著者は、マレーシア ・ プトラのサポートを確認したいと思います。

注: 使用するすべての化学・生化学的試薬分析グレードのはず、さらに精製することがなく使用します。滅菌の脱イオン水を使用してのすべてのソリューションを準備します。オートクレーブ滅菌前にすべてのガラス製品。
注意: コントロール (ヒューム フード、グローブ ボックス) をエンジニア リングの使用など研究室の活動を実行するときすべての適切な安全対策を使用してくださいと個人用保護具 (保護メガネ、手袋、白衣、フルの長さのズボン、閉じてつま先靴)。
1. 作製と PLA によって金ナノ粒子を使用して修飾した電極のキャラクタリゼーション
<ol><li>
PLA によって金ナノ粒子の調製とキャラクタリゼーション
	<ol>
<li>すばやく沸騰水性塩化金酸溶液 (1 mM) の 100 mL にクエン酸ナトリウム溶液 (38.8 mM) 10 mL を追加し、周囲温度まで冷却します。黄色、黒への変更として開始し、最終的に暗いルビーとして終了する調製した金ナノ粒子溶液の色の変化を観察します。</li>
		<li>溶融プロセスのステンレス鋼の金型の PLA ペレットを置き、それらを押す手順で 10 分以下の 190 ° C の温度で予熱: PLA シート準備の一部として 1 分 2.2 MPa の圧力の下でそれらを置きます。PLA シートは、約 3 時間冷却した後使用できるようになります。</li>
		<li>活発にかき混ぜながら、室温でクロロホルム 5 mL に PLA シートの 0.68 mg 溶解します。事前に準備された金ナノ粒子溶液 10 mL で溶存の PLA を混合し、均一室温で攪拌します。均質な混合物は PLA によって金ナノ粒子と呼ばれますことができます、EDX を用いた紫外可視、x 線回折、電子顕微鏡、FESEM 特徴付けられます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
変更されたスクリーン印刷されたカーボン電極の作製と評価 注: この研究で使用される空間構成 3 電極システム: 銀/塩化銀参照電極、カーボン電極、対向電極。<ol>
<li>すぐに空間とし、空気に PLA によって金ナノ粒子の均質なソリューションのピペット 25 μ L は 24 h 使用する前にそれを乾燥します。</li>
		<li>、電極の電気化学的特性空間/PLA-, カリウム鉄シアン化物の (K3[Fe(CN)6]3 -/4 -) 活性表面積、電気化学インピー ダンス分光法、再現性を測定するには再現性、および安定性30。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 電気化学的 DNA バイオ センサーの開発
<ol><li>
プローブの準備 注: 一本鎖 Dna プローブと相補的な DNA のシーケンスは、国立生物工学情報 (NCBI) のデータベース センターからの情報に基づいて選ばれました。<ol>
<li>次のシーケンスに基づく商業所から凍結乾燥粉末として総合的なオリゴヌクレオチド (20 mer ssDNA プローブ、20 mer の相補的な DNA、20 mer 一致しない DNA、21 mer 非相補的な DNA) を購入します。 チオール ssDNA プローブ: 5 '-5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG -/3 ' 相補的な DNA: 3 '5' - CAGTGCTTCTGCATAATCCG - 1 つベースが一致しない DNA: 3 '5' - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG - 3 拠点が一致しない DNA: 3 '5' - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG - 非相補的な DNA: 3 '5' - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA -</li>
		<li>分析に分けて滅菌テ ソリューション (10 mM トリス-HCl は、1 ミリメートルの EDTA、pH 7.5) を使用してすべてのオリゴヌクレオチド (100 μ M) の溶液を準備します。-4 ° C でこれを維持し、適切な希釈液を使用する直前。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
固定および交配の最適化 注: PLA 結果、空間/PLA-結果として示されると変更、スペースはこの研究のため使用され、ドロップ キャスト法は DNA の固定化および交配のために使用されました。<ol>
<li>まず、チオール ssDNA プローブ空間/PLA - 結果の 25 μ L を固定し、空気乾燥して、室温で 24 時間後、最後に示されます空間/PLA-金ナノ粒子/ssDNA として。3 つの要因を使用して固定化条件の最適化を決定する: ssDNA (0.2 から 1.4 μ M まで)、(210 分 30 からまで)、時間および温度 (25 から 75 ° C まで) の濃度。</li>
