SARS-CoV-2ウイルス様粒子系の作製によるウイルスライフサイクルの in vitro

私たちは、本物のウイルスを密接に模倣したSARS-CoV-2ウイルス様粒子を生成するための最適化された in vitro プロトコルを提示します。このアプローチにより、バイオセーフティレベル3の実験室を必要とすることなく、ウイルスの感染、組み立て、および出口メカニズムの調査が可能になります。

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)ウイルス様粒子(SC2-VLP)法は、バイオセーフティレベル3(BSL-3)の研究所を必要とせずに、SARS-CoV-2のライフサイクルを研究するための強力でアクセス可能なツールを提供します。このシステムは、T20シグナルに融合したルシフェラーゼレポーターを使用して、アセンブリ、ゲノムパッケージング、出口など、ウイルスのライフサイクルの重要な段階を効果的に模倣し、ウイルス粒子の産生を高感度かつ正確に検出します。SC2-VLPは、HEK-293T細胞のRNAパッケージングシグナルとともに、膜(M)、ヌクレオカプシド(N)、エンベロープ(E)、スパイク(S)などのSARS-CoV-2構造タンパク質を共発現させることによって生成されます。従来のウイルス様粒子系とは異なり、SC2-VLP法は正確な定量と自然なウイルスライフサイクルへの忠実度の向上を保証します。さらに、HIVベースのレンチウイルス粒子にSタンパク質を取り込むことでウイルスの侵入を研究するレンチウイルスの疑似タイピング法と比較して、SC2-VLPシステムは、SARS-CoV-2生物学の複数の段階を探索するためのより包括的なプラットフォームを提供します。この方法は、生きたウイルスの取り扱いのリスクを回避し、アクセシビリティを拡大します。SC2-VLP法は、抗ウイルス研究とSARS-CoV-2に対する治療戦略の開発における大きな進歩を表しています。

COVID-19のパンデミックは、現代史で最も壊滅的な世界的な健康危機の1つとして浮上し、世界中で何百万人もの死者を出しています¹。原因となるウイルスであるSARS-CoV-2は、感染、ゲノム複製、組み立て、出口などの主要な段階を含む複雑なライフサイクルをたどります。感染プロセスは、ウイルスのスパイクタンパク質(S)が宿主細胞受容体であるアンジオテンシン変換酵素2(ACE2)に結合し、ウイルスゲノムの宿主細胞への放出を促進するときに始まります^2,3。次に、ウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)は、ゲノムRNAの複製を触媒します。このRNAは、ヌクレオカプシドタンパク質(N)と複合体を形成し、膜タンパク質(M)によって認識される安定した構造を形成します。Mタンパク質は、RNA-N複合体Sとエンベロープタンパク質(E)^4,5を動員することにより、ウイルスの集合において中心的な役割を果たします。組み立て後、ビリオンは非標準的なリソソーム媒介の人身売買経路⁶を通ってその出口を完了する。

パンデミックに対応して、ワクチン、中和抗体、抗ウイルス薬の開発に、世界に多大な資源が動員されました。これらの介入の評価は、SARS-CoV-2研究を進める上で不可欠でした⁷。しかし、生きたウイルスの研究には、ウイルスに関する実験をバイオセーフティレベル3(BSL-3)の研究所で実施する必要があるため、物流上の大きな課題があります。BSL-3施設の利用可能性が限られているため、SARS-CoV-2の理解と闘いを目的とした研究のペースが制約されています。

これらの課題に対処するために、SARS-CoV-2の研究には、ウイルス様粒子(VLP)とレンチウイルスのシュードタイピングという2つの主要なシステムが広く採用されており、どちらもBSL-3の封じ込めを必要としない⁸。VLPシステムは、M、S、E、Nなどのウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子を細胞に同時導入し、これらが一緒になってウイルス様粒子を生成します。これらの粒子は、ウイルスの構造的および機能的特性を模倣しているため、SARS-CoV-2のライフサイクルにおける主要なプロセスを研究するための貴重なツールであり、さらにはワクチン開発に有効な抗原でもあります^9,10,11。

