この研究は、RGMにSLBとU54HD068157にNIHの助成金GM055360によってサポートされていました。 JMBはペンシルバニア大学（GM008216）でT32遺伝学研修助成金によって支えられている。

STA-PUTプロトコルは、3つの段階を含む：1）全体の精巣から細胞懸濁液の装置および試薬、2）準備、3）セルの負荷、沈降、およびフラクションコレクションのセットアップします。 2人の研究者のチームによって行われた場合に、プロトコルは、平均して8時間かかります。 1。 STA-PUT装置を設定します（図1） *** STA-PUT装置は、4℃、大規模な冷蔵庫やコレクションの方法を優先する場合にも、フラクションコレクターを収容することができ、低温室に配置する必要があります。 <ol><li>前（あるいは、少なくとも数時間前）には、メソッドを実行する夜は、すべての機器（特に、ガラス製品、チューブ）を洗って、70％エタノールで滅菌する。完全に、図1に示すような装置を組み立てる前に、機器を乾燥させる。 </li><li> （二L 2シリンダ（ 図 1BおよびC）および細胞装填室を確保<strオング&gt;図1A）トップのプラットフォームへとチューブクランプでチューブの2小片ですべてを接続してください。クランプすべての管が閉鎖した。右端の2Lのシリンダーに注ぎ口をシール。 </li><li>細胞装填室の小さな撹拌棒（ 図1A）、2％BSAを含むことになる左端の2 Lのシリンダ内のより大きな撹拌棒（ 図1B）を配置します。 </li><li>プラットフォーム（ 図1D）に2リットルの沈殿槽を配置します。沈殿槽（ 図1D）の下部の開口部の上に直接金属バッフル（ 図1F）を配置します。バッフルはフラクションコレクションの間の細胞勾配の液体と混乱のボルテックスを防ぐため、これは非常に重要です。沈殿槽の上にふたをする。 </li><li>三方活栓（ 図1G）のすりガラスジョイントに真空グリースを微量塗布した後、それ自体の底部にストップコックをクランプストップコックおよび沈降室のすりガラス継手を接続するdimentationチャンバ。 </li><li>チューブと活栓の右アウトレットに細胞装填室（ 図1A）を接続します。ストップコックを閉じます。 </li><li>活栓の左アウトレットに細胞分画チューブを取り付けます。分画チューブは開放端に接続されたガラスパスツールピペットを用いてチューブの一部を含む。小さなボアチューブ片をガラスピペットの狭い方の端に取り付けられている。狭いピペットは、フラクション回収時の細胞懸濁液の流れを制限する。一番下に、この小さなチューブをクランプする。 </li><li> 2 Lクレブスを準備（1X）の実験（ 表1）の日をバッファリング。その後、1Xクレブス、1Xクレブス中550ミリリットルの4％BSA、および1Xクレブス中の50ミリリットル、0.5％BSA中550ミリリットルの2％BSAを準備します。濾過し、4℃にこれらのソリューションを冷却</li><li>右L 2シリンダ（ 図1C）及び2％のBSA中の4％BSA溶液を注ぐ左2Lのシリンダ（ 図1B）内の溶液。必ずこれらのシリンダをつなぐチューブに大きな気泡がないことを確認。 </li><li>セル負荷室にKrebs緩衝を注ぎ、沈殿槽で、このチャンバーを接続する配管を埋め、これらは勾配を乱す可能性があるので、確認して大きな気泡が存在しないこと。優しくチューブを絞るか、フリックすると、気泡を除去するのに役立ちます。クレブス緩衝液のすべてがチューブ内ではなく、セル室にあることを確認します。 </li><li>クレブス緩衝液に少量の沈殿槽に流入した後、チューブを充填し、任​​意の大きな気泡を除去するために細胞分画チューブにほぼすべてのバッファを流出させる。 </li><li>直接沈殿槽の下にフラクションコレクターを配置します。すべての端数管が適切に配置され、汚染を防止するために、プラスチック製のラップで覆いいることを確認してください。 </li></ol> 2。全精巣から造精細胞を単離する<oL&gt; <li>あらゆる汚染物質を洗い流すために、室温でクレブス緩衝液中のCA 12成体マウス（好ましくは、少なくとも8週齢）および場所から精巣を解剖。例示されてこのプロトコルは、実験用マウスの使用を必要とするし、ペンシルベニア大学の制度的動物実験委員会のガイドラインに従って実行されました。 </li><li>あなたは精細管を追加する予定直前コニカルチューブ内の50ミリリットルKrebs緩衝液に45 mgのコラゲナーゼを追加します。このソリューションは、数分間33℃まで加熱することができます。 