この作業のための資金はBFBSに成長アイオワ値基金賞によって提供されていました。

1。滅菌粘着テープで表面のサンプリング<ol><li>サンプリングに使用するテープを選択します。市販のカビ - テープまたはCON -タクト - それはサンプリングのテープは、使いやすさのための滅菌と特別にパッケージされている。しかし、我々は、透明（光学的に透明な）一般的なオフィスのテープも使用できることを見出した。 </li><li>粘着テープの10cmの部分（紙のテンプレートを使用することができる）の非粘着面に1cm 2の正方形を描画するための恒久的なマーカーを使用してください。これは、テープの一部が、食品または環境表面をサンプリングするために使用されている注目のための視覚的なガイドとして機能します。 </li><li>サンプリングする面に対向する粘着面とテープの&quot;C&quot;字型のループを形成。これを行うには、テープの背面に描かれた四角（非粘着面）（図1）に対して、親指と中指と位置と粘着末端の人差し指を保持する。 </li><li>サンプリングされる表面にテープを置き、軽く表面に対してマークされた領域を押してください。テープの端を放出することなく、テープの粘着面は気泡を避け、試料表面と完全に接触することを保証するために人差し指を使う。 </li><li>さらにモーションを使用して、徐々に物理的に表面結合微生物を抽出し、離れてサンプルからテープを引き出します。一般的な透過的なオフィスのテープを使用してガラスの顕微鏡スライド上に、セルチャージャーテープ、粘着面を固定します。フラット、非しわになりやすい面が作成されるよう、テープの適切なテンション/ストレッチングを確認してください。これは変形/ハイブリダイゼーションの間その後の加熱中にテープのカールの問題を最小限に抑えることができます。 </li></ol> 2。固相濃縮および液面Miniculture <ol><li>固体相の濃縮は、サンプリングされた細胞を寒天表面に直接接触して配置されるようにキシロース-リジン-タージトール4（XLT - 4）寒天プレート上に直接フェースダウンテープを置くことによって行われます。テープのテンプレート/サンプルの接触部は、寒天の表面とテープの一端が緩く濃縮に続く寒天表面からテープを簡単に除去を容易にするために、ペトリ皿の側壁に付着さと同じ高さに配置されます。 </li><li>プレートを反転（結露を避けるために）と35℃でインキュベートされる- 37℃のサルモネラの十分な成長を可能にする。検出可能なレベルに細胞を豊かにするために必要な潜伏期間の長さは初期のサルモネラ汚染レベルに依存します。我々は8時間の濃縮後に低い初期接種から優れた微小コロニー形成を観察した。 </li><li>希望の濃縮期間の後、寒天プレートを開きます。テープは、インキュベーション中に、その粘着性を保持します。ゆっくりとテープ寒天界面に形成microcoloniesの最大回収を確実にするために人差し指を使って寒天に対してテープを押してください。ペトリ皿の壁に取り付けられた端からテープをつかみ、ゆっくりと、さらに動きでそれを削除してください。上記のセクション1.5で説明したように顕微鏡スライド上に細胞チャージャーテープ、最大粘着面を、マウントします。以下&quot;固定と脱水&quot;の手順に進みます。 </li><li>液面minicultureの場合、上記のセクション1.5で説明したように顕微鏡スライド上にサンプリングに使用されるテープを固定することから始めます。次に、底部上を向いて、細胞に帯電したテープから構成されている密封されたチャンバを形成する非無菌シリコン灌流チャンバー（Coverwell、グレースバイオ研究所、（株））とテープのテンプレート化/サンプルの接触部を、カバーしています。しっかりと、かつ慎重に防水シールを確保するためにチャンバーを押してください。 </li><li>柔軟なゲルローディングピペットチップ、室の小さな入口ポートのいずれかを経由して転送≤500μLトリプチケースソイブロスまたは他の適切な増菌培地を使用する。 35 -37で蒸発し、インキュベートするスライドを防ぐために透明なオフィステープで両方のポートを密封° Cに十分な濃縮のために必要に応じて。すべての操作が良好なサンプリングと処理の慣行にしたがって行われるべきですが、ポートシールテープまたは灌流室の無菌性は、液面のminiculture時に必須ではありません。 FISHとフローサイトメトリーの組み合わせは、 サルモネラ属の明確な差別が可能になります。サンプル自体から来ると予想非標的植物の最大の貢献と、存在する可能性がある非標的細菌から。以下&quot;固定と脱水&quot;の手順に進みます。 </li></ol> 3。固定と脱水<ol><li>直接表面のサンプリング用やサルモネラの固相濃縮のための。 XLT - 4寒天上、25℃で30分間細胞を固定、テープの上で実行〜500μLをサンプルの接触面積をカバーすることによりC 10％中性緩衝化ホルマリン。 </li><li>密閉式容器内に固定液を捨て（化学フードの下毒性/刺激性の蒸気への曝露を最小限にするため）。 </li><li>エタノール系列で脱水し（50％、80％、95％、300μL/ 3分ごとに濃度）。下記の&quot;ハイブリダイゼーション&quot;の手順に進みます。 </li><li> 500μLの液面のminicultureのサンプルの固定用の、潅流チャンバーが開封され、かつ柔軟なゲルローディングピペットチップはenrichateを抽出するために使用されます。上下に迅速なピペッティングが、残りのテープ結合細胞の効果的な除去を保証するために使用されます。 </li><li>次に、全体の500μLminiculture量は微量遠心チューブに移し、2,000 × gで（5分）でスピンダウンしています。上清は廃棄され、ペレットは、10％の等量に再懸濁し、30〜60秒間激しくボルテックスれる中性緩衝ホルマリン。細胞を25℃で30分のために固定されています</li><li>次に、固定液が除去され、サンプルは次のように、細胞の保存バッファーに再懸濁する。 60秒、50％非変性エタノール50％の等量に再懸濁し、リン酸 - サンプルは、2,000 × gで（5分、25℃）上清を捨てている、ペレットを30を激しくボルテックスしている時にスピンダウンしている緩衝生理食塩水。固定された細胞は-20℃で（年間）無期限に保存することができます注意：液体が（例えば、固定液または別のバッファを導入する際に）変更されるたびに、それは（ボルテックスで）完全に再懸濁させることが重要である最小限の部分（〜10から20μL）で細胞ペレット&quot;発信&quot;液体のシステムの。これは、凝集を防止し、個々のセルの偶数濁液が得られることを確認するのに役立ちます。下記の&quot;ハイブリダイゼーション&quot;の手順に進みます。 </li></ol> 4。交配<ol><li>材料表に記載されている商用分子生物学グレードのソリューションを用いてハイブリダイゼーション/洗浄バッファーを準備します。最後のバッファ成分の濃度は、0.7MのNaCl、0.1 Mトリスは[pHを8.0]、10mMのEDTA、0.1％ドデシル硫酸ナトリウムは、分子のグレードの水と最終的な目的のボリュームに構成し、0.22μmのシリンジやカップのフィルターを使用してフィルタリングされます。プローブを添加していない同一のバッファは、（下記参照）、洗浄バッファーとして使用されます。 〜55の予熱ハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファー℃の</li><li>蛍光標識追加Sal3（Nordentoft ら、1997;。5&#39; - AAT CAC TTC ACC TAC GTG - 3&#39;）とザルム- 63（クッターら、2006;。5&#39; - TCG ACT GAC TTC AGC TCC - 3&#39;予熱したハイブリダイゼーションバッファーに）オリゴヌクレオチドプローブ（材料表）。 5 ngのμL-1の合計プローブ濃度は、（;碧砂とブレーム-ステッチャー、2009A 2.5 ngのμL-1各プローブなど）が使用されます。 </li><li>直接テープへと固相濃縮サンプルについては、プローブのカクテルを含むハイブリダイゼーション緩衝液300μlでテープのテンプレート化サンプルの接触面積をオーバーレイし、55℃に設定されて湿った、密封されたインキュベーションチャンバーにテープ結合細胞をハイブリダイズスライドモート機器（材料表）などの直接接触インキュベーターが使用されている場合、サンプルは15分間ハイブリダイズされ、&gt; 20枚のスライドを同時に処理することができます。このようなバンビーノ機器（材料表）のような回転式のハイブリダイゼーションオーブンを使用している場合、スライドはハイブリダイゼーション用の50 mLのポリプロピレン遠心チューブ、チューブごとにスライドに配置されます。熱伝達が直接ではないため、これらのサンプルは、より長い期間（最長30分）にハイブリダイズさせる。 </li><li>ハイブリダイゼーション後、スライドが削除され、プローブを含むハイブリダイゼーションバッファーのオーバーレイは破棄されます。スライドは、予熱した洗浄バッファのオーバーレイまたはいずれかとし（最大30分）のどちらか簡潔に、ゆっくりと傾斜スライド（300μL、それぞれの3リンス）を介してバッファの小さなボリュームをピペッティングすることにより予熱洗浄バッファーですすぎ、または正式に洗浄しています予熱した洗浄バッファーを含む50 mLポリプロピレン製遠心チューブに浸漬。我々の経験では、正式な洗浄が改善された結果を（非連結プローブから以下ヘイズ）を提供しますが、簡単なリンスはサルモネラ属の明確な検出に適しています。次に、スライドの下に&quot;検出&quot;のステップに移る前に空気乾燥する。 </li><li>液面のminicultureサンプルのハイブリダイゼーションは、積極的なペレットのボルテックスとを含む100μL予熱したハイブリダイゼーションバッファーに再懸濁し、続いて2000 × gで5分間（-20℃でたての固定または記憶バッファに保持されている）サンプルをスピンダウンして実行されます。プローブのカクテル。サンプルは55℃でハイブリダイズしている500℃μL予熱した洗浄バッファーを添加し、続いてヒートブロックまたは他の適切なインキュベーションの駅（材料表）、上で30分間。テープバウンドサンプルと同様に、これらのサンプルは、正式に断続的にボルテックスしながら55℃でさらに培養して30 minでこの洗浄バッファーでC、にのためにまで洗浄することができる。また、サンプルは徹底的に分析するための即時の収穫（下）に続いて、500μL予熱した洗浄緩衝液の添加後ボルテックスすることができます。 </li><li> サルモネラ属菌を検出するための準備に。フローサイトメトリーを経由して、液面のminicultureのサンプルは5分2,000 xgでスピンダウンしている、上清を捨て、サンプルは300μL室温に再懸濁している（〜25℃）PBS。サンプルは遠い施設への輸送が必要な場合は遅延がハイブリダイゼーションと解析との間で期待されている場合、または、サンプルは前のANAに冷蔵または氷の上で開催することができる溶解。また、サンプルは、細胞の保存バッファー（PBSと無水エタノールの50:50混合物）に転送し、でかなりの損失のない週までは-20℃で保持することができるプローブ与え蛍光（碧砂とブレーム - ステッチャー、2009B） 。 </li></ol> 5。検出<ol><li> サルモネラ属の上にテープを検出するため。蛍光顕微鏡を介して、テープに直接または固相濃縮サンプルは、核の対比4を含む〜10μLVectashield H - 1200封入剤&#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）、カバースリップをマウントした、と重ねてその後、10分間暗所でインキュベートした。 </li><li>液浸油は、カバースリップ上に配置され、そしてサンプルは、高倍率の油浸対物（63xまたは100倍）を用いて検討されています。 DAPIフィルターが焦点に試料をもたらすために使用されている、顕微鏡は、適切なフィルターに切り替えられます（緑または赤、エンドラベルプローブするために使用される染料に応じて）およびサルモネラの細胞は、それらの蛍光（図にしたがって視覚的に採点されます2と3）。 </li><li>液面のminicultureサンプルのサイトメトリー検出のために、様々な楽器がローカル可用性に応じて、使用することができます。私たちの研究室では、PBSに懸濁した検体を5 mLの丸底サンプリングチューブ（BDファルコン）に移し、647 nmの（材料表）で励起したFACSCantoフローサイトメーターを用いて検討している。合計細菌の高い数字を含む豊かなサンプルについては、&quot;低流量&quot;の設定は（10μL分-1）が使用されますと5,000-50,000イベントが収集されます。データはFlowJoソフトウェア（バージョン8.8.6、ツリースター社、オレゴン州アッシュランド）または他の適切な解析ソフトウェア（図4、パネルAおよびB）を用いて分析されています。 </li></ol> 6。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。 サルモネラ属菌のサンプリングのために粘着テープを使用してください。人為的に汚染されたトマトの表面から。 <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。直接テープへのサンプリングとトマトの表面（100 Xの油浸対物）からネズミチフス菌 ATCC 14028の魚群探知のための典型的な結果。テキサスレッドでラベルされたプローブ（Sal3/Salm-63）の2プローブのカクテルが使用されたこれらの細胞を標識する。 <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。キシロースリジンタージトール- 4（XLT - 4）37℃8時間のオンテープ濃縮℃、後の寒天の表面に形成されたネズミチフス菌 ATCC 14028のMicrocoloniesは初期接種は人工的に汚染されたトマトの表面から採取した。固相濃縮、検出のために利用可能な細胞数が増加し、また、細胞rRNAの内容を向上させます。 <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。 S.のサンプリングのための粘着テープの使用FISHとフローサイトメトリー（パネル）を介して、または500μLのトリプチケースソイブロス（パネルBで満たされた灌流チャンバ内で5時間の非選択的液面minicultureの濃縮後に直接分析に続いて人工的に汚染されたトマトの表面からenterica血清型ネズミチフス菌、 ）。

