Die Finanzierung dieser Arbeit wurde durch einen Grow Iowa Werte Fund Award an BFBS zur Verfügung gestellt.

1. Oberflächenproben mit Sterile Klebeband <ol><li> Wählen Sie ein Band für die Probenahme zu verwenden. Die im Handel erhältlichen Fungi-Tape oder Con-Tact-It Probenahme Bänder sind steril und speziell verpackte für Benutzerfreundlichkeit. Allerdings haben wir festgestellt, dass transparent (optisch klar) generische Büro Band kann ebenfalls verwendet werden. </li><li> Verwenden Sie einen Permanent-Marker auf 1 cm 2 Plätze auf der nicht-klebrige Seite eines 10 cm Stück Klebeband (ein Papier-Vorlage verwendet werden kann) zu zeichnen. Dies wird als visuelle Hilfe für die Feststellung, welcher Teil des Bandes verwendet wurde, um die Lebensmittel-oder Umweltproben Oberfläche Probe dienen. </li><li> Form eines &quot;C&quot;-förmigen Schleife der Band, mit der klebrigen Seite nach der Fläche in die Stichprobe. Um dies zu tun, halten Sie die klebrigen Enden mit dem Daumen und Mittelfinger und die Position der Zeigefinger gegen die gezogenen Quadrat auf der Rückseite (nicht-klebrige Seite) des Bandes (Abbildung 1). </li><li> Legen Sie das Band auf der Oberfläche abgetastet und drücken Sie vorsichtig den markierten Bereich an die Oberfläche. Ohne die Freigabe der Ränder des Bandes, verwenden Sie den Zeigefinger, um sicherzustellen, dass die Klebeseite des Bandes in vollem Kontakt mit der Probenoberfläche kommt, blasenfrei. </li><li> Mit einer gleichmäßigen Bewegung, ziehen Sie das Band von der Probe entfernt, körperlich Extrahieren Oberflächen-gebundenen Mikroben. Befestigen Sie die Zelle aufgeladen Band, klebrigen Seite nach oben auf einen Glasobjektträger mit generischen transparent Büro Band. Stellen Sie sicher, die richtige Spannung / Dehnung des Bandes, so dass eine ebene, nicht faltig Oberfläche entsteht. Dies wird dazu beitragen minimieren Probleme mit Deformation / Eisstock des Bandes bei der anschließenden Erwärmung während der Hybridisierung. </li></ol> 2. Solid-Phase-Enrichment und Flüssigkeitsoberfläche Miniculture <ol><li> Solid-Phase-Anreicherung ist, indem das Band der Vorderseite nach unten auf Xylose-Lysin-Tergitol 4 (XLT-4)-Agar-Platten, so dass die Proben-Zellen in direktem Kontakt mit der Agar-Oberfläche platziert werden durchgeführt. Die Vorlagen / Probe kontaktieren Teil des Bandes ist bündig mit der Agar-Oberfläche und ein Ende des Bandes lose an der Seitenwand der Petrischale geklebt um ein leichtes Entfernen des Bandes aus der Agar-Oberfläche folgende Bereicherung zu erleichtern. </li><li> Die Platten werden invertiert (um Kondensation zu vermeiden) resuspendiert und bei 35 bis 37 ° C, um eine ausreichende Wachstum von Salmonella spp ermöglichen. Die Länge der Inkubationszeit benötigt, um die Zellen auf ein nachweisbares Niveau bereichern wird bei der erstmaligen Kontamination mit Salmonellen abhängen. Wir haben ausgezeichnete Mikrokoloniebildung aus niedrigen anfänglichen Inokula beobachtet nach 8 h Anreicherung. </li><li> Nachdem die gewünschte Anreicherung Zeitraum, öffnen Sie die Agar-Platte. Das Band wird seine Klebrigkeit während der Inkubation zu behalten. Drücken Sie das Band vor dem Agar mit dem Zeigefinger, um die Rückforderung von Mikrokolonien auf der Band-Agar-Schnittstelle gebildet zu gewährleisten. Fassen Sie das Klebeband von der Kante an der Wand der Petrischale und entfernen Sie sie mit einem langsamen, gleichmäßigen Bewegung. Montieren Sie die Zelle aufgeladen Band, klebrigen Seite nach oben auf einen Objektträger, wie in Abschnitt 1.5 beschrieben. Fahren Sie mit &quot;Fixation und Dehydration&quot; step unten. </li><li> Für flüssige Oberfläche miniculture, durch die Befestigung des Bandes für die Probenahme auf einen Objektträger, wie in Abschnitt 1.5 oben beschrieben, verwendet beginnen. Dann bedecken Sie die Vorlagen / Probe kontaktieren Teil des Bandes mit einer nicht sterilen Silikon Perfusionskammer (Coverwell, Grace Bio-Labs, Inc.), bilden eine geschlossene Kammer, deren Boden der Zelle geladenen Band besteht, nach oben. Fest, aber sanft drücken Sie die Kammer in Ort, um eine wasserdichte Abdichtung zu gewährleisten. </li><li> Mit einem flexiblen Gelbeladung Pipettenspitze, Transfer ≤ 500 ul Trypticase Soy Broth oder einem anderen geeigneten Anreicherungsmedium durch eine der Kammer ist klein Einlasskanäle. Seal beide Ports mit transparenten Büro-Band, um Verdunstung und inkubieren bei 35 -37 ° C zu verhindern, wie für eine ausreichende Anreicherung erforderlich. Obwohl alle Operationen nach guter Probenahme und Handhabung Praktiken durchgeführt werden sollte, ist die Sterilität von Port-Dichtband oder Perfusionskammern nicht während der Flüssigkeitsoberfläche miniculture erforderlich. Die Kombination von FISH und Durchflusszytometrie ermöglicht eine klare