epiteliais, endoteliais e células hematopoiéticas marcadores. CD90 é útil como adjuvante de um método de identificação de células estromais humanas, uma vez que é expresso em ambos os fibroblastos humanos e miofibroblastos. CD90 não é útil na caracterização de células estromais de murino, uma vez que também expressa por células T de murideo. </li></ol></li><li> Depois das células atingirem 60% de confluência, enxaguar as lâminas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e fixar-se com metanol. Incubar as células em metanol durante 10 min a -20 ° C e em seguida armazená em PBS a 4 ° C até à sua utilização. </li><li> Siga o protocolo immunostaining padrão. </li><li> Resumidamente, antes da aplicação do anticorpo primário, bloquear as células fixadas com 5% goatserum em PBS. Dilui-se anticorpos primários e secundários em 5% de soro de cabra bem. <ol><li> Para a detecção de α-SMA e vimentina, utilizar oOs anticorpos e as concentrações seguintes: mAb de murganho para α-SMA em 1: 250 de diluição e de coelho pAB para vimentina em 1: 500 de diluição. </li><li> Incubar com anticorpo primário, à temperatura ambiente durante a noite a 4 ° C, lavar 3 vezes com PBS e adicionar anticorpos secundários rodamina cabra anti-ratinho conjugado a uma diluição de 1: 200 e Cy2 cabra anti coelho conjugado a uma diluição de 1: 1000 durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Contracoloração núcleos com 4 &#39;, 6-diamidino-2Phenylindole (DAPI) a uma concentração de 1 ug / ml durante 1 min e, em seguida, lavar com PBS. Analisar slides com um microscópio invertido. </li></ol></li><li> Estabelecer pureza das culturas através de exame das células esofágicas murinos e humanos para hematopoiéticas (CD45) e endotelial (CD31) marcadores de superfície celular por citometria de fluxo (Figura 3). Caracterizar as células humanas ainda pela expressão do marcador de superfície celular de estroma da CD90. NOTA: CD90 não pode ser utilizado para identificar as células de estroma murino como murino T cells também expressam CD90. <ol><li> Separar as células estromais esofágica do rato em cultura a partir de frascos de cultura por tratamento com celular não-enzimática de dissociação Solução a 37 ° C durante 10 minutos, foram lavadas duas vezes com tampão FACS, contadas e coradas com FITC-CD45 e CD31-APC com os controlos de isotipo correspondentes, de acordo para procedimentos de coloração padrão. </li><li> Coletar células usando FACS Calibur e analisar os dados com software FlowJo. Antes de células marcadas, otimizar anticorpos e titular concentrações usando controles isotipo, baço normal do mouse, e as células da medula óssea. </li></ol></li></ol>

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	<li>Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+stromal+stem+cells+in+tissue+regeneration+and+wound+repair.">The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair.</a> Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).</li><li>Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cells+of+the+intestinal+lamina+propria.">Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria.</a> Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).</li><li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Helper+2+Cytokines,+Transforming+Growth+Factor+beta1,+and+Eosinophil+Products+Induce+Fibrogenesis+and+Alter+Muscle+Motility+in+Patients+With+Eosinophilic+Esophagitis.">T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis.</a> Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).</li><li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+cells+important+in+health+and+disease.">Paracrine cells important in health and disease.</a> The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).</li><li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+subepithelial+myofibroblasts.">Intestinal subepithelial myofibroblasts.</a> The American Journal of Physiology. 277 (2 Pt. 1), C183-201 (1999).</li><li>Shaker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cells+participate+in+the+murine+esophageal+mucosal+injury+response.">Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).</li><li>Shaker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epimorphin+deletion+protects+mice+from+inflammation-induced+colon+carcinogenesis+and+alters+stem+cell+niche+myofibroblast+secretion.">Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).</li><li>Kalabis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mouse+and+human+esophageal+epithelial+cells+in+3D+organotypic+culture.">Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture.</a> Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).</li><li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue.">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li><li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastroesophageal+reflux+disease-associated+esophagitis+induces+endogenous+cytokine+production+leading+to+motor+abnormalities.">Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities.</a> Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).</li></ol>

Este trabalho é apoiado pelo NIH / NCI K08CA153036-01A1 (AS), AGA-General Mills Instituto Sino da Saúde e Nutrição Research Scholar Award em Fisiologia Gut e Saúde (AS) e um Wright Foundation Award Pilot (AS).

As técnicas para a geração de cultura primária são geralmente semelhantes quando se utiliza tecido murino ou humano com Picadoras de carne e de digestão vezes adaptados para o tamanho do tecido. A nossa experiência com tecido murino sugere que utilizando os métodos descritos acima consistentemente resultar no estabelecimento bem sucedido de culturas primárias. As etapas críticas no âmbito do protocolo incluem a esterilização de equipamentos cirúrgicos e seguindo técnicas estéreis padrão de cultura de te...