<ol>
	<li>Almeida, C., Azevedo, N. F., Fernandes, R. M., Keevil, C. W., Vieira, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+method+using+a+peptide+nucleic+acid+probe+for+the+identification+of+Salmonella+spp.+in+a+broad+spectrum+of+samples.">Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for the identification of Salmonella spp. in a broad spectrum of samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 4476-4485 (2010).</li><li>Barnetson, R. S., Milne, L. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+sampling+for+Candida+with+adhesive+tape.">Skin sampling for Candida with adhesive tape.</a> Br. J. Dermatol. 88, 487-491 (1973).</li><li>Bisha, B., Brehm-Stecher, B. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+fluorescence-labelled+oligonucleotide+probe+targeting+23S+rRNA+for+in+situ+detection+of+Salmonella+serovars+in+paraffin-embedded+tissue+sections+and+their+rapid+identification+in+bacterial+smears.">Evaluation of a fluorescence-labelled oligonucleotide probe targeting 23S rRNA for in situ detection of Salmonella serovars in paraffin-embedded tissue sections and their rapid identification in bacterial smears.</a> J. Clin. Microbiol. 35, 2642-2648 (1997).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

農産物表面の病原体の検出のための簡単​​かつ迅速な方法は、タイムリーで実用的なデータを提供することにより、食品媒介疾患の軽減に役立つことがあります。粘着テープベースのサンプリング方法は1950年代から、環境への臨床的および食品微生物学で使用され、直接顕微鏡検査またはのための固体培地に付着した微生物の移転に続いて、微生物の除去のために表面に&quot;スコッチ&quot;...

<table><tbody><tr><td>Fungi-Tape sampling tape</td><td>Scientific Device Laboratory</td><td>745</td><td>http://www.scientificdevice.com/</td></tr><tr><td>Con-Tact-It sampling tape</td><td>Birko Corporation, Denver, CO</td><td></td><td>http://www.birkocorp.com/</td></tr><tr><td>Clear office tape, generic</td><td>Various</td><td></td><td>Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence</td></tr><tr><td>Food surface</td><td>Local Grocery Store</td><td></td><td>Tomat&amp;#8211;s (red tomat&amp;#8211;s on the vine, not waxed or oiled) used here</td></tr><tr><td>Trypticase Soy Broth</td><td>Difco Laboratories</td><td>211768</td><td>For non-selective liquid surface miniculture enrichment</td></tr><tr><td>Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base</td><td>Difco Laboratories</td><td>223420</td><td>For &lt;em&gt;Salmonella&lt;/em&gt;-selective agar (XLT-4)</td></tr><tr><td>Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement</td><td>Difco Laboratories</td><td>235310</td><td>For&lt;em&gt; Salmonella&lt;/em&gt;-selective agar (XLT-4)</td></tr><tr><td>Formalin solution </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5011</td><td>10% solution, neutral, buffered (cell fixative)</td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration)</td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td><td>Various</td><td></td><td>RNase- and DNase-free</td></tr><tr><td>Microscope slides and cover slips</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5150</td><td>Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component)</td></tr><tr><td>Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component)</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td>10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component)</td></tr><tr><td>Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified</td></tr><tr><td>Variable speed microcentrifuge</td><td>Various</td><td></td><td>Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol</td></tr><tr><td>CoverWell perfusion chamber </td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td>PC1R-2.0</td><td>Non-sterile</td></tr><tr><td>Gel loading pipette tips (FS MultiFlex)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>05-408-151</td><td>Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber</td></tr><tr><td>Aluminum heat block or precision-controlled heating station</td><td>Various</td><td></td><td>Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here</td></tr><tr><td>Bambino mini hybridization oven</td><td>Boekel Scientific</td><td>Model 230300</td><td>Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct</td></tr><tr><td>Slide Moat slide hybridizer</td><td>Boekel Scientific</td><td>Model 240000</td><td>Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide</td></tr><tr><td>Vectashield H-1200 mounting medium with 4&amp;rsquo;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Various</td><td></td><td>Leitz Laborlux S used here</td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>Various</td><td></td><td>Canon PowerShot A640 camera used here</td></tr><tr><td>Image acquisition software</td><td>Various</td><td></td><td>Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td>For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels)</td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>Various</td><td></td><td>FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used</td></tr><tr><td>Flow cytometry analysis software</td><td>Various</td><td></td><td>FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used</td></tr></tbody></table>

combination of adhesive-tape-based sampling and fluorescence in situ hybridization for rapid detection of salmonella on fresh produce