		<li>その後それ表すことができます最後にスペース/PLA-金ナノ粒子/dsDNA として交配イベントを行うスペース/PLA によって金ナノ粒子/ssDNA の表面に相補的な DNA の 25 μ L をピペットします。(30 分 5 に至るまで) 時間と温度 (25 から 75 ° C まで) の 2 つの要因によって交配条件の最適化を決定します。</li>
		<li>固定化を浸すと 20 μ m MB 30 分ハイブリッド電極が 0.5 M ABS で洗浄することにより非具体的に吸着した DNA と過剰な MB を削除/20 mM 塩化ナトリウム (pH 4.5) とで洗浄し、脱イオン水。DPV を用いたメガバイトの削減のピーク電流を測定します。0.1 M PBS (pH 7) を使用する DPV 測定を実行インジケーターが含まれていません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
作製した DNA のバイオ センサーの特性評価
	<ol>
<li>結果、30 分の 20 μ m MB スペース/PLA を浸す、0.5 M abs/20 mM 塩化ナトリウム (pH 4.5) を洗浄し、測定前に脱イオン水で洗い流し。プローブ DNA、相補的な DNA、dna 塩基のミスマッチ、および非相補的な DNA のサンプルを含むすべての相互作用のと同様の手順に従います。</li>
		<li>電気化学的還元を測定します。 メモ: インターフェイス ソフトウェアを商業的に製造された Autolab を使用して DPV を測定しました。 MB の電気化学的還元に至る-0.5 V 0.005 V、0.05 V、変調振幅と 7.73 mVs-1 0.1 M PBS (pH 7) でのスキャン速度の潜在的なステップで 0.25 V、潜在的な公演の DPV 測定にはインジケーターが含まれていません。選択性、感度、再現性、および DNA の作製バイオ センサーの熱安定性をさらに検討しました。報告された結果は、3 つの複製で、平均値測定を発表されました。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 実際のサンプルを使用して作製した DNA のバイオ センサーの検証
<ol><li>菌株の調製
	<ol>
<li>魚介類31,32の重要な汚染に基づいて細菌のサンプルを選択します。 注:ビブリオ参照株と他の 8 の細菌株 (カンピロバクターリステリア菌、サルモネラ菌、腸炎サルモネラ、クレブシエラ肺炎として性大腸菌 o157: h7、ビブリオ菌セレウス菌、) 一般的な食中毒の病原体は、本研究では電気化学的 DNA バイオ センサーの検証のため採用されました。</li>
		<li>彼らの生存率を維持、培養条件、表 1を参照してください彼らのそれぞれの寒天培地に細菌の日常的サブカルチャー 2 週間ごとを実施します。</li>
		<li>グリセリン凍結のプロセス中にそれらを損傷することができます氷結晶の形成を防ぐことによって細菌を保護すると、-80 ° c 20% (v/v) グリセロールを含む、それぞれ成長の流体培養基の細菌の緊張の長期保全を維持します。次に、それぞれの流体培養基にグリセロールで保存された細菌の細胞培養のループを接種します。細菌を復活させるために必要があるときは、それぞれの成長の時間と温度の流体培養基を孵化させなさい。</li>
		<li>希釈のシリーズから派生した微生物を列挙する拡散板法33、標準およびよく知られている方法を用いた腸炎ビブリオ細胞の量を決定します。<ol>
<li>腸炎ビブリオトリプチ醤油スープの文化 (TSB + 3 %nacl) 140 rpm 振動状態で 37 ° C で。その後、TSB + 3% の 9 mL に 1 mL の細菌培養を転送 10-1希釈倍率を取得するための食塩。</li>
		</ol>
</li>
		<li>全シリーズの最大 10-10希釈倍率を取得する 9 回この手順を繰り返します。次に、腸炎ビブリオの選択寒天培地カウント、それぞれの植民地に (10-1010-1から始まって) 各希釈倍率を 0.1 mL を広がってください。24 h の 37 ° C で培養したプレートを孵化させなさい。</li>
		<li>コロニー カウンターを使用して、個々 のコロニーをカウントし、(カウント CFU/戻量希釈倍率 ×) の背中をコロニー形成単位ミリリットル密度 (CFU mL-1) を取得する計算に。CFU mL-1吸光度に対する校正のプロットから細菌細胞懸濁液の単位 (CFUs) を形作っているコロニーの濃度を派生します。</li>
	</ol></li>
	<li>PCR 法の準備
	<ol>
<li>煮沸溶解手順34次の変更されたゲノム DNA を抽出します。最初、ストリーク個々 の細菌の寒天にひずみし、スープ メディア、その相対成長の条件、条件を振って 140 rpm のインキュベーション後に接種します。</li>