2 50ミリリットルコニカルチューブに均等に分割します。 </li><li>白膜を破棄し、精細管を解放し、8ミリリットルクレブス緩衝液を含有する別のプレートに精巣をカプセル解除。白膜は、精細管を包囲する薄い膜である。細管は容易に白膜からデタッチする必要があります。これを行うには、白膜の切開を行い、PAIでこの膜を開催鉗子のR、および鉗子の別のペアでから離れて膜から細管を押してください。 </li><li>コラゲナーゼ溶液25mlを含む各コニカルチューブに細管を含む4ミリリットルクレブス緩衝液を加え、10分間33℃で振とう、インキュベートする。最後には、細管は「スパゲッ​​ティ状」の外観を持っている必要があります。 </li><li>細管は、チューブの底に約5分間沈降することができます。上澄みを注ぐと細管をチューブの底に毎回沈降させ、（室温）25ミリリットルKrebs緩衝液で2倍を洗う。各チューブの中で〜5ミリリットルクレブス緩衝液を残す。 </li><li>洗いながら、あなたは精細管を追加する予定直前ファルコンチューブに50ミリリットルKrebs緩衝液に30mgのトリプシンを追加します。このソリューションは、数分間33℃まで加熱することができます。 2 50ミリリットルコニカルチューブに均等に分割します。 </li><li> 25ミリリットル細管を含む2チューブの各々にトリプシン溶液を加える。セルを防ぐために、各チューブに3μgのDNA分解酵素（1μg/10ml）を追加凝集からのS。 10分間33℃で、揺れ、インキュベートする。 </li><li>約10倍とアウトそれらをペッティング、細管を含む溶液を撹拌するワイドボアピペットを使用してください。ソリューションは、複数の単一細胞懸濁液のように見えるを開始する必要があります。 </li><li>さらに10分間33℃で、揺れ、インキュベートする。約25倍に出入りしてピペッティング、単一細胞懸濁液中に細管を分散させるために広い口径のピペットを使用してください。それでも細管あるいは細胞塊がたくさん表示された場合は、ピペットを用いてより多くの分散および/または、各チューブへの別の3100μgのDNA分解酵素（二重初期濃度）を追加します。 </li><li> 100μmのメッシュセルストレーナー（30ml mlの細胞懸濁液を各チューブに1つ）を介して単一細胞懸濁液をろ過する。細胞懸濁液を結合し、細胞の総数を（7-8×10 8個の細胞の間にあるべきである）カウントされます。 ***勾配上に以上800,000,000細胞をロードしないでください。 </li><li>ステップ2.10で得られた細胞数に基づいて、approprをペレットiate 5分間450 RCFでフィルタ処理する細胞の体積と30ミリリットルクレブス緩衝液で洗浄する。繰り返します。 ***通常22精巣は、複数の800,000,000の細胞が得られますが、この細胞の数を超えてセットしないでください。 </li><li>丁寧に泡立てない（細胞凝集の程度に応じて）DNA分解酵素μgの2.5〜5を含む25ミリリットルの0.5％BSAで細胞を懸濁します。細胞が凝集しないことを確認してください。 100μmのメッシュセルストレーナーを通して単一細胞懸濁液をろ過する。セルは現在、ロードする準備ができました。チューブを数回転倒ロードする前に、よく混ぜる。 </li></ol> 3。セル負荷および沈降<ol><li>必ずストップコックが閉じているが、液体沈降室（ 図1D）中に細胞チャンバ（ 図1A）から流れることを可能にする位置で行った。 </li><li>ゆっくりと攪拌棒が連続的に移動できるように設定を低（約70回転）の両方撹拌棒板を回しますが、。 </li><li>細胞チャンバ（ 図1A）内に細胞懸濁液を注ぎ、細胞を、10ml /分（ 図1D）のレートで堆積チャンバ内に徐々に流入するようにストップコックを開く。ストップコックを閉じます。流量は、堆積チャンバのボリュームの間隔をマークすることによって決定することができる。 </li><li>細胞チャンバ内に0.5％BSA溶液5mlを注ぎ、10ml /分の速度で沈殿槽に排出。ストップコックを閉じます。この工程は、細胞チャンバから細胞を洗浄します。 4Xを繰り返します。 </li><li>勾配を準備します。セル室（ 図1A）と2 2Lのボンベ（ 図1BとC）の間にクランプを開き、40ミリリットル/分の速度（ 図1D）で沈殿槽に液体を排出するために始めるすぐに。それが沈降室に、BSA勾配をロードするのに約20〜30分かかりますので、流量を調整します。の上に横たわっている細胞の薄い、乱されていない層BSAの勾配が表示されるはずです。 