Diskriminierung von Salmonella spp. von Nicht-Ziel-Bakterien, die vorhanden sein, wobei der größte Anteil der Nicht-Ziel-Flora erwartet von der Probe selbst kommen können. Fahren Sie mit &quot;Fixation und Dehydration&quot; step unten. </li></ol> 3. Fixation und Dehydration <ol><li> Für die direkte Entnahme von Oberflächenproben oder für feste Phase Anreicherung von Salmonella spp. auf XLT-4-Agar, führen on-tape Zellfixierung für 30 min bei 25 ° C durch das Abdecken der Probe Kontaktfläche mit 500 ul 10% neutral gepuffertem Formalin. </li><li> Discard Fixativ in einem verschließbaren Behälter (unter einer chemischen Haube um die Exposition gegenüber irritierenden / giftige Dämpfe zu minimieren). </li><li> Entwässern in einem Ethanol-Reihe (50%, 80% und 95%, 300 ul / 3 min jeder Konzentration). Fahren Sie mit &quot;Hybridisierung&quot; step unten. </li><li> Zur Fixierung von 500 ul Flüssigkeitsoberfläche miniculture Probes sind Perfusionskammern entsiegelt worden sind, und eine flexible Gel-loading Pipettenspitze wird verwendet, um die enrichate extrahieren. Schnelle rauf und runter Pipettieren verwendet wird, um sicherzustellen, effektive Entfernung der übrigen Band-gebundenen Zellen. </li><li> Anschließend wird die gesamte 500 ul miniculture Lautstärke auf ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und abzentrifugiert bei 2.000 xg (5 min). Der Überstand wird verworfen, das Pellet mit Nachdruck für 30-60 s gevortext, dann in ein gleiches Volumen 10% resuspendiert neutral gepuffertem Formalin. Die Zellen werden für 30 min bei 25 ° C fixiert </li><li> Als nächstes Fixativ entfernt und die Probe wird in Zelle Speicher-Puffer, wie folgt. 60 s, die in einem gleichen Volumen von 50% nicht-denaturiertem Ethanol-50% resuspendiert Phosphat-- Die Probe wird bei 2.000 xg (5 min, 25 ° C) den Überstand wird verworfen, das Pellet mit Nachdruck für 30 gevortext gesponnen Kochsalzlösung. Fixierten Zellen können unbegrenzt gelagert werden (in Jahren) bei -20 ° C. Hinweis: Wenn Flüssigkeiten verändert werden (zum Beispiel bei der Einführung eines Fixativ oder verschiedene Puffer), ist es wichtig, gründlich resuspendieren (mit Vortex) das Zellpellet in einem minimalen Anteil (~ 10 bis 20 ul) des &quot;outgoing&quot; flüssigen Systems . Dadurch wird verhindert, Verklumpung und sicherzustellen, dass auch Suspensionen von einzelnen Zellen erhalten werden. Fahren Sie mit &quot;Hybridisierung&quot; step unten. </li></ol> 4. Hybridisierung <ol><li> Bereiten Hybridisierung / Waschpuffer mit der kommerziellen Molekularbiologie-Grade-Lösungen hingewiesen in Werkstoff-Tabelle. Finale Pufferkomponente Konzentrationen sind 0,7 M NaCl, 0,1 M Tris [pH 8,0], 10 mM EDTA, 0,1% Natriumdodecylsulfat, machte bis zur endgültigen gewünschte Lautstärke mit molekular-Grad Wasser und unter Verwendung einer 0,22 um Spritze oder eine Tasse Filter. Die gleichen Puffer, ohne den Zusatz von Sonden (siehe unten) wird als Waschpuffer verwendet. Vorheizen Hybridisierung und Waschpuffer bis 55 ° C. </li><li> Add fluoreszenzmarkierten Sal3 (Nordentoft et al, 1997;. 5&#39;-AAT CAC TTC ACC TAC GTG-3 &#39;) und Salm-63 (Kutter et al, 2006;. 5&#39;-TCG ACT GAC TTC AGC TCC-3&#39; ) Oligonukleotid-Sonden (Werkstoff-Tabelle) vorgeheizt Hybridisierungspuffer. Insgesamt Sonde Konzentration von 5 ng ul -1 verwendet (z. B. 2,5 ng ul -1 jede Sonde; Bisha und Brehm-Stecher, 2009a). </li><li> Für Direct-to-Tape-und Festphase Bereicherung Proben, überlagern die Vorlagen Probe Kontaktfläche des Bandes mit 300 ul Hybridisierungspuffer mit der Sonde Cocktail und hybridisieren Band-gebundenen Zellen in einer feuchten, verschlossenen Inkubationskammer Satz bis 55 ° C. Wenn eine direkte Kontakt-Inkubator wie der Slide Moat Instrument (Werkstoff-Tabelle) verwendet wird, werden die Proben für 15 min hybridisiert und&gt; 20 Objektträger können gleichzeitig verarbeitet werden. Wenn ein Dreh-style Hybridisierungsofen wie der Bambino-Instrument (Werkstoff-Tabelle) verwendet wird, werden Folien in 50 mL Polypropylen-Zentrifugenröhrchen für die Hybridisierung, eine Folie pro Röhrchen gegeben. Da die Wärmeübertragung nicht direkt, werden diese Proben über einen längeren Zeitraum (bis zu 30 min) hybridisiert. </li><li> Nach der Hybridisierung werden die Objektträger entfernt und die Sonde-haltigen Hybridisierungspuffer Overlay wird verworfen. Folien werden dann entweder kurz und sanft mit vorgewärmten Waschpuffer durch Pipettieren einem kleinen Volumen Puffer über eine geneigte Rutsche (3 Spülungen von 300 ul jeweils) gespült, oder formal gewaschen (bis zu 30 min) mit entweder einer Überlagerung von vorgewärmtem Waschpuffer oder Eintauchen in eine 50 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen mit vorgewärmten Waschpuffer. Nach unserer Erfahrung ist, obwohl eine formelle waschen