このプロトコルは、 サルモネラの迅速なカルチャに依存しない検出のためのin situハイブリダイゼーション（FISH） でオンテープ蛍光続いてトマトや他の生鮮食品の表面の粘着テープベースのサンプリングのためのシンプルなアプローチを、説明します。セル充電されたテープは、検出前に固相濃縮のための選択寒天培地に直接フェースダウンに配置することができます。また、少量の液体富化（液面のminiculture）はフローサイトメトリーを経由してFISHと分析に続いて、非選択培養液中のテープの表面に行うことができます。開始するには、無菌の粘着テープが新鮮な農産物と接触させ、物理的にこれらの表面上に存在する微生物を抽出し、穏やかな圧力が適用され、テープが削除されます。テープは、顕微鏡用スライドガラスの上にまで粘着側にマウントされ、サンプリングされた細胞を、10ホルマリン％（30分）と段階的エタノールシリーズを用いて脱水（50、80、および95％、3分ごとの濃度）で固定されています。次に、細胞に帯電したテープは、 サルモネラをターゲットとしたDNAプローブのカクテルを含むバッファーでスポットし、15でハイブリダイズさせる- 55℃で30分間、非結合プローブを除去するための洗浄バッファーでリンス短いが続く。接着、FISH -標識細胞は、蛍光顕微鏡を使用して表示しているDNA色素4&#39;,6 -ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）との結果で対比されています。固相濃縮するために、細胞に帯電したテープは、適当な選択寒天の表面に直接フェースダウン配置され、 サルモネラ microcoloniesのその場成長に許可するようにインキュベートし、上記のようFISHと顕微鏡が続きます。液面minicultureの場合は、セルに帯電したテープは、粘着面を上に配置され、シリコン灌流チャンバーが適用されているので、テープや顕微鏡のスライドの形防水チャンバー内の底部トリプチケースソイの小さい容積（≤500μL）ブロス（TSB）が導入されています。入口ポートは封印されており、チャンバーを35℃でインキュベートされる - 37 ° C、テープ抽出した微生物の増殖ベースの増幅を可能にする。インキュベーション後、入口ポートが開封され、細胞が分離し、混合精力的なバックで前後にピペッティング、遠心分離を介して収穫し、10％で固定されている中性緩衝ホルマリン。最後に、サンプルをハイブリダイズし、 サルモネラ属菌の存在を明らかにするためにフローサイトメトリーを介して検査されます。ここで説明したように、私たちの&quot;テープ- FISH&quot;のアプローチは、シンプルかつ迅速なサンプリングとトマトの表面のサルモネラの検出を提供することができます。我々はまた、ほうれん草とハラペーニョペッパーを含む生鮮食品の他のタイプを、サンプリングするためのこのアプローチを使用している。

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Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

このプロトコルは、急速な細胞全体の検出に続いてトマトや他の生鮮食品の表面のサンプリングのための簡単​​な粘着テープベースのアプローチを、説明して<em&gt;サルモネラ</em&gt;蛍光を使用して<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）。

粘着テープベースのサンプリングと蛍光の組み合わせその場で</emの迅速検出のための>ハイブリダイゼーションサルモネラ生鮮食品について

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

combination-adhesive-tape-based-sampling-fluorescence-situ

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

12.9K ビュー.  Colorado State University. このプロトコルは、急速な細胞全体の検出に続いてトマトや他の生鮮食品の表面のサンプリングのための簡単​​な粘着テープベースのアプローチを、説明してサルモネラ蛍光を使用してその場でハイブリダイゼーション（FISH）。

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Tracking Microbial Contamination in Retail Environments Using Fluorescent Powder - A Retail Delicatessen Environment Example