一方、レンチウイルスのシュードタイピングシステムでは、レンチウイルスの水疱性口内炎ウイルス(VSV)Gタンパク質をSARS-CoV-2 Sタンパク質に置き換えることで、ルシフェラーゼやGFPなどのレポーター遺伝子を取り込むレンチウイルス粒子の産生が可能になります。このシステムは、S-ACE2相互作用を阻害する中和抗体の研究に特に有用である¹²。しかし、レンチウイルスのシュードタイピングは、原形質膜での粒子放出を媒介するHIV構造タンパク質を使用しているため、SARS-CoV-2ウイルスの集合または排出を反映していません。

これらの制限を克服するために、Syedらは最近、RNAゲノム内のSARS-CoV-2パッケージングシグナルを同定し、ウイルスゲノム認識に対するNタンパク質の特異性を実証しました¹³。このパッケージングシグナルをレポーター遺伝子に融合させることで、これらの遺伝子をSARS-CoV-2ウイルス様粒子(SC2-VLP)に効率的に取り込むことが可能である¹³。この戦略は、SARS-CoV-2の組み立てと出口のプロセスを再現するだけでなく、感染ステップの高感度な測定も可能にします。本研究では、SC2-VLPシステムを使用するための実験方法論を紹介し、このアプローチを実施するための重要な考慮事項に焦点を当てます。

1. SC2-VLPの生成

1. 直径10 cmの組織培養プレートに~3.0 × 10⁶ HEK-293T細胞を10 cmのDMEM完全培地で播種し、10% v/v FBSと1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加します。
   注:高いトランスフェクション効率と最適なSC2-VLP産生を確保するために、HEK-293T細胞は低い継代数~10に維持する必要があります。
2. HEK-293T細胞を37°C、5%_CO2 で約24時間培養し、顕微鏡で細胞の密度を確認します。~70% がコンフルエントな場合は続行します。
3. 1 mg/mLストックのPEI60 μLを無血清培地で200 μLに希釈します。
4. 6.7 μgのNプラスミド、10 μgのLuc-T20プラスミド、0.016 μgのSプラスミド、および3.3 μgのM-IRES-Eプラスミドを200 μLの無血清培地に加えます( 補足ファイル1を参照)。
5. ステップ1.3で希釈したPEIを、ステップ1.4でウイルス構造タンパク質をコードするプラスミドを含む溶液に穏やかに加え、室温で10分間インキュベートします。これがトランスフェクションソリューションです。
6. ステップ1.5のトランスフェクション溶液をHEK-293T細胞に慎重に滴下し、組織培養プレートを静かに渦巻かせて十分に混合します。
7. 感染後6時間後に細胞培養培地をDMEM完全培地と交換し、トランスフェクションしたHEK-293T細胞を37°C、5%CO₂ で48時間インキュベートします。
8. 感染したHEK-293T細胞の上清(SC2-VLPを含む)を採取し、0.45μmのシリンジフィルターで上清をろ過して細胞の破片を取り除きます。これがSC2-VLP媒体です。
   注:HeLa、Vero E6、およびCaco2細胞株でSC2-VLPを作製しようと試みましたが、測定可能なウイルス力価は得られず、HEK-293T細胞に対するプロトコルの特異性が示されました。

2. SC2-VLPの有効性の検討

注:ACE2およびTMPRSS2を安定的に発現するHEK-293T細胞株は、レンチウイルス形質導入アプローチを用いて樹立された^14,15。ACE2およびTMPRSS2の両方のタンパク質発現は、ステップ3(SC2-VLP組成分析)で説明したのと同様のプロトコルに従って、ウェスタンブロット分析によって確認されました。