		<li>マイクロ遠心チューブに液の 1 mL 文化をピペットします。4830 x g とペレットを取得に 1 分間、4 ° C でこれを遠心します。ペレットの再懸濁液に約 500 μ L の滅菌の TE バッファーを使用します。98 ± 2 ° C 加熱ブロックで 10 分結果の懸濁液を保持し、すぐに細胞を溶解し、DNA をリリース 10 分-18 ° C で冷やします。</li>
		<li>4830 x g と明確なサスペンションを取得し、さらに使用するための-20 ° C で上澄みを維持に 3 分間、4 ° C でゲノム DNA を遠心します。260 の波長に紫外線吸収をもつ biophotometer 測定を使用して nm (核酸は光の波長を吸収) と同時に、波長 280 nm (光の波長を吸収するタンパク質) に濃度と抽出の純度を決定するにはゲノム DNA し、標準的な生化学的アッセイ35を使用しておよび 16S rRNA 遺伝子配列36によってそれらを確認するすべての系統を識別します。最後に、92 ° C 2 分でゲノム DNA を変性し、バイオ センサーへの応用の前に氷の水で急速に冷やします。</li>
		<li>さらに腸炎ビブリオの存在を確認 toxR 遺伝子を対象とする PCR を使用します。たちのプライマー (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' と 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3') を使用してこの手順を実行します。25 μ l の滅菌水 (15.5 μ L)、バッファー (5 μ L)、(1 μ、10 μ M) のプライマー、dNTP ミックス (1 μ L)、DNA テンプレート (2 μ L)、Taq DNA ポリメラーゼ (0.2 μ L, 10 x) から成る全反応量の PCR 増幅を最適化します。</li>
		<li>コンポーネントをよく混ぜ、増幅の 30 サイクル プログラムたちでターゲット シーケンスの PCR 増幅を手配します。私たちの研究では、各サイクルから成って 3 段階反応すなわち。、30 サイクルの変性 (94 ° C 1 分)、(63 ° C、1.5 分) をアニーリングをおよび拡張 (72 ° C、1.5 分)、最終的な拡張 (72 ° C, 7 分) 続いて続いて初期変性 (94 ° C、3 分)。</li>
		<li>増幅産物と 1.5% の agarose のゲルの電気泳動でそのサイズを決定します。市販ゲル ドキュメンテーション システムでゲル画像をキャプチャします。</li>
	</ol></li>
	<li>コックル試料の調製
	<ol>
<li>新鮮なサンプルを取得します。 注: 私たちの新鮮な貝 (Anadara において) に serdang、セランゴール州、ウェット マーケットから得られ、分析用氷クーラー ボックスで研究室にすぐに持って来られます。サンプルを 2 つのグループ、すなわち処理と未処理グループ、こと、貝収穫された均一に収穫の開始から低温貯蔵にそれらを配置することまで想定して分割します。</li>
		<li>事前治療群で 20 ° C の DNA の抽出の前に 4 時間で紫外線の暴露に続いて、24 時間-20 ° C で保存して貝を扱います。 注: 凍結温度と制御に使用される紫外線暴露グループを殺すか、または少なくとも、当然のことながら蓄積腸炎ビブリオ貝の制限します。本研究では制御された条件の目的は、新鮮な貝の実際の状況を模倣する、70 ° C のより高い殺菌政権は適用されません。一方、彼らは研究室に到着するとすぐに前治療なし未処理のグループから直接サンプルを分析します。</li>
		<li>腸炎ビブリオATCC 17802 TSB でのひずみのサブカルチャー (3 %nacl)。TSB の適切な希釈液のめっきによる菌の生菌のレベルを決定する (3 %nacl) 104 CFU mL-1 腸炎ビブリオの菌を取得するためにカリフォルニア州に。各コックル蒸留水で洗うし、スクラブのシェルから組織を削除する層流のキャビネットで無菌の鉗子を使用する前に汚れの自由。</li>
		<li>コックル組織サンプル約 10 g を 90 ml の滅菌 TSB のホモジナイザーを用いた均質化 (3 %nacl) 60 s の追加 9 mL、試料の均質化サンプル スープに腸炎ビブリオの既知の量です。ネガティブ コントロールとしてハワイプ サンプルを使用します。腸炎ビブリオca で、サンプルの 0.1 mL をメッキすることによってしわサンプルにスパイクの細胞数の推定し、抽出、バイオ センサーと PCR の試金で使用されるサンプル DNA の微量遠心チューブに試料 1 mL を分注後。</li>
		<li>煮沸溶解手順36次の改良は、スパイクとハワイプ サンプルから、腸炎ビブリオのゲノム DNA を抽出します。DNA 濃度・純度バイオ光度測定を用いた UV 吸収波長 260 を最後に、決定 nm (核酸は光の波長を吸収) と同時に、波長 280 nm (光の波長を吸収するタンパク質) に。</li>
	</ol></li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