verbesserten Ergebnissen (weniger Dunst von ungebundenen Sonde) bieten wird, spülen Sie einfach ausreichend für eindeutige Nachweis von Salmonella spp. Anschließend werden Dias an der Luft getrocknet, bevor er nach der &quot;Detection&quot; Schritt unten. </li><li> Die Hybridisierung der Flüssigkeitsoberfläche miniculture Proben wird durch Abzentrifugieren Proben (frisch fixiert oder auf Lager gehalten Puffer bei -20 ° C) für 5 min bei 2.000 xg durchgeführt, gefolgt von kräftigem Vortexen des Pellets und Resuspendierung in 100 ul vorgewärmte Hybridisierungspuffer mit die Sonde Cocktail. Die Proben werden bei 55 hybridisiert ° C für 30 min auf einem Heizblock oder einem anderen geeigneten Inkubationszeit Bahnhof (Werkstoff-Tabelle), durch Zugabe von 500 ul vorgewärmte Waschpuffer folgte. Wie bei Band-gebundenen Proben, können diese Proben formal gewaschen werden bis zu 30 min mit weiteren Inkubation bei 55 ° C in diesem Waschpuffer mit Intervallschaltung Vortexen. Alternativ können die Proben gründlich nach Zugabe von 500 ul vorgewärmte Waschpuffer verwirbelt werden, gefolgt von sofortiger Ernte für die Analyse (unten). </li><li> In Vorbereitung für den Nachweis von Salmonella spp. über Durchflusszytometrie, Flüssigkeitsoberfläche miniculture Proben bis auf 2.000 xg für 5 min gesponnen werden, der Überstand wird verworfen und die Proben werden in 300 ul Raumtemperatur resuspendiert (~ 25 ° C) PBS. Wenn Proben Transport benötigen, um eine entfernte Anlage, oder wenn eine Verzögerung zwischen Hybridisierung und Analyse zu erwarten ist, können die Proben im Kühlschrank gelagert werden oder statt auf dem Eis vor anaLyse. Alternativ können die Proben zu Zelle Pufferspeicher (50:50-Mischung aus PBS und absolutem Ethanol) übertragen werden und hielt bei -20 ° C bis zu einer Woche ohne nennenswerte Verluste in Sonde-verliehenen Fluoreszenz (Bisha und Brehm-Stecher, 2009b) . </li></ol> 5. Erkennung <ol><li> Für on-tape Nachweis von Salmonella spp. via Fluoreszenzmikroskopie werden direct-to-Tape oder fester Phase Bereicherung Proben mit ~ 10 ul Vectashield H-1200 Montage-Medium mit den nuklearen Gegenfärbung 4 &#39;,6-Diamino-2-phenylindole (DAPI), mit einem Deckglas montiert überlagert, dann im Dunkeln für 10 min inkubiert. </li><li> Immersionsöl auf das Deckglas gelegt, und die Proben werden unter Verwendung eines High-Vergrößerung Öl-Objektiv (63x oder 100x). Die DAPI-Filter verwendet wird, um die Probe in den Fokus zu bringen, das Mikroskop wird dann an den entsprechenden Filter (grün oder rot, je nach dem verwendeten Farbstoff zu Ende-Label der Sonden) und Salmonella-Zellen abgeschaltet werden visuell nach ihrer Fluoreszenz (erzielte Fakten 2 und 3). </li><li> Für durchflusszytometrischen Nachweis der Flüssigkeitsoberfläche miniculture Proben können verschiedene Instrumente verwendet, je nach lokaler Verfügbarkeit werden. In unserem Labor sind PBS suspendiert Proben zu 5 ml Rundboden Probenahme-Röhrchen (BD Falcon) überführt und unter Verwendung eines FACSCanto Durchflusszytometer mit einer Anregung bei 647 nm (Werkstoff-Tabelle). Für angereicherten Proben mit hohen Zahl von insgesamt Bakterien, ist die &quot;Low-Flow-Rate&quot;-Einstellung (10 l min -1) verwendet und 5.000-50.000 Ereignisse gesammelt werden. Daten werden mit Hilfe FlowJo Software (Version 8.8.6, Baum Star, Inc., Ashland, OR) oder andere geeignete Analyse-Software (Abbildung 4, Platten A und B). </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Verwendung von Klebeband für die Probenahme von Salmonella spp. von der Oberfläche eines künstlich kontaminierten Tomaten. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Typische Ergebnisse für direct-to-Tape-Probenahme-und FISH Detektion von Salmonella Typhimurium ATCC 14028 von der Oberfläche der Tomaten (100 X Öl-Objektiv). Ein Zwei-Sonde Cocktail aus Texas Red-markierten Sonden (Sal3/Salm-63) wurde verwendet, zur Kennzeichnung dieser Zellen. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Mikrokolonien von Salmonella Typhimurium ATCC 14028 auf der Oberfläche der Xylose-Lysin-Tergitol-4 (XLT-4)-Agar nach 8 h on-tape Bereicherung bei 37 ° C. Die anfängliche Inokulum von der Oberfläche eines künstlich kontaminierten Tomaten abgetastet wurde gebildet. Solid-Phase-Anreicherung steigt die Zahl der verfügbaren Zellen für die Detektion und verbessert auch die zelluläre rRNA Inhalt. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Verwendung von Klebeband für die Probenahme von S. enterica Serovar Typhimurium von der Oberfläche eines künstlich kontaminierten Tomaten, durch direkte Analyse über FISH und Durchflusszytometrie (Panel A) oder nach 5 h nicht-selektiven Flüssigkeitsoberfläche miniculture Bereicherung in einer Perfusionskammer mit 500 ul Trypticase Soy Broth (Panel B gefüllt, gefolgt ).