1. 96ウェルプレートでACE2およびTMPRSS2の安定発現を持つ4.0 × 10⁴ HEK-293T細胞を播種し、ステップ1.8から50 μLのSC2-VLP培地を添加します。
2. 96ウェル組織培養プレートを37°Cで5%CO₂ と共に24時間インキュベートします。
3. 培地を96ウェルプレートから取り出し、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、および1.8 mM KH₂PO₄を含む100 μLのPBSバッファーを37°Cで1回洗浄します。
4. HEK-293T ACE2/TMPRSS2細胞を20 μLのパッシブ溶解バッファーで溶解し、サンプルを室温のオービタルシェーカーで15分間静かに振とうします。
   注:溶解バッファーには、25 mMのリン酸トリス(pH 7.8)、2 mM DTT、2 mM 1,2-ジアミノシクロヘキサン-N、N、N'、N'-四酢酸、1.25 mg/mLリゾチーム、2.5 mg/mL BSA、10%グリセロール、および1%トリトンX-100)が含まれています。
5. 96ウェルプレートを冷蔵マイクロプレート遠心分離機で4,000 × g 、4°Cで15分間回転させた後、すぐにプレートをアイスバスに移します。
6. 再構成したルシフェラーゼアッセイバッファー100 μLを不透明な白色96ウェルプレートに取り、ステップ2.5のライセート20 μLを添加します。ピペッティングで2〜3回軽く混ぜます。
7. プレートリーダーを使用して、次のパラメータで発光を測定します: 検出モード:発光;波長範囲:フルスペクトル。プレートフォーマット:96ウェル標準不透明プレート;積分時間:200ミリ秒

3. SC2-VLP組成の検討

1. ステップ 1.8 の SC2-VLP 培地 10 mL に、50% PEG 8000 と 2.2% NaCl を含む 1.36 mL の PEG 8000 溶液を加えます。
2. 混合物をオービタルシェーカーに保管し、溶液を4°Cで一晩ゆっくりと混合します。
3. 溶液を4°C、2,000 × g で30分間遠心分離し、SC2-VLPペレットをウェスタンブロッティング分析のために回収します¹⁶。
   注:ウェスタンブロッティング分析では、抗体に関するすべての情報が 材料表に記載されています。

4. SC2-VLP産生細胞におけるSおよびその変異体の細胞内局在解析

1. 直径15 mmのガラス底培養皿に~3.0 × 10^{個の 6} HEK-293T 細胞を均等に播種し、トランスフェクション前に細胞を ~70% のコンフルエントになるまで接着して増殖させます。
2. ステップ 1.3 から 1.7 で説明したトランスフェクション手順を繰り返し、次のようにプラスミドの量のみを変更します: N プラスミド: 1.3 μg、Luc-T20 プラスミド: 2 μg、S プラスミド: 0.0032 μg、M-IRES-E プラスミド: 0.66 μg。
3. 培養皿を氷冷PBS1 mLで2回穏やかに洗浄し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)固定溶液1 mLを室温(RT)で15分間加えます。
4. RTで1 mLのPBSで細胞を2 x 5分間洗浄し、その後、0.25% Triton X-100 1 mLをRTで10分間加えて細胞を透過化します。
5. RTで1 mLのPBSで細胞を2 x 5分間洗浄し、次にRTで5%ウシ血清アルブミン(BSA)1 mLを1時間加えて、非特異的抗体相互作用をブロックします。
6. ~200 μLの一次抗体溶液(ガラス底を覆うのに十分)を加え、4°Cで一晩インキュベートします。
   注:一次抗体溶液は、PBSに溶解した5% BSAを次の希釈比で希釈することにより調製します:マウス抗S抗体1:200、ウサギ抗Sec61β抗体1:200、ウサギ抗GM130抗体1:200、およびウサギ抗ERGIC53抗体1:200。5% BSA/PBS溶液は、希釈剤およびブロッキングバッファーの両方として機能し、その後の免疫蛍光染色手順における非特異的結合を最小限に抑えました。
7. 一次抗体溶液を取り出し、RTで1 mLのPBSで細胞を3 x 5分間洗浄します。
8. 蛍光標識二次抗体溶液を室温で1時間加えた後、室温で1mLのPBSで細胞を3×5分間洗浄します。
   注:その後のすべての手順は、蛍光コンジュゲートの光退色を防ぎ、シグナルインテグリティを維持するために、暗闇または最小限の光曝露で実行する必要があります。マウスまたはウサギに由来する2種類の蛍光標識二次抗体を使用して、Sタンパク質または細胞小器官マーカータンパク質のいずれかを染色します。
9. 2.5 μg/mL Hoechst溶液で核を室温で5分間染色し、その後、室温で1 mLのPBSで細胞を3 x 5分間洗浄します。
10. Sタンパク質またはオルガネラの染色を観察し、共焦点顕微鏡を使用して次のパラメータで画像を取得します:PMTモードをVBF(平均化なし、ラインシーケンシャルスキャン)に設定、自動共焦点開口付き。チャンネル 1 (FITC) では、488 nm レーザーを 25% 出力、500 - 548 nm 放射、HV 525 V、ゲイン 1x、オフセット 5% で使用します。チャンネル2(Alexa Fluor 594)では、594 nmレーザーを25%の出力で使用し、610 - 670 nmの放射、HV 500 V、ゲイン1x、オフセット5%で使用します。チャネル 3 (DAPI) では、405 nm レーザーを 25% の出力で使用し、430 から 470 nm の放射、HV 490 V、ゲイン 1x、オフセット 5% を使用します。