BSAのほとんどがロードされると、ストップコックを閉じ、液体は分別管内に沈殿槽から排出することを可能にする位置に回します。 </li><li>撹拌プレートをオフにします。 </li><li>細胞は1時間45分間沈降することができます。この時間の間に装置を乱すことがありません。任意の機械的攪拌は、グラデーションを乱す可能性があります。 </li></ol> 4。画分の分別と分析あなたは、次の手順を実行し、***、勾配を乱さないように注意してください。 BSA勾配が乱れている場合は、手順が動作しません！ <ol><li>細胞が沈殿した後、徐々に50ミリリットルコニカルチューブに沈殿槽から50ミリリットルを排出し、脇に置きます。この画分は、通常の細胞と破片の不要な塊が含まれています。 </li><li>フラクションコレクターに端数チューブを取り付けます。 ***フラクションコレならば手作業でフラクションを収集することも可能であるctorのは使用できません。 </li><li>画分を収集します。（1コレクションチューブに充填する）10ミリリットル毎45秒を収集されるように、ストップコックで流量を調整します。 </li><li>フラクションコレクションチューブに蓋をし、4℃で450 RCFで5分間スピン、そっと上澄みを捨て、残りの液体中に細胞を再懸濁し、氷上で細胞を維持する。 </li><li>すべての画分が収集されると、微視的に異なる細胞集団のための画分を分析する。異なる細胞型は、細胞サイズおよび核の形態8,15に基づいて区別することができる。 図2（a）は体細胞および減数分裂細胞および精原細胞について富化された3つのプールされた画分を、（b）は、円形精子細胞のための「代表的な結果」を示し、 （C）精子細胞を伸長と凝縮。 <ul><li>精原細胞を入力して12-14μmのCAのです。直径とクロマチン組成が均質で丸い核を持っている。 </li><li> B型精原8-9μmのCAのです。直径とrounている核周辺部に沿ってより密度の高いヘテロクロマチンを示してD核。 </li><li>前細糸期の精母細胞は7.5-8.2μmのCAです。直径、タイプB精原細胞より小さい細胞質を持っており、B型精原細胞と同様に見える核を持っている。 </li><li>細糸期精母細胞は、8月10日100μMのCAです。直径と事前細糸期の精母細胞と同様に見えますが、核膜でより密なクロマチンを得るように見える核を持っている。 </li><li>接合期精母細胞は、10月12日100μMのCAです。直径と細糸期精母細胞と同様に見える核を持っている。 </li><li>パキテン期の精母細胞は、任意の場所に12〜18ミクロンのCAからである。直径と大きな核を取り巻く細胞質の細いリムで構成されています。密なクロマチンのより多くの塊が核内で見ることができます。 </li><li>丸い精子細胞は、10μmCAです。直径と中央の密集染色染色中心と丸い核を持っている。 </li><li>残余体は直径〜6.5μmであり、円形で、核を欠いている。 </li><li>伸長と凝縮精子細胞は、精子細胞を丸める大きさが似ていますが、ユニークな、鎌形核を持っている。 </li></ul><ol><li>分15で始まり、85までのすべての5画分を分析。通常、15以下の画分をすぎて混合し、塊状となり、85以上の画分を、使用可能な細胞にいくつか含まれています。 </li><li>割合を分析するには、（細胞を遠心分離した後再懸濁されたら）画のコレクションチューブから液体5μlのを取り、クレブス緩衝液は8％ホルムアルデヒド5μlのに追加。固定した細胞は、5分間室温で静置する。 </li><li>固定した細胞を0.1％トリトンおよびDAPI（5μ/ mlのクレブス緩衝液）5μlのを追加します。細胞を、5分間室温で静置する。 </li><li> 、スライド上に得られた溶液を10μlを置きカバーガラスでカバーし、各画分の純度を決定するために、蛍光顕微鏡で分析します。 </li><li>減数分裂と体二倍体細胞、円形精子および伸長/凝縮する精子細胞：大きさや核の形態が類似している細胞の次の集団を作成する（「代表的な結果」を参照）の分画を結合します。 </li></ol></li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。例示されてこのプロトコルは、実験用マウスの使用を含む、すべての関連するガイドライン、規制、規制当局に準拠して実行されました。このプロトコルで使用される動物は、ペンシルベニア大学の施設内動物管理使用委員会（IACUCプロトコル番号804284）の指導と承認の下で維持されている。