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Einfache und schnelle Methoden zum Nachweis von Krankheitserregern auf Oberflächen erzeugen kann zu einer Abschwächung Lebensmittelinfektionen durch rechtzeitige und verwertbare Daten. Klebeband-basierte Methoden zur Probenahme in Umwelt-, Klinik-und Lebensmittel-Mikrobiologie, seit den 1950er Jahren verwendet und beinhalten Drücken von &quot;Scotch&quot;-Stil Band auf Oberflächen zur Entfernung von Mikroorganismen, gefolgt von direkten mikroskopischen Untersuchung oder die Übertragung von anhaftenden Mikroorganism...

<table><tbody><tr><td>Fungi-Tape sampling tape</td><td>Scientific Device Laboratory</td><td>745</td><td>http://www.scientificdevice.com/</td></tr><tr><td>Con-Tact-It sampling tape</td><td>Birko Corporation, Denver, CO</td><td></td><td>http://www.birkocorp.com/</td></tr><tr><td>Clear office tape, generic</td><td>Various</td><td></td><td>Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence</td></tr><tr><td>Food surface</td><td>Local Grocery Store</td><td></td><td>Tomat&amp;#8211;s (red tomat&amp;#8211;s on the vine, not waxed or oiled) used here</td></tr><tr><td>Trypticase Soy Broth</td><td>Difco Laboratories</td><td>211768</td><td>For non-selective liquid surface miniculture enrichment</td></tr><tr><td>Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base</td><td>Difco Laboratories</td><td>223420</td><td>For &lt;em&gt;Salmonella&lt;/em&gt;-selective agar (XLT-4)</td></tr><tr><td>Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement</td><td>Difco Laboratories</td><td>235310</td><td>For&lt;em&gt; Salmonella&lt;/em&gt;-selective agar (XLT-4)</td></tr><tr><td>Formalin solution </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5011</td><td>10% solution, neutral, buffered (cell fixative)</td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration)</td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td><td>Various</td><td></td><td>RNase- and DNase-free</td></tr><tr><td>Microscope slides and cover slips</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5150</td><td>Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component)</td></tr><tr><td>Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component)</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td>10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component)</td></tr><tr><td>Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified</td></tr><tr><td>Variable speed microcentrifuge</td><td>Various</td><td></td><td>Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol</td></tr><tr><td>CoverWell perfusion chamber </td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td>PC1R-2.0</td><td>Non-sterile</td></tr><tr><td>Gel loading pipette tips (FS MultiFlex)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>05-408-151</td><td>Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber</td></tr><tr><td>Aluminum heat block or precision-controlled heating station</td><td>Various</td><td></td><td>Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here</td></tr><tr><td>Bambino mini hybridization oven</td><td>Boekel Scientific</td><td>Model 230300</td><td>Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct</td></tr><tr><td>Slide Moat slide hybridizer</td><td>Boekel Scientific</td><td>Model 240000</td><td>Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide</td></tr><tr><td>Vectashield H-1200 mounting medium with 4&amp;rsquo;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Various</td><td></td><td>Leitz Laborlux S used here</td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>Various</td><td></td><td>Canon PowerShot A640 camera used here</td></tr><tr><td>Image acquisition software</td><td>Various</td><td></td><td>Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td>For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels)</td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>Various</td><td></td><td>FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used</td></tr><tr><td>Flow cytometry analysis software</td><td>Various</td><td></td><td>FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used</td></tr></tbody></table>