Interações epitélio-estromal estão envolvidos na regulação de uma variedade de funções do trato gastrointestinal, incluindo a regeneração das mucosas, reparação, fibrose e carcinogênese 1,2. Estas interacções têm sido melhor estudada no intestino delgado e cólon, e pode desempenhar um papel semelhante nos distúrbios da mucosa esofágica 3. Uma subpopulação de células de miofibroblastos do estroma e intestinais do cólon denominados foi demonstrada para participar na mediação de lesão dos tecidos, inflamação e reparação de 4,5. No tracto GI distal, estas células fusiformes estão localizadas adjacentes à membrana basal, na interface entre o epitélio e da lâmina própria e são definidos como α-SMA positivos e vimentina, citoqueratina pan-negativo, e fracamente positivo ou negativo 5 desmina. O estroma da dor não foi rigorosamente caracterizado ao nível celular ou molecular. Nosso trabalho no esôfago murino minimizarammonstrou α-SMA células e vimentina no estroma de esôfago, ocasionalmente subjacentes ao epitélio escamoso 6. Interacções epiteliais-estromal têm sido implicados em perturbações da mucosa esofágica, tais como lesão mediada gastro-esofágico e esofagite eosinofílica 6 3. Estenoses fibróticas também são uma complicação conhecida de células estromais de lesões esofágicas e têm sido implicados na patogénese da fibrose gastrointestinal. O isolamento dessas células vai ajudar a realizar os estudos necessários para investigar vias de sinalização dementes. Esta apresentação fornece as técnicas necessárias para estabelecer culturas primárias de α-SMA, myofibroblasts positivos vimentina positivos tais que as lacunas existentes no conhecimento sobre as vias de sinalização que medeiam estas interações podem ser abordados. A técnica descrita foi utilizada com sucesso pelos autores para estabelecer miofibroblastos do cólon de murino primários 7 e further adaptado para o estabelecimento de murino 6 e células estromais esôfago humano miofibroblastos. Descrevemos as condições necessárias para estabelecer e caracterizar essas culturas estabelecidas a partir do mouse ou no esôfago humano antes do uso em futuros estudos funcionais. As culturas podem ser cultivadas e utilizou-se para a 15 passagens. O isolamento e estabelecimento de culturas primárias através dos métodos descritos abaixo gera células do estroma com um fenótipo de miofibroblastos; α-SMA, vimentin positivo e fracamente positivo ou negativo para desmina e citoceratina negativo. Este fenótipo é diferente do fenótipo do fibroblasto esofágica que é predominantemente positiva vimentina, α-SMA negativo 3 ou o α-SMA positivos, vimentina fenótipo negativo da mucosa muscularis 6.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tissue culture reagents</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>GIBCO, Invitrogen</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F42442</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Roche</td><td>10-652-202-001</td><td></td></tr><tr><td>trypsin/EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagents for immunostaining</td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Mouse mAB to &amp;alpha;-SMA&amp;nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab7817</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit pAB to vimentin</td><td>abcam</td><td>ab45939</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 conjugated Goat anti Rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-225-144</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>CD31 conjugated to eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0319-41</td><td></td></tr><tr><td>CD90 conjugated to APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0909-41</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V and 7AAD</td><td>BD Pharmigen</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Fc block for CD16/CD32</td><td>BD Pharmigen</td><td>2136662</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>5 ml tube</td><td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Motic</td><td>AE31</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety cabinet and incubators</td><td>Nuaire</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.nuaire.com/products/&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://www.nuaire.com/products/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>4-well chamber slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Vacuum-Driven Filter System</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE300</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>T25 Flasks</td><td>TRP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>T75 Flasks</td><td>Corning</td><td>43064</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single tipped Q-Tips</td><td>Kendall</td><td>540500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>Metamorph software (Molecular Devices)</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSCAlibur</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of myofibroblasts from mouse and human esophagus

De murino e humano esofágicas miofibroblastos são geradas através de digestão enzimática. Neonato (8-12 dias de idade) de murino esófago é colhida, triturada, lavada, e submetidos a digestão enzimática com colagenase e dispase durante 25 min. Espécimes ressecção do esôfago humanos são despojados de muscular própria e adventícia ea mucosa restante é picada, e submetido a digestão enzimática com colagenase e dispase por até 6 horas. As células cultivadas expressar α-SMA e vimentina e desmina expressa fracamente ou não em todos. Condições de cultura não são favoráveis ​​para o crescimento de células epiteliais, hematopoiético, ou células endoteliais. A pureza da cultura é ainda confirmada pela avaliação de citometria de fluxo de superfície celular expressão do marcador do potencial de contaminação da hematopoiético e células endoteliais. A técnica descrita é simples e resulta na geração consistente de não-hematopoieitc, células estromais não endoteliais. As limitações desta técnica são inerentes ao uso deculturas primárias em estudos de biologia molecular, ou seja, a variabilidade inevitável encontrou entre as culturas estabelecidas em diferentes ratos ou de seres humanos. As culturas primárias, porém, são uma reflexão mais representativo do estado in vivo em comparação com as linhas celulares. Estes métodos também fornecer aos investigadores a capacidade de isolar e cultura de células estromais de diferentes condições clínicas e experimentais, permitindo comparações entre os grupos. Células estromais esofágicas caracterizados também pode ser usado em estudos funcionais investigando interações epiteliais-estromal em doenças do esôfago.