信頼性の高い細胞培養系は、まだすべての精子形成細胞タイプ3を生成するために存在していないとして、精子形成を研究者たちは、精子形成細胞サンプルのための動物モデルに依存しています。精子形成細胞が容易に全体の精巣から収集しているが、唯一の混合集団をもたらす。これは、減数分裂細胞、円形精子、と凝縮精子細胞など、これらの細胞の特定のサブタイプを、勉強し?...

哺乳類の精子形成は精巣1の精細管にいくつかの段階で発生する複雑な分化過程である。簡単に言うと、精細管の格差の上皮の近くに存在する精原細胞のような幹、その後減数分裂を起こす精母細胞に分化。減数分裂が完了した後、得られた半数体細胞、または円形精子細胞は、精子、細胞質及び核の圧縮の脱落を伴う分化プロセスを受ける。精子細胞は徐々に、それぞれ、鞭毛を開発し、核の伸びや、結露を起こし、伸長してから凝縮する精子細胞を生成する。最終製品は、精細管の内腔に放出され、最終的に、彼らは、さらに成熟精巣上体にしている精子、です。 精子形成のプロセスは、特殊なホルモンや分子の状態に依存しているため精巣は、精子形成の全過程のための信頼できるインビトロ培養系は、まだ2,3開発されていない。培養方法は、幹細胞から「始原生殖細胞様細胞」および半数体、「円形精子細胞様細胞」を作成するために開発されてきたが、これらの方法はまだ、これらの細胞を大量に生成し、それ以降の精子形成細胞を生成するために失敗することができない種類4,5。幸いなことに、精子細胞型は液体勾配で分離されるべき全体の精巣から得られた単一細胞懸濁液を可能にする、サイズが大きく異なる。 STA-PUTメソッドは、ここに証明し、大きさや質量6-9に基づいて精子形成細胞を分離するための直線のBSA勾配とシンプルな沈降を使用しています。 FACSおよび水簸10-13：STA-PUT方法は精子形成細胞タイプを分離する他の二つの最も広く使用されている方法に勝るいくつかの利点を有する。 STA-PUT装置は、ONLが必要です寒い部屋や大きな冷蔵庫に組み立て専門のガラス器のY数枚。このように、セルソーター又は水簸機を使用するよりも安価である。 STA-PUT方法は、各細胞集団の純度はFACS 11で得られたものほど高くはないが、匹敵する時間枠内FACSによってソートすることができるよりも、細胞型および精巣あたりの細胞のより高い量をもたらす。磁気ビーズを用いて細胞選別（ソーティング磁気活性化細胞、MACS）は最近成功した混合精巣細胞集団から精原細胞の濃縮のために用いられてきたが、現在による適切な表面マーカー14についての知識の欠如のために精母細胞または精子細胞を分離するには不向きである。 MACSまたはFACSオーバーSTA-PUT方法のさらなる利点は、ほとんどのFACSプロトコルとは対照的に、それは任意のDNA染色又は他のタイプを必要としないので、その後の培養に適した生存可能な細胞を単離する能力である。 Lを必要とする研究のため精子形成細胞の種類のアーゲ収率は約90％の純度で、STA-PUTは、理想的な方法である。