このタイプの電気化学バイオ センサーの開発に成功するためのフレームワークの重要な手順です。 (核酸またはここの DNA) の探触子に対して適切な生物的認識の要素の選択探触子; の検知層を構築するための化学的アプローチ生体材料;DNA の固定化および交配; の最適化実際のサンプルを使用して開発されたバイオ センサーの検証。
固定および交配条件の最適化は、コア?...

近年公共および学術の議論の主要なトピック、食中毒は主に 3 のエージェントに関連付けられている: 微生物1化学2、および寄生虫3。汚染された食物は、人間、特に免疫力が弱い、高齢者、妊婦、赤ちゃん、幼児4とのそれらのより高いリスク グループの深刻な健康の結果を可能性があります。アフリカ、アジア、およびラテン アメリカの 5 歳未満の子供で毎年発生する急性下痢の以上 100 万の場合、食中毒は、世界の主要な疾患5,6と世界保健機関が確立最も重要な貢献者7として微生物。腸炎ビブリオは最も広く知られている病原性菌株の中で際立っています。通常、河口、沿岸及び海洋環境8で発見、それはグラム陰性菌では、高塩分環境でアクティブになりますし、不十分な調理、不適切または生の海洋の食べたとき深刻な人間の胃腸炎を引き起こす製品の9。さらに、何人かの人々 の既存の医療条件を作るそれら傷ビブリオ10から生じる感染症、敗血症や耳の感染症になりやすい。ヘモリジン腸炎ビブリオの病原因子が病気の発症に寄与する 2 つのタイプに分けられる: 耐熱性直接溶血毒 (TDH) tdh 遺伝子によってコード化された、TDH 関連溶血 trh 遺伝子11によってコード化されました。ビブリオの病原性マーカー (tdh と trh 遺伝子) は、環境試料ではなく臨床検体で大抵見つけられます。
腸炎ビブリオ12環境の変化に迅速に対応、条件の広い範囲の下で生き残るために能力を持っています。セル質量13と並行してその毒性が増加するにつれて、その増殖機構はその災害ポテンシャルをエスカレートします。さらに悪いことに、気候変動は、これらの細菌のセル人口成長14を加速する十分な条件を提供しています。腸炎ビブリオ高周波による、食品サプライ チェーン、貿易とそれらの製品は、膨大な量の15,の16の場所からは魚介類の生産で特に監視する必要世界。現在細菌が識別され、隔離された生化学的なテスト、濃縮培地17、酵素免疫吸着などの方法の範囲を使用してアッセイ (ELISA)18、パルス フィールド電気泳動 (PFGE)19、ラテックス凝集反応、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) テスト20。これらのメソッドは、有資格者、洗練された楽器と汚染に関する情報をすぐに提供していない骨の折れるテクニックに通常必要です。これは深刻な有害汚染物と敷地内のアプリケーションを速やかに検出の可能性を制限します。迅速な検出ツールのまま未解決の挑戦です。
バイオセンシング、食品由来の病原体の検出のための有望なオプションとして浮上して、時間を節約、コスト効果の高い、実用的なおよびリアルタイムの分析法21,22,23,24 を提供していますので.ただし、試料及びバイオ センサーを用いた標準液で検体検出の多くの肯定的な結果をされているが、まだある水溶液または有機抽出物25試料への応用研究の欠如。最近では、直接及び間接のデオキシリボ核酸 (DNA) の検出を用いた電気化学バイオ センサーの交配イベント26を介して相補的なターゲットの特異的検出のための科学者の間で注目を受けた,27,28,29. これらのユニークなアプローチは酵素を用いたバイオ センサー、小型化と実用化のための有望な技術をご提供と比較して安定しています。研究の対象は、高選択性、感度、交配時の DNA 配列の特異性に基づく実用性と腸炎ビブリオ検出することができます高速ツールを構築することですここで報告しました。識別方法は、交配インジケーター、メチレン ブルー (MB) の存在下でのポリ酸安定化金ナノ粒子 (PLA によって金ナノ粒子)30スクリーン印刷された炭素電極 (SPCEs) の組み合わせを含みます。開発の検出構成の可能性はさらに検討細菌 dna のライセートと新鮮なしわを使用します。