Cross contamination of foodborne pathogens in the retail environment is a significant public health issue contributing to an increased risk for foodborne illness. Ready-to-eat (RTE) processed foods such as deli meats, cheese, and in some cases fresh produce, have been involved in foodborne disease outbreaks due to contamination with pathogens such as Listeria monocytogenes. With respect to L. monocytogenes, deli slicers are often the main source of cross contamination. The goal of this study was to use a fluorescent compound to simulate bacterial contamination and track this contamination in a retail setting. A mock deli kitchen was designed to simulate the retail environment. Deli meat was inoculated with the fluorescent compound and volunteers were recruited to complete a set of tasks similar to those expected of a food retail employee. The volunteers were instructed to slice, package, and store the meat in a deli refrigerator. The potential cross contamination was tracked in the mock retail environment by swabbing specific areas and measuring the optical density of the swabbed area with a spectrophotometer. The results indicated that the refrigerator (i.e. deli case) grip and various areas on the slicer had the highest risk for cross contamination. The results of this study may be used to develop more focused training material for retail employees. In addition, similar methodologies could also be used to track microbial contamination in food production environments (e.g.&#160;small farms), hospitals, nursing homes, cruise ships, and hotels.

The overall goal of this study was to demonstrate the potential cross contamination mechanism of foodborne pathogen Listeria monocytogenes in a retail deli setting. This methodology may be applied to a variety of different environments to track pathogen contamination. &#160;

蛍光粉を使用した小売環境における微生物汚染を追跡する - 小売デリカ環境の例

Cross contamination of foodborne pathogens in the retail environment is a significant public health issue contributing to an increased risk for foodborne ...

環境学

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of agricultural waters. Here, water is filtered through sterile Modified Moore Swabs (MMS), which consist&#160;of a simple gauze filter enclosed in a plastic cartridge, to concentrate bacteria. Following filtration, non-selective or selective enrichments for the target bacteria are performed in the MMS. For colorimetric detection of the target bacteria, the enrichments are then assayed using paper-based analytical devices (&#181;PADs) embedded with bacteria-indicative substrates. Each substrate reacts with target-indicative bacterial enzymes, generating colored products that can be detected visually (qualitative detection) on the &#181;PAD. Alternatively, digital images of the reacted &#181;PADs can be generated with common scanning or photographic devices and analyzed using ImageJ software, allowing for more objective and standardized interpretation of results. Although the biochemical screening procedures are designed to identify the aforementioned bacterial pathogens, in some cases enzymes produced by background microbiota or the degradation of the colorimetric substrates may produce a false positive. Therefore, confirmation using a more discriminatory diagnostic is needed. Nonetheless, this bacterial concentration and detection platform is inexpensive, sensitive (0.1 CFU/ml detection limit), easy to perform, and rapid (concentration, enrichment, and detection are performed within approximately 24&#160;hr), justifying its use as an initial screening method for the microbiological quality of agricultural water.

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (&#181;PAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.

比色検出の紙ベース<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt;<em&gt;サルモネラ</em&gt;属、および<em&gt;リステリア菌</em&gt;農業大量の水から

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

Detection of Foodborne Bacterial Pathogens from Individual Filth Flies

There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a particular foodborne illness outbreak has been challenging. This is because insects are not being aseptically collected as part of an environmental sampling program during foodborne outbreak investigations and because there is not a standardized method to detect foodborne bacteria from individual insects. To take a step towards solving this problem, we adapted a protocol from a commercially available PCR-based system that detects foodborne pathogens from food and environmental samples, to detect foodborne pathogens from individual flies.Using this standardized protocol, we surveyed 100 wild-caught flies for the presence of Cronobacter spp., Salmonella enterica, and Listeria monocytogenes and demonstrated that it was possible to detect and further isolate these pathogens from the body surface and the alimentary canal of a single fly. Twenty-two percent of the alimentary canals and 8% of the body surfaces from collected wild flies were positive for at least one of the three foodborne pathogens. The prevalence of Cronobacter spp. on either body part of the flies was statistically higher (19%) than the prevalence of S. enterica (7%) and L.monocytogenes (4%). No false positives were observed when detecting S. enterica and L. monocytogenes using this PCR-based system because pure bacterial cultures were obtained from all PCR-positive results. However, pure Cronobacter colonies were not obtained from about 50% of PCR-positive samples, suggesting that the PCR-based detection system for this pathogen cross-reacts with other Enterobacteriaceae present among the highly complex microbiota carried by wild flies. The standardized protocol presented here will allow laboratories to detect bacterial foodborne pathogens from aseptically collected insects, thereby giving public health officials another line of evidence to find out how the food was contaminated when performing foodborne outbreak investigations.

A PCR-based protocol was adapted to detect Cronobacter spp., Salmonella enterica, and Listeria monocytogenes from body surfaces and alimentary canals of individual wild-caught flies. The goal of this protocol is to detect and isolate bacterial pathogens from individual insects collected as part of an environmental sampling program during foodborne outbreak investigations.