combination of adhesive-tape-based sampling and fluorescence in situ hybridization for rapid detection of salmonella on fresh produce

Dieses Protokoll beschreibt einen einfachen Ansatz für Klebeband-basierte Probenahme von Tomaten und anderem Frischobst und Frischgemüse Oberflächen, durch on-tape-Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) für die schnelle Kultur-unabhängigen Nachweis von Salmonella spp. Cell-geladenen Bänder können auch verdeckt auf Selektivagar für Festphasen-Anreicherung gelegt werden, bevor die Erkennung. Alternativ kann mit geringem Volumen Flüssigkeit Anreicherungen (Flüssigkeitsoberfläche miniculture) auf der Oberfläche des Bandes in nicht-selektiven Brühe durch FISH und Analyse über die Durchflusszytometrie gefolgt durchgeführt werden. Um zu beginnen, sterile Klebeband ist in Kontakt mit frischen Produkten gebracht wird, wird sanfter Druck angewandt, und das Band entfernt wird, physisch Extrahieren Mikroben anwesend auf diesen Flächen. Tapes sind klebrig-Seite nach oben auf Objektträger aus Glas montiert und in der Stichprobe Zellen werden mit 10% igem Formalin (30 min) und entwässert mit einem abgestuften Ethanol-Reihe (50, 80 und 95%; 3 min jeder Konzentration) festgelegt. Als nächstes Zelle aufgeladen Bänder werden mit Puffer mit einem Salmonella-gezielte DNA-Sonde Cocktail gesichtet und hybridisiert für 15 bis 30 min bei 55 ° C, gefolgt von einer kurzen in einem Waschpuffer, um ungebundene Sonde zu entfernen spülen. Adhärente sind FISH-markierten Zellen werden dann mit den DNA-Farbstoff 4 &#39;,6-Diamino-2-phenylindole (DAPI) gegengefärbt und die Ergebnisse betrachtet werden mittels Fluoreszenzmikroskopie. Für Festphasen-Anreicherung, sind Zell-geladenen Bänder Gesicht nach unten auf einen geeigneten selektiven Agar-Oberfläche gelegt und inkubiert, um in situ Wachstum von Salmonella Mikrokolonien durch FISH und Mikroskopie verfolgt, wie oben beschrieben zu ermöglichen. Für flüssige Oberfläche miniculture sind Zell-geladenen Bänder klebrigen Seite nach oben und ein Silikon Perfusionskammer angewendet wird, so dass das Band und Objektträger bilden den Boden einer wasserdichten Kammer, in die ein kleines Volumen (≤ 500 ul) von Trypticase Soy Broth (TSB) wird eingeführt. Die Einlassöffnungen sind versiegelt und die Kammern sind bei 35 inkubiert - 37 ° C, so dass das Wachstum-basierte Amplifikation von Tape-extrahierten Mikroben. Nach der Inkubation Einlasskanäle entsiegelt worden sind, Zellen abgelöst und unter kräftigem wieder gemischt und her Pipettieren geerntet durch Zentrifugation und in 10% neutral gepuffertem Formalin. Schließlich sind die Proben hybridisiert und untersucht per Durchflusszytometrie, um das Vorhandensein von Salmonella spp offenbaren. Wie hier beschrieben, können unsere &quot;Band-FISH&quot;-Ansatz bietet eine einfache und schnelle Probenahme und Nachweis von Salmonellen auf Tomaten Oberflächen. Wir haben auch diesen Ansatz für die Probenahme andere Arten von frischen Produkten, einschließlich Spinat und Chilischoten verwendet.