<table><tbody><tr><td>BSA</td><td>Affymetrix/USB</td><td>10857 100MG</td><td>Alternate can be used.</td></tr><tr><td>0.5%, 2%, and 4% BSA solutions</td><td>Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively).</td><td>To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td><td></td></tr><tr><td>KREBS (10x)</td><td>3.26 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;/7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td><td>Autoclave/filter and store at 4 &amp;deg;C for several months.</td><td></td></tr><tr><td>KREBS (1x)</td><td>Dissolve 4.24 g NaHCO&lt;sub&gt;3 &lt;/sub&gt;in 100 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0.</td><td>To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma</td><td>C9891-1G</td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>DNEP-5MG</td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T9201-1G</td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde (~37%)</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TABLE 2: EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td>Company</td><td>Catalog #</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Complete STA-PUT apparatus</td><td>ProScience Glass Shop</td><td>STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500)</td><td>Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers.</td></tr><tr><td>10 &amp;mu;m mesh filter</td><td>Fisherbrand</td><td>22363549</td><td> </td></tr><tr><td>Mouse dissection tools</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>14 ml round bottom fraction collection tubes with caps</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Need approximately 100 tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fraction collector</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40</td><td>Alternate can be used.</td></tr><tr><td>Microscope slides, cover glass</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light/Fluorescent Microscope</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

separation of spermatogenic cell types using sta-put velocity sedimentation

哺乳類の精子形成は、精巣の精細管にいくつかの段階で発生する複雑な分化過程である。現在のところ、 インビトロでの精子形成の分化を可能にする信頼性のある細胞培養系がなく、精子形成細胞のほとんどの生物学的研究は、マウスおよびラットのような動物モデルからの組織採取を必要とする。非精子形成（ライディッヒ、セルトリ、骨髄、および上皮細胞）および精子形成の両方（精原細胞、精母細胞、円形精子細胞、精子細胞および精子を凝縮） - - 精巣は多数の細胞型が含まれているため、精子形成に関与する生物学的メカニズムの研究を隔離を必要とするこれらの異なる細胞型の富化。この場合、精巣から - - BSA線形勾配を介してSTA-PUT方法は、不均一な細胞集団の分離を可能にする。個々の細胞型は、CEのに応じて異なる沈降速度で沈降llのサイズ、および異なる細胞型について富化画分を回収し、さらなる分析に利用することができる。 STA-PUT方法は、特定の細胞選別法を用いて得ることができるように、 例えば、細胞型の高純度画分をもたらさないが、各画分中の全細胞のより高い収量を提供しない （7-8×10 8細胞の出発集団から〜1×10 8個/精子形成細胞型）。この高い収率メソッドは特殊なガラス容器を必要とし、蛍光活性化セルソーター（FACS）又は水簸機等の特殊な装置へのアクセスが限られているラボのための理想的な方法で製造する、任意の低温室又は大冷蔵庫で行うことができる。

STA-PUTプロシージャから理想的な結果は、細胞の大きさおよび密度に基づいて、精巣からの細胞のかなり目立つ分離である。精巣から単離された細胞は、BSA勾配を介して沈降しているが、細胞のいくつかの別個のバンドが観察することができる。セルのいずれか塊は勾配の底に沈むようにし、他の画分を汚染しない傾向があります。もう少し勾配までは、大規模な体細胞および減数分裂細胞?...