個々のフィルスのハエから食中毒細菌性病原体の検出

There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, significantly affecting the rate of human mortality and morbidity. Conventional methods for the detection of V. parahaemolyticus such as culture-based methods, immunological assays, and molecular-based methods require complicated sample handling and are time-consuming, tedious, and costly. Recently, biosensors have proven to be a promising and comprehensive detection method with the advantages of fast detection, cost-effectiveness, and practicality. This research focuses on developing a rapid method of detecting V. parahaemolyticus with high selectivity and sensitivity using the principles of DNA hybridization. In the work, characterization of synthesized polylactic acid-stabilized gold nanoparticles (PLA-AuNPs) was achieved using X-ray Diffraction (XRD), Ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Field-emission Scanning Electron Microscopy (FESEM), and Cyclic Voltammetry (CV). We also carried out further testing of stability, sensitivity, and reproducibility of the PLA-AuNPs. We found that the PLA-AuNPs formed a sound structure of stabilized nanoparticles in aqueous solution. We also observed that the sensitivity improved as a result of the smaller charge transfer resistance (Rct) value and an increase of active surface area (0.41 cm2). The development of our DNA biosensor was based on modification of a screen-printed carbon electrode (SPCE) with PLA-AuNPs and using methylene blue (MB) as the redox indicator. We assessed the immobilization and hybridization events by differential pulse voltammetry (DPV). We found that complementary, non-complementary, and mismatched oligonucleotides were specifically distinguished by the fabricated biosensor. It also showed reliably sensitive detection in cross-reactivity studies against various food-borne pathogens and in the identification of V. parahaemolyticus in fresh cockles.

A protocol for the development of an electrochemical DNA biosensor comprising a polylactic acid-stabilized, gold nanoparticles-modified, screen-printed carbon electrode to detect Vibrio parahaemolyticus is presented.

食品由来病原体を検出する電気化学的 DNA のバイオ センサーの開発

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

生物工学

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and water-screening methods used currently. While conventional bacterial detection methods, such as polymerase chain reaction (PCR) and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) can specifically detect pathogenic contaminants, they require extensive sample preparation and lengthy waiting periods. In addition, these practices demand sophisticated laboratory instruments and settings, and must be executed by trained professionals. Herein, a protocol is proposed for a simpler diagnostic technique that features the unique combination of magnetic and fluorescent parameters in a nanoparticle-based platform. The proposed multiparametric magneto-fluorescent nanosensors (MFnS) can detect E. coli O157:H7 contamination with as little as 1 colony-forming unit present in solution within less than 1 h. Furthermore, the ability of MFnS to remain highly functional in complex media such as milk and lake water has been verified. Additional specificity assays were also used to demonstrate the ability of MFnS to only detect the specific target bacteria, even in the presence of similar bacterial species. The pairing of magnetic and fluorescent modalities allows for the detection and quantification of pathogen contamination in a wide range of concentrations, exhibiting its high performance in both early- and late-stage contamination detection. The effectiveness, affordability, and portability of the MFnS make them an ideal candidate for point-of-care screening for bacterial contaminants in a wide range of settings, from aquatic reservoirs to commercially packaged foods.

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

The overall goal of this protocol is to synthesize functional nanosensors for the portable, cost-effective, and rapid detection of specifically targeted pathogenic bacteria through a combination of magnetic relaxation and fluorescence emission modalities.