<table><tbody><tr><td>Acetic acid</td><td>Merck</td><td>100056</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Diaminoethane tetraacetic acid</td><td>Promega</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Dibasic sodium phosphate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Disodium hydrogen phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255793</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16368</td><td></td></tr><tr><td>Gold (III) chloride trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M44907</td><td></td></tr><tr><td>Monobasic sodium phosphate, monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3522</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D</td><td>NatureWorks</td><td>4042D</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>R&amp;amp;M Chemicals</td><td>59435</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hexacyanoferrate III</td><td>R&amp;amp;M Chemicals</td><td>208019</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate anhydrous salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Trisodium citrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl) aminomethane</td><td>Fisher Scientific</td><td>T395-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>2X PCR Master Mix with Dual-Dye</td><td>Norgen Biotek</td><td>28240</td><td></td></tr><tr><td>Agarose gel</td><td>Merck</td><td>101236</td><td></td></tr><tr><td>Bolton Agar</td><td>Merck</td><td>100079</td><td></td></tr><tr><td>Bolton Broth</td><td>Merck</td><td>100079</td><td></td></tr><tr><td>CHROMagar Vibrio</td><td>CHROMagar</td><td>VB910</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0581</td><td></td></tr><tr><td>Eosin methylene blue agar&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>101347</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>41001</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Merck</td><td>104092</td><td></td></tr><tr><td>Go Taq Buffer</td><td>Promega</td><td>M7911</td><td></td></tr><tr><td>Loading dye 100 bp DNA ladder</td><td>Promega</td><td>G2101</td><td></td></tr><tr><td>Loading dye 1kb DNA ladder</td><td>Promega</td><td>G5711</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Promega</td><td>91176</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol egg yolk polymyxin agar</td><td>Merck</td><td>105267</td><td></td></tr><tr><td>McConkey Agar</td><td>Merck</td><td>105465</td><td></td></tr><tr><td>Nutrient Broth</td><td>Merck</td><td>105443</td><td></td></tr><tr><td>Taq polymerase</td><td>Merck</td><td>71003</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase Soy Broth</td><td>Merck</td><td>105459</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase Soy Agar</td><td>Merck</td><td>105458</td><td></td></tr></tbody></table>