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Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Klebeband-basierten Ansatz für die Probenahme von Tomaten und anderem Frischobst und Frischgemüse Oberflächen durch schnelles ganze Zelle Erkennung gefolgt<em&gt; Salmonellen</em&gt; Mittels Fluoreszenz<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (FISH).

Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

combination-adhesive-tape-based-sampling-fluorescence-situ

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

12.9K Aufrufe.  Colorado State University. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Klebeband-basierten Ansatz für die Probenahme von Tomaten und anderem Frischobst und Frischgemüse Oberflächen durch schnelles ganze Zelle Erkennung gefolgt Salmonellen Mittels Fluoreszenz In situ Hybridisierung (FISH).

Serie: Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Tracking Microbial Contamination in Retail Environments Using Fluorescent Powder - A Retail Delicatessen Environment Example

Cross contamination of foodborne pathogens in the retail environment is a significant public health issue contributing to an increased risk for foodborne illness. Ready-to-eat (RTE) processed foods such as deli meats, cheese, and in some cases fresh produce, have been involved in foodborne disease outbreaks due to contamination with pathogens such as Listeria monocytogenes. With respect to L. monocytogenes, deli slicers are often the main source of cross contamination. The goal of this study was to use a fluorescent compound to simulate bacterial contamination and track this contamination in a retail setting. A mock deli kitchen was designed to simulate the retail environment. Deli meat was inoculated with the fluorescent compound and volunteers were recruited to complete a set of tasks similar to those expected of a food retail employee. The volunteers were instructed to slice, package, and store the meat in a deli refrigerator. The potential cross contamination was tracked in the mock retail environment by swabbing specific areas and measuring the optical density of the swabbed area with a spectrophotometer. The results indicated that the refrigerator (i.e. deli case) grip and various areas on the slicer had the highest risk for cross contamination. The results of this study may be used to develop more focused training material for retail employees. In addition, similar methodologies could also be used to track microbial contamination in food production environments (e.g.&#160;small farms), hospitals, nursing homes, cruise ships, and hotels.

The overall goal of this study was to demonstrate the potential cross contamination mechanism of foodborne pathogen Listeria monocytogenes in a retail deli setting. This methodology may be applied to a variety of different environments to track pathogen contamination. &#160;

Tracking-Mikrobielle Kontamination in Einzelhandelsumgebungen mit fluoreszierenden Pulver - Ein Feinkost Einzelhandel Beispiel Umwelt

Cross contamination of foodborne pathogens in the retail environment is a significant public health issue contributing to an increased risk for foodborne ...

Forschung

Umwelt

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of agricultural waters. Here, water is filtered through sterile Modified Moore Swabs (MMS), which consist&#160;of a simple gauze filter enclosed in a plastic cartridge, to concentrate bacteria. Following filtration, non-selective or selective enrichments for the target bacteria are performed in the MMS. For colorimetric detection of the target bacteria, the enrichments are then assayed using paper-based analytical devices (&#181;PADs) embedded with bacteria-indicative substrates. Each substrate reacts with target-indicative bacterial enzymes, generating colored products that can be detected visually (qualitative detection) on the &#181;PAD. Alternatively, digital images of the reacted &#181;PADs can be generated with common scanning or photographic devices and analyzed using ImageJ software, allowing for more objective and standardized interpretation of results. Although the biochemical screening procedures are designed to identify the aforementioned bacterial pathogens, in some cases enzymes produced by background microbiota or the degradation of the colorimetric substrates may produce a false positive. Therefore, confirmation using a more discriminatory diagnostic is needed. Nonetheless, this bacterial concentration and detection platform is inexpensive, sensitive (0.1 CFU/ml detection limit), easy to perform, and rapid (concentration, enrichment, and detection are performed within approximately 24&#160;hr), justifying its use as an initial screening method for the microbiological quality of agricultural water.

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (&#181;PAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.