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Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

STA-PUTメソッドは、大きさや密度に基づいて精子形成細胞の異なる集団の分離を可能にする。

STA-PUTの速度沈降を使用して造精細胞型の分離

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

separation-spermatogenic-cell-types-using-sta-put-velocity

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

25.7K ビュー.  University of Pennsylvania.  STA-PUTメソッドは、大きさや密度に基づいて精子形成細胞の異なる集団の分離を可能にする。 

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Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

フローサイトメトリーによるマウス精子細胞のステップ固有のソート

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

発生生物学

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

機械的組織解離およびフローサイトメトリーによる哺乳動物雄胚細胞のマルチシード精製のための標準的アプローチ

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

精細管スカッシュ マウス モデルを用いた精子の細胞学的解析法

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

標準的な実験装置を用いてマウス精巣からパチテン精子細胞と精子を濃縮

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established cell isolation protocols using Hoechst 33342 staining in combination with fluorescence-activated cell sorting, it requires cell sorters equipped with an ultraviolet laser. Here we describe a cell isolation protocol using the DyeCycle Violet (DCV) stain, a low cytotoxicity DNA binding dye structurally similar to Hoechst 33342. DCV can be excited by both ultraviolet and violet lasers, which improves the flexibility of equipment choice, including a cell sorter not equipped with an ultraviolet laser. Using this protocol, one can isolate three live-cell subpopulations in meiotic prophase I, including leptotene/zygotene, pachytene, and diplotene spermatocytes, as well as post-meiotic round spermatids. We also describe a protocol to prepare single-cell suspension from mouse testes. Overall, the procedure requires a short time to complete (4-5 hours depending on the number of needed cells), which facilitates many downstream applications.

Here we present a simple and efficient method to isolate live meiotic and post-meiotic germ cells from adult mouse testes. Using a low-cytotoxicity, violet-excited DNA binding dye and fluorescence-activated cell sorting, one can isolate highly enriched spermatogenic cell populations for many downstream applications.

バイオレット励起細胞透過性DNA結合色素を用いたマウス精子細胞の分離

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

生物学

<meta charset="utf8"></head><body>胚発生を研究するためのマウスラウンド精子細胞注入手順

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>マウスラウンド精子細胞注射

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

マウスラウンド精子細胞注射

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

精巣細胞懸濁液の調製のためのシンプルで効率的な手法

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

STA-PUTの速度沈降を使用して造精細胞型の分離

要約

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フローサイトメトリーによるマウス精子細胞のステップ固有のソート

機械的組織解離およびフローサイトメトリーによる哺乳動物雄胚細胞のマルチシード精製のための標準的アプローチ

精細管スカッシュマウスモデルを用いた精子の細胞学的解析法

標準的な実験装置を用いてマウス精巣からパチテン精子細胞と精子を濃縮

バイオレット励起細胞透過性DNA結合色素を用いたマウス精子細胞の分離

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

マウスラウンド精子細胞注射

マウスラウンド精子細胞注射

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精巣細胞懸濁液の調製のためのシンプルで効率的な手法

STA-PUTの速度沈降を使用して造精細胞型の分離

要約

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フローサイトメトリーによるマウス精子細胞のステップ固有のソート

機械的組織解離およびフローサイトメトリーによる哺乳動物雄胚細胞のマルチシード精製のための標準的アプローチ

精細管スカッシュ マウス モデルを用いた精子の細胞学的解析法

標準的な実験装置を用いてマウス精巣からパチテン精子細胞と精子を濃縮

バイオレット励起細胞透過性DNA結合色素を用いたマウス精子細胞の分離

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

マウスラウンド精子細胞注射

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精巣細胞懸濁液の調製のためのシンプルで効率的な手法

精細管スカッシュマウスモデルを用いた精子の細胞学的解析法