development of an electrochemical dna biosensor to detect a foodborne pathogen

(ビブリオ) 腸炎ビブリオ、人間の死亡率と罹患率に大きな影響を与える公衆衛生問題の大きい割合にグローバルに貢献する一般的な食中毒病原体であります。文化法、免疫アッセイと分子手法など腸炎ビブリオの検出のための従来の方法は、複雑なサンプル処理を必要し、時間がかかり、退屈な高価です。最近では、バイオ センサー高速検出、費用対効果、および実用性の利点を持つ有望な包括的な検出方法であると証明しました。この研究は、急速な高選択性と感度のハイブリダイゼーションの原則を使用して腸炎ビブリオ検出法の開発に焦点を当てます。仕事で合成したポリ酸安定の金ナノ粒子 (PLA によって金ナノ粒子) の評価は、x 線回折 (XRD)、紫外可視分光法 (紫外-可視)、透過型電子顕微鏡 (TEM)、電界放出を使用して達成されました。走査型電子顕微鏡 (FESEM) およびサイクリックボルタンメトリー (CV)。さらに、PLA 結果の再現性、感度、安定性のテストを行いました。わかった PLA によって金ナノ粒子が水溶液中で安定化されたナノ粒子の音構造を形成します。また電荷転送の抵抗 (Rct) 値を小さくと活性表面積 (0.41 cm2) の増加の結果として感度が改善したことが観測されました。私たちの DNA のバイオ センサーの開発は、PLA によって金ナノ粒子と酸化還元指示薬としてメチレン ブルー (MB) を使用してスクリーン印刷されたカーボン電極 (空間) の修正に基づいていた。差動パルス ・ ボルタンメトリー (DPV) による固定化と交配イベントを評価しました。相補、補完的、ことがわかったし、不一致のオリゴヌクレオチドは具体的に試作したバイオ センサーによって区別されていました。様々 な食品媒介病原体に対する交差反応性の研究、新鮮な貝で腸炎ビブリオの同定、また確実に高感度検出を分かった。

金ナノ粒子の形成は、現在クエン酸ナトリウムを用いた水溶液の色の変化によって明らかにされました。これは深いルビー色の赤に黄色の光から変更する色を発生します。表面プラズモン共鳴 (SPR) ピークの成長が約 540 で見つかりました紫外-可視スペクトル (図 1) から PLA によって金ナノ粒子の生成が確認された nm。形成と PLA によって金ナノ?...

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Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

食品由来病原体を検出する電気化学的 DNA のバイオ センサーの開発

腸炎ビブリオを検出するポリ酸安定、金ナノ粒子修飾、スクリーン印刷された炭素電極を構成する電気化学的 DNA センサーの開発のためのプロトコルが表示されます。

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

development-an-electrochemical-dna-biosensor-to-detect-foodborne

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K ビュー.  Universiti Putra Malaysia. 腸炎ビブリオを検出するポリ酸安定、金ナノ粒子修飾、スクリーン印刷された炭素電極を構成する電気化学的 DNA センサーの開発のためのプロトコルが表示されます。