Farbmetrische Papierbasierte Erkennung von<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonellen</em&gt; Spp. Und<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Von großen Mengen von Landwirtschaftliche Wasser

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

Detection of Foodborne Bacterial Pathogens from Individual Filth Flies

There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a particular foodborne illness outbreak has been challenging. This is because insects are not being aseptically collected as part of an environmental sampling program during foodborne outbreak investigations and because there is not a standardized method to detect foodborne bacteria from individual insects. To take a step towards solving this problem, we adapted a protocol from a commercially available PCR-based system that detects foodborne pathogens from food and environmental samples, to detect foodborne pathogens from individual flies.Using this standardized protocol, we surveyed 100 wild-caught flies for the presence of Cronobacter spp., Salmonella enterica, and Listeria monocytogenes and demonstrated that it was possible to detect and further isolate these pathogens from the body surface and the alimentary canal of a single fly. Twenty-two percent of the alimentary canals and 8% of the body surfaces from collected wild flies were positive for at least one of the three foodborne pathogens. The prevalence of Cronobacter spp. on either body part of the flies was statistically higher (19%) than the prevalence of S. enterica (7%) and L.monocytogenes (4%). No false positives were observed when detecting S. enterica and L. monocytogenes using this PCR-based system because pure bacterial cultures were obtained from all PCR-positive results. However, pure Cronobacter colonies were not obtained from about 50% of PCR-positive samples, suggesting that the PCR-based detection system for this pathogen cross-reacts with other Enterobacteriaceae present among the highly complex microbiota carried by wild flies. The standardized protocol presented here will allow laboratories to detect bacterial foodborne pathogens from aseptically collected insects, thereby giving public health officials another line of evidence to find out how the food was contaminated when performing foodborne outbreak investigations.

A PCR-based protocol was adapted to detect Cronobacter spp., Salmonella enterica, and Listeria monocytogenes from body surfaces and alimentary canals of individual wild-caught flies. The goal of this protocol is to detect and isolate bacterial pathogens from individual insects collected as part of an environmental sampling program during foodborne outbreak investigations.

Der Nachweis von lebensmittelbedingten bakteriellen Erregern von Individual Filth Flies

There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, significantly affecting the rate of human mortality and morbidity. Conventional methods for the detection of V. parahaemolyticus such as culture-based methods, immunological assays, and molecular-based methods require complicated sample handling and are time-consuming, tedious, and costly. Recently, biosensors have proven to be a promising and comprehensive detection method with the advantages of fast detection, cost-effectiveness, and practicality. This research focuses on developing a rapid method of detecting V. parahaemolyticus with high selectivity and sensitivity using the principles of DNA hybridization. In the work, characterization of synthesized polylactic acid-stabilized gold nanoparticles (PLA-AuNPs) was achieved using X-ray Diffraction (XRD), Ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Field-emission Scanning Electron Microscopy (FESEM), and Cyclic Voltammetry (CV). We also carried out further testing of stability, sensitivity, and reproducibility of the PLA-AuNPs. We found that the PLA-AuNPs formed a sound structure of stabilized nanoparticles in aqueous solution. We also observed that the sensitivity improved as a result of the smaller charge transfer resistance (Rct) value and an increase of active surface area (0.41 cm2). The development of our DNA biosensor was based on modification of a screen-printed carbon electrode (SPCE) with PLA-AuNPs and using methylene blue (MB) as the redox indicator. We assessed the immobilization and hybridization events by differential pulse voltammetry (DPV). We found that complementary, non-complementary, and mismatched oligonucleotides were specifically distinguished by the fabricated biosensor. It also showed reliably sensitive detection in cross-reactivity studies against various food-borne pathogens and in the identification of V. parahaemolyticus in fresh cockles.

A protocol for the development of an electrochemical DNA biosensor comprising a polylactic acid-stabilized, gold nanoparticles-modified, screen-printed carbon electrode to detect Vibrio parahaemolyticus is presented.

Entwicklung der eine elektrochemische DNA-Biosensor, einem Foodborne Krankheitserreger zu erkennen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Biotechnik

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and water-screening methods used currently. While conventional bacterial detection methods, such as polymerase chain reaction (PCR) and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) can specifically detect pathogenic contaminants, they require extensive sample preparation and lengthy waiting periods. In addition, these practices demand sophisticated laboratory instruments and settings, and must be executed by trained professionals. Herein, a protocol is proposed for a simpler diagnostic technique that features the unique combination of magnetic and fluorescent parameters in a nanoparticle-based platform. The proposed multiparametric magneto-fluorescent nanosensors (MFnS) can detect E. coli O157:H7 contamination with as little as 1 colony-forming unit present in solution within less than 1 h. Furthermore, the ability of MFnS to remain highly functional in complex media such as milk and lake water has been verified. Additional specificity assays were also used to demonstrate the ability of MFnS to only detect the specific target bacteria, even in the presence of similar bacterial species. The pairing of magnetic and fluorescent modalities allows for the detection and quantification of pathogen contamination in a wide range of concentrations, exhibiting its high performance in both early- and late-stage contamination detection. The effectiveness, affordability, and portability of the MFnS make them an ideal candidate for point-of-care screening for bacterial contaminants in a wide range of settings, from aquatic reservoirs to commercially packaged foods.