Células estromais esofágicas isoladas usando a digestão mecânica e enzimática são inicialmente banhado e cultivadas em placas de 6 poços. O exame de células com um microscópio invertido dentro de horas de plaqueamento demonstra uma suspensão mista de células fracamente aderentes à placa de fundo (Figura 1A). Durante o próximo 24 horas, as células em forma de fuso firmemente aderentes ao fundo da placa são observados de disparo a partir da suspensão de células mista (Figura 1B)</...

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Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express &#945;-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.

Isolamento de Miofibroblastos de Mouse e esôfago humano

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

isolation-of-myofibroblasts-from-mouse-and-human-esophagus

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K visualizações.  Keck School of Medicine, University of Southern California. We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express α-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions. 

Vídeo: Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and promotion of the tumor microenvironment. While there are currently many techniques for the isolation of MFs from gastrointestinal (GI) tissues, this protocol introduces a novel element of isolation of these stromal cells from frozen tissue. Freezing GI tissue specimens not only allows the researcher to acquire samples from worldwide collaborators, biobanks, and commercial vendors, it also permits the delayed processing of fresh samples. The described protocol will consistently yield characteristic spindle-shaped cells with the MF phenotype that express the markers CD90, &#945;-SMA and vimentin. As these cells are derived from patient samples, the use of primary cells also confers the benefit of closely mimicking MFs from disease states-namely cancer and inflammatory bowel diseases. This technique has been validated in gastric, small bowel, and colonic MF primary culture generation. Primary MF cultures can be used in a vast array of experiments over a number of passage and their purity assessed by both immunocytochemistry and flow cytometry analysis.

Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, &#945;-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.

Isolamento de CD 90+ fibroblastos / miofibroblastos de humanos congelados gastrointestinais Amostras


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

Biologia do Desenvolvimento

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

Produção, Caracterização e usos potenciais de uma mucosa esofágica Modelo 3D Human Tissue-engenharia

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Bioengenharia

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolamento de primárias Miofibroblastos de Mouse e tecido do cólon humano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Biologia

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary fibroblasts cannot divide indefinitely due to myofibroblast differentiation or senescence induction, new cultures must be established regularly. However, there are several obstacles to overcome during the processes of developing a reliable isolation protocol and primary fibroblast isolation itself: the method&#8217;s degree of difficulty (especially for beginners), the risk of bacterial contamination, the required time until primary fibroblasts can be used for experiments, and subsequent cell quality and viability. In this study, a fast, reliable and easy-to-learn protocol to isolate and culture primary adult fibroblasts from mouse heart, lung, liver and kidney combining enzymatic digestion and ultrasonic agitation is provided.

We present a protocol to isolate primary adult fibroblasts in an easy, fast and reliable way, performable by beginners (e.g., students). The procedure combines enzymatic tissue digestion and mechanical agitation with ultrasonic waves to obtain primary fibroblasts. The protocol can easily be adapted to specific experimental requirements (e.g., human tissue).

Isolação adulta preliminar ultra-som-aumentada do fibroblasto

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

Medicina

Organoides esofágicos humanos e protocolos de cultura de interface ar-líquido

Three-Dimensional Cell Culture Models to Investigate the Epithelial Barrier in Eosinophilic Esophagitis

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and microbes. Maintaining the integrity of the epithelial barrier is critical for preventing infections and avoiding inflammation caused by harmless food-derived antigens. This article provides simplified protocols for generating human esophageal organoids and air-liquid interface cultures from patient biopsies to study the epithelial compartment of the esophagus in the context of tissue homeostasis and disease. These protocols have been significant scientific milestones in the last decade, describing three-dimensional organ-like structures from patient-derived primary cells, organoids, and air-liquid interface cultures. They offer the possibility to investigate the function of specific cytokines, growth factors, and signaling pathways in the esophageal epithelium within a three-dimensional framework while maintaining the phenotypic and genetic properties of the donor. Organoids provide information on tissue microarchitecture by assessing the transcriptome and proteome after cytokine stimulation. In contrast, air-liquid interface cultures allow the assessment of the epithelial barrier integrity through transepithelial resistance (TEER) or macromolecule flux measurements. Combining these organoids and air-liquid interface cultures is a powerful tool to advance research in impaired esophageal epithelial barrier conditions.