E. 大腸菌o157: h7 の食品由来病原体のスクリーニングを使用して磁気蛍光ナノセンサー: 迅速検出

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

免疫・感染学

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループット プラットフォーム/赤痢菌属

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ

Salmonella is an enteric pathogen able to invade the intestinal epithelium and replicate in enterocytes, both inside Salmonella-specific vacuoles and free in the cytosol (cytosolic hyper-replication). These different phenotypes of intracellular replication drive to different pathways of pathogenesis, i.e., cytosolic hyper-replication induces inflammatory cell death and extrusion into the gut lumen, while vacuolar replication leads to trans-epithelium penetration and systemic spread. Significant effort was made to create microscopy tools to study the behavior of Salmonella inside invaded cells, such as the pCHAR-Duo fluorescence reporter plasmid that allows discrimination between vacuolar and cytosolic bacteria by differential expression of mCherry and GFP. However, intracellular phenotypes are often manually scored, a time-consuming procedure that limits analysis to a small number of samples and cells. To overcome these limitations, two complementary and automated image analyses were developed using ImageJ, a freely available image analysis software. In the high-throughput protocol, epithelial cells were infected with Salmonella carrying pCHAR-Duo using 96-well plates. Imaging was performed using an automated fluorescence microscope. Then, two image analysis methods were applied to measure the intracellular behavior of Salmonella at different detail levels. The first method measures the overall intracellular bacterial load and the extent of cytosolic hyper-replication. It is fast and allows the scoring of a high number of cells and samples, making it suitable for high-throughput assays such as screening experiments. The second method performs single-cell analysis to determine the percentage of infected cells, the mean vacuolar load of Salmonella, and the cytosolic hyper-replication rate giving greater details about Salmonella behavior inside epithelial cells. The protocols can be performed by specifically designed ImageJ scripts to automatically run batch analyses of the major steps of Salmonella-enterocyte interaction.

Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ

Salmonella invades and replicates inside intestinal epithelial cells both in Salmonella-specific vacuoles and free in the cytosol (hyper-replication). A high-throughput fluorescence microscopy-based protocol is described here to quantify the intracellular phenotypes of Salmonella by two complementary image analyses through ImageJ, reaching single-cell resolution and scoring.

ImageJを用いた サルモネラ菌 の細胞内表現型自動解析

Salmonella is an enteric pathogen able to invade the intestinal epithelium and replicate in enterocytes, both inside Salmonella-specific vacuoles and free ...

Fluorescent Reporter 定量による全臓器病原体追跡(英語)

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen cells within this diverse environment significantly affects their stress levels, responses, fate, and contribution to the overall progression of the disease and treatment failure. However, due to the technical difficulties in locating &#181;m-sized pathogen cells within cm-sized host organs, this area of research has been relatively unexplored. Here, we present a method for addressing this challenge. We employ serial two-photon tomography and AI-enhanced image analysis to locate individual Salmonella cells throughout the entire spleen, liver lobes, and whole lymph nodes of infected mice. Using fluorescent reporters and in vivo antibody administration, the replication rate of single Salmonella cells, their local interaction with specific immune cells, and bacterial responses to antibiotics can be determined. These methodologies open avenues for a comprehensive examination of infections, their prevention, and treatment within the three-dimensional tissue context.

著者スポットライト:組織における抗生物質と免疫系に対する細菌の応答を解明する

Here, we describe a procedure that enables organ-wide detection of pathogenic bacteria during infection and quantification of fluorescent reporter activities.

微生物感染症の高解像度三次元全臓器断層撮影法

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

粘着テープベースのサンプリングと蛍光の組み合わせその場でハイブリダイゼーションサルモネラ生鮮食品について

要約

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蛍光粉を使用した小売環境における微生物汚染を追跡する - 小売デリカ環境の例

比色検出の紙ベース

個々のフィルスのハエから食中毒細菌性病原体の検出

食品由来病原体を検出する電気化学的 DNA のバイオセンサーの開発

E. 大腸菌o157: h7 の食品由来病原体のスクリーニングを使用して磁気蛍光ナノセンサー: 迅速検出

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループットプラットフォーム/赤痢菌属

ImageJを用いたサルモネラ菌の細胞内表現型自動解析

微生物感染症の高解像度三次元全臓器断層撮影法

微生物感染症の高解像度三次元全臓器断層撮影法

微生物感染症の高解像度三次元全臓器断層撮影法

粘着テープベースのサンプリングと蛍光の組み合わせその場でハイブリダイゼーションサルモネラ生鮮食品について

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蛍光粉を使用した小売環境における微生物汚染を追跡する - 小売デリカ環境の例

比色検出の紙ベース

個々のフィルスのハエから食中毒細菌性病原体の検出

食品由来病原体を検出する電気化学的 DNA のバイオ センサーの開発

E. 大腸菌o157: h7 の食品由来病原体のスクリーニングを使用して磁気蛍光ナノセンサー: 迅速検出

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループット プラットフォーム/赤痢菌属

ImageJを用いた サルモネラ菌 の細胞内表現型自動解析

微生物感染症の高解像度三次元全臓器断層撮影法

微生物感染症の高解像度三次元全臓器断層撮影法

微生物感染症の高解像度三次元全臓器断層撮影法

食品由来病原体を検出する電気化学的 DNA のバイオセンサーの開発

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループットプラットフォーム/赤痢菌属

ImageJを用いたサルモネラ菌の細胞内表現型自動解析