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

The overall goal of this protocol is to synthesize functional nanosensors for the portable, cost-effective, and rapid detection of specifically targeted pathogenic bacteria through a combination of magnetic relaxation and fluorescence emission modalities.

Foodborne Krankheitserreger Screening mit Magneto-fluoreszierende Nanosensor: Schnellnachweis von E. Coli O157: H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

Immunologie und Infektion

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ

Salmonella is an enteric pathogen able to invade the intestinal epithelium and replicate in enterocytes, both inside Salmonella-specific vacuoles and free in the cytosol (cytosolic hyper-replication). These different phenotypes of intracellular replication drive to different pathways of pathogenesis, i.e., cytosolic hyper-replication induces inflammatory cell death and extrusion into the gut lumen, while vacuolar replication leads to trans-epithelium penetration and systemic spread. Significant effort was made to create microscopy tools to study the behavior of Salmonella inside invaded cells, such as the pCHAR-Duo fluorescence reporter plasmid that allows discrimination between vacuolar and cytosolic bacteria by differential expression of mCherry and GFP. However, intracellular phenotypes are often manually scored, a time-consuming procedure that limits analysis to a small number of samples and cells. To overcome these limitations, two complementary and automated image analyses were developed using ImageJ, a freely available image analysis software. In the high-throughput protocol, epithelial cells were infected with Salmonella carrying pCHAR-Duo using 96-well plates. Imaging was performed using an automated fluorescence microscope. Then, two image analysis methods were applied to measure the intracellular behavior of Salmonella at different detail levels. The first method measures the overall intracellular bacterial load and the extent of cytosolic hyper-replication. It is fast and allows the scoring of a high number of cells and samples, making it suitable for high-throughput assays such as screening experiments. The second method performs single-cell analysis to determine the percentage of infected cells, the mean vacuolar load of Salmonella, and the cytosolic hyper-replication rate giving greater details about Salmonella behavior inside epithelial cells. The protocols can be performed by specifically designed ImageJ scripts to automatically run batch analyses of the major steps of Salmonella-enterocyte interaction.

Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ

Salmonella invades and replicates inside intestinal epithelial cells both in Salmonella-specific vacuoles and free in the cytosol (hyper-replication). A high-throughput fluorescence microscopy-based protocol is described here to quantify the intracellular phenotypes of Salmonella by two complementary image analyses through ImageJ, reaching single-cell resolution and scoring.

Automatisierte Analyse intrazellulärer Phänotypen von Salmonellen mit ImageJ

Salmonella is an enteric pathogen able to invade the intestinal epithelium and replicate in enterocytes, both inside Salmonella-specific vacuoles and free ...

Verfolgung von Krankheitserregern im ganzen Organ durch Quantifizierung von fluoreszierenden Reportern

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen cells within this diverse environment significantly affects their stress levels, responses, fate, and contribution to the overall progression of the disease and treatment failure. However, due to the technical difficulties in locating &#181;m-sized pathogen cells within cm-sized host organs, this area of research has been relatively unexplored. Here, we present a method for addressing this challenge. We employ serial two-photon tomography and AI-enhanced image analysis to locate individual Salmonella cells throughout the entire spleen, liver lobes, and whole lymph nodes of infected mice. Using fluorescent reporters and in vivo antibody administration, the replication rate of single Salmonella cells, their local interaction with specific immune cells, and bacterial responses to antibiotics can be determined. These methodologies open avenues for a comprehensive examination of infections, their prevention, and treatment within the three-dimensional tissue context.

Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der bakteriellen Reaktionen auf Antibiotika und Immunsystem in Geweben

Here, we describe a procedure that enables organ-wide detection of pathogenic bacteria during infection and quantification of fluorescent reporter activities.

Hochauflösende dreidimensionale Ganzorgantomographie von mikrobiellen Infektionen

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

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Tracking-Mikrobielle Kontamination in Einzelhandelsumgebungen mit fluoreszierenden Pulver - Ein Feinkost Einzelhandel Beispiel Umwelt

Farbmetrische Papierbasierte Erkennung von

Der Nachweis von lebensmittelbedingten bakteriellen Erregern von Individual Filth Flies

Entwicklung der eine elektrochemische DNA-Biosensor, einem Foodborne Krankheitserreger zu erkennen

Foodborne Krankheitserreger Screening mit Magneto-fluoreszierende Nanosensor: Schnellnachweis von E. Coli O157: H7

Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Automatisierte Analyse intrazellulärer Phänotypen von Salmonellen mit ImageJ

Hochauflösende dreidimensionale Ganzorgantomographie von mikrobiellen Infektionen

Hochauflösende dreidimensionale Ganzorgantomographie von mikrobiellen Infektionen

Hochauflösende dreidimensionale Ganzorgantomographie von mikrobiellen Infektionen