ビデオ: Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

核酸、タンパク質と低分子のReagentless検出用電気化学DNAバイオセンサーの作製

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

生物工学

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

電気化学センサを用いた細菌検出＆識別

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

蛍光性DNAzymesを使用した細菌の検出

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

免疫・感染学

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

を光学的に検出<em&gt; E.大腸菌の</emメソポーラスケイ素バイオセンサーによる&gt;バクテリア

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

ラベルフリーDNAハイブリダイゼーション分析のためのマイクロ流体ベースの電気化学バイオチップ

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous mycotoxins in food commodities. In this protocol we show how to fabricate and interrogate an electrochemical competitive Enzyme linked immunomagnetic assay based on the use of magnetic beads as solid support for the immunochemical chain3 and screen printed electrodes as sensing platform.
Our method aims to determine the total amount of HT-2 and T-2 toxins, mycotoxins belonging to the trichothecenes family and of great concern for human health4. The use of an antibody clone with a cross reactivity of 100% towards HT-2 and T-2 allows to simultaneously detect both toxins with similar sensitivity5.
The first step of our assay is the coating step where we immobilize HT2-KLH conjugate toxin on the surface of magnetic beads. After a blocking step, necessary to avoid non-specific absorptions, the addition of a monoclonal antibody allows the competition between immobilized HT-2 and free HT-2 or T-2 present in the sample or dissolved in a standard solution.
At the end of the competition step, the amount of monoclonal antibody linked to the immobilized HT-2 will be inversely proportional to the amount of toxin in the sample solution.
A secondary antibody labeled with alkaline phosphatase (AP) is used to reveal the binding between the specific antibody and the immobilized HT-2. The final measurement step is performed by dropping an aliquot of magnetic bead suspension, corresponding to a specific sample/standard solution, on the surface of a screen-printed working electrode; magnetic beads are immobilized and concentrated by means of a magnet placed precisely under the screen-printed electrode. After two minutes of incubation between magnetic beads and a substrate for AP, the enzymatic product is detected by Differential Pulse Voltammetry (DPV) using a portable instrument (PalmSens) also able to initiate automatically eight measurements within an interval of few seconds.

ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

A protocol to detect trichothecenes (mycotoxins of concern for human health) using a newly developed screening method based on a competitive immunochemical method and a final electrochemical detection is demonstrated.

ELIME（免疫磁気電気化学的にリンクされた酵素）マイコトキシンの検出方法

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

生物学

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and water-screening methods used currently. While conventional bacterial detection methods, such as polymerase chain reaction (PCR) and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) can specifically detect pathogenic contaminants, they require extensive sample preparation and lengthy waiting periods. In addition, these practices demand sophisticated laboratory instruments and settings, and must be executed by trained professionals. Herein, a protocol is proposed for a simpler diagnostic technique that features the unique combination of magnetic and fluorescent parameters in a nanoparticle-based platform. The proposed multiparametric magneto-fluorescent nanosensors (MFnS) can detect E. coli O157:H7 contamination with as little as 1 colony-forming unit present in solution within less than 1 h. Furthermore, the ability of MFnS to remain highly functional in complex media such as milk and lake water has been verified. Additional specificity assays were also used to demonstrate the ability of MFnS to only detect the specific target bacteria, even in the presence of similar bacterial species. The pairing of magnetic and fluorescent modalities allows for the detection and quantification of pathogen contamination in a wide range of concentrations, exhibiting its high performance in both early- and late-stage contamination detection. The effectiveness, affordability, and portability of the MFnS make them an ideal candidate for point-of-care screening for bacterial contaminants in a wide range of settings, from aquatic reservoirs to commercially packaged foods.

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

The overall goal of this protocol is to synthesize functional nanosensors for the portable, cost-effective, and rapid detection of specifically targeted pathogenic bacteria through a combination of magnetic relaxation and fluorescence emission modalities.