Autor em destaque: Investigando a fisiopatologia da esofagite eosinofílica

Here, a protocol for the culture of human esophageal organoids and air-liquid interface culture is provided. Esophageal organoids' air-liquid interface culture can be used to study the impact of cytokines on the esophageal epithelial barrier.

Modelos tridimensionais de cultura celular para investigar a barreira epitelial na esofagite eosinofílica 

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and ...

Imunologia e Infecção

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate filament proteins that sustain the nuclear envelope and the components of the nucleoplasm. We recently reported that muscle wasting in EDMD can be ascribed to intrinsic epigenetic dysfunctions affecting muscle (satellite) stem cells regenerative capacity. Isolation and culture of single myofibers is one of the most physiological ex-vivo approaches to monitor satellite cells behavior within their niche, as they remain between the basal lamina surrounding the fiber and the sarcolemma. Therefore, it represents an invaluable experimental paradigm to study satellite cells from a variety of murine models. Here, we describe a re-adapted method to isolate intact and viable single myofibers from post-natal hindlimb muscles (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius and Soleus). Following this protocol, we were able to study satellite cells from Lamin &#916;8-11 -/- mice, a severe EDMD murine model, at only 19 days after birth.
We detail the isolation procedure, as well as the culture conditions for obtaining a good amount of myofibers and their associated satellite-cells-derived progeny. When cultured in growth-factors rich medium, satellite cells derived from wild type mice activate, proliferate, and eventually differentiate or undergo self-renewal. In homozygous Lamin &#916;8-11 -/- mutant mice these capabilities are severely impaired.
This technique, if strictly followed, allows to study all processes linked to the myofiber-associated satellite cell even in early post-natal developmental stages and in fragile muscles.

Here, we propose a method to efficiently obtain single muscle fibers at early post-natal developmental stages from homozygous mutant Lamin &#916;8-11 mouse model, a very severe model for Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD).

Isolamento e Cultura de Miofibra único de um modelo murino de distrofia muscular em emery-dreifuss no desenvolvimento pós-natal antecipado

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, fibroblasts, myofibroblasts, smooth muscle cells, immune cells, and the recently identified cell type, telocytes. Telocytes are unique mesenchymal cells with long cytoplasmic processes, reaching a distance of tens to hundreds of microns from the cell body. Telocytes have recently emerged as an important intestinal stem cell niche component, providing Wnt proteins that are essential for stem and progenitor cell proliferation.
Although protocols on how to isolate mesenchyme from the mouse intestine are available, it is not clear whether these procedures allow the efficient isolation of telocytes. Isolating telocytes efficiently requires special protocol adjustments that would allow dissociation of the strong cell-cell contact between telocytes and neighboring cells without affecting their viability. Here, available intestinal mesenchyme isolation protocols were adjusted to support the successful isolation and culture of mesenchyme containing a relatively high yield of viable single-cell telocytes.
The obtained single-cell suspension can be analyzed by several techniques, such as immunostaining, cell sorting, imaging, and mRNA experiments. This protocol yields mesenchyme with sufficiently conserved antigenic and functional properties of telocytes, and can be used for several applications. For example, they can be used for co-culture with mouse- or human-derived organoids to support organoid growth with no growth factor supplementation, to better reflect the situation in the original tissue.

Here, we present a protocol to isolate murine intestinal mesenchyme, including telocytes. These can be used for several applications, such as co-culture with mouse or human-derived organoids, to support growth and better reflect the situation in the original tissue.

Isolamento do mesênquima intestinal murino resultando em alto rendimento de telócitos

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Isolamento e Caracterização de Fibroblastos Cardíacos Adultos e Miofibroblastos

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolamento de Miofibroblastos de Mouse e esôfago humano

Resumo

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Isolamento de CD 90+ fibroblastos / miofibroblastos de humanos congelados gastrointestinais Amostras

Produção, Caracterização e usos potenciais de uma mucosa esofágica Modelo 3D Human Tissue-engenharia

Isolamento de primárias Miofibroblastos de Mouse e tecido do cólon humano

Isolação adulta preliminar ultra-som-aumentada do fibroblasto

Modelos tridimensionais de cultura celular para investigar a barreira epitelial na esofagite eosinofílica

Modelos tridimensionais de cultura celular para investigar a barreira epitelial na esofagite eosinofílica

Modelos tridimensionais de cultura celular para investigar a barreira epitelial na esofagite eosinofílica

Isolamento e Cultura de Miofibra único de um modelo murino de distrofia muscular em emery-dreifuss no desenvolvimento pós-natal antecipado

Isolamento do mesênquima intestinal murino resultando em alto rendimento de telócitos

Isolamento e Caracterização de Fibroblastos Cardíacos Adultos e Miofibroblastos