E. 大腸菌o157: h7 の食品由来病原体のスクリーニングを使用して磁気蛍光ナノセンサー: 迅速検出

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits the dielectric properties of thin insulator films to enhance the charge density and hence boost the electrowetting effect. The presence of charges results in an electrically induced spreading of the droplet which permits purposeful manipulation across a hydrophobic surface. Here, we demonstrate EWOD-based protocol for sample processing and detection of four categories of antigens, using an automated surface actuation platform, via two variations of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) methods. The ELISA is performed on magnetic beads with immobilized primary antibodies which can be selected to target a specific antigen. An antibody conjugated to HRP binds to the antigen and is mixed with H2O2/Luminol for quantification of the captured pathogens. Assay completion times of between 6 and 10 min were achieved, whilst minuscule volumes of reagents were utilized.

Electrowetting-based digital microfluidic is a technique that utilizes a voltage-driven change in the apparent contact angle of a microliter-volume droplet to facilitate its manipulation. Combining this with functionalized magnetic beads enables the integration of multiple laboratory unit operations for sample preparation and identification of pathogens using Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA).

酵素結合免疫吸着アッセイ用エレクトロウェッティングベースのデジタルマイクロ流体プラットフォーム

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループット プラットフォーム/赤痢菌属

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. Such methods need to be user-friendly and produce reliable results that can be easily interpreted by both specialists and non-professionals. The litmus test for pH is simple, quick, and effective as it reports the pH of a test sample via a simple color change. We have developed an approach to take advantage of the litmus test for bacterial detection. The method exploits a bacterium-specific RNA-cleaving DNAzyme to achieve two functions: recognizing a bacterium of interest and providing a mechanism to control the activity of urease. Through the use of magnetic beads immobilized with a DNAzyme-urease conjugate, the presence of bacteria in a test sample is relayed to the release of urease from beads to solution. The released urease is transferred to a test solution to hydrolyze urea into ammonia, resulting in an increase of pH that can be visualized using the classic litmus test.

We describe a protocol for colorimetric detection of E. coli using a modified litmus test that takes advantage of an RNA-cleaving DNAzyme, urease, and magnetic beads.

リトマス試験を用いて細菌の比色検出

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

食品由来病原体を検出する電気化学的 DNA のバイオセンサーの開発

要約

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核酸、タンパク質と低分子のReagentless検出用電気化学DNAバイオセンサーの作製

電気化学センサを用いた細菌検出＆識別

蛍光性DNAzymesを使用した細菌の検出

を光学的に検出

ラベルフリーDNAハイブリダイゼーション分析のためのマイクロ流体ベースの電気化学バイオチップ

ELIME（免疫磁気電気化学的にリンクされた酵素）マイコトキシンの検出方法

E. 大腸菌o157: h7 の食品由来病原体のスクリーニングを使用して磁気蛍光ナノセンサー: 迅速検出

酵素結合免疫吸着アッセイ用エレクトロウェッティングベースのデジタルマイクロ流体プラットフォーム

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループットプラットフォーム/赤痢菌属

リトマス試験を用いて細菌の比色検出

食品由来病原体を検出する電気化学的 DNA のバイオ センサーの開発

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核酸、タンパク質と低分子のReagentless検出用電気化学DNAバイオセンサーの作製

電気化学センサを用いた細菌検出＆識別

蛍光性DNAzymesを使用した細菌の検出

を光学的に検出

ラベルフリーDNAハイブリダイゼーション分析のためのマイクロ流体ベースの電気化学バイオチップ

ELIME（免疫磁気電気化学的にリンクされた酵素）マイコトキシンの検出方法

E. 大腸菌o157: h7 の食品由来病原体のスクリーニングを使用して磁気蛍光ナノセンサー: 迅速検出

酵素結合免疫吸着アッセイ用エレクトロウェッティングベースのデジタルマイクロ流体プラットフォーム

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループット プラットフォーム/赤痢菌属

リトマス試験を用いて細菌の比色検出

食品由来病原体を検出する電気化学的 DNA のバイオセンサーの開発

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループットプラットフォーム/赤痢菌属