SARS-CoV-2のライフサイクルの出口と組み立てのステップは、感染と複製のステップ^17,18よりも研究されていません。SC2-VLP法が開発される前は、これらのプロセスは生きたSARS-CoV-2を使用してのみ調査することができ、研究はBSL-3研究所に限定されていました¹³。図1に示すSC2-VLPワークフローは、実験プロトコルの概要を示し、SARS-CoV-2ライフサイクルのこれらのステップに関与するプロセスを示しています。このアプローチでは、SARS-CoV-2の構造タンパク質(M、E、S、N)とRNAパッケージングシグナル(T20)をコードするプラスミドをHEK-293T細胞に同時トランスフェクトします。T20シグナルに融合したルシフェラーゼレポーターにより、放出されたSC2-VLPを高感度に検出でき、図1に示すように、SARS-CoV-2受容体ACE2およびTMPRSS2を発現するレシピエント細胞に感染する可能性があります。

SARS-CoV-2 構造タンパク質とパッケージングシグナル、特に S プラスミドをコードするプラスミドの量を最適化するために、さまざまな濃度の S プラスミドで HEK-293T 細胞をトランスフェクションしました。その結果、Sプラスミドと他のプラスミドの比率が1:10であることが、SC2-VLP産生に最適な条件を提供することが明らかになりました(図2)。この知見は、Syedらによる以前の報告と一致しており、SARS-CoV-2ウイルス粒子に最も多く存在する成分の1つであるにもかかわらず、Sタンパク質の発現レベルがM、N、Eタンパク質に比べて相対的に低い理由を合理的に説明しています。

SC2-VLPシステムは、SARS-CoV-2の組み立てプロセスを研究するための強力なモデルとして機能し、ウイルスエンベロープ形成とゲノムパッケージングの両方を忠実に再現します。現在の証拠は、N、S、およびEなどの他の構造タンパク質の動員を促進する、アセンブリにおけるMタンパク質の中心的な役割を強調しています。これらのタンパク質の免疫染色は、SARS-CoV-2アセンブリ^19,20の主要な部位であるERGICまたはシス-ゴルジ複合体である可能性のある細胞内小器官内でのそれらの局在を明らかにしています。.このことは、SC2-VLPシステムがウイルスの集合メカニズムを解剖するための貴重なツールとしての可能性を強調しています。アセンブルにおけるSの役割をさらに調査するために、COPIを介したSソーティングを妨害するH1271E変異を導入し、それによってSのビリオンへの取り込みを損ないました^21,22。レシピエント細胞では、この変異によりルシフェラーゼ活性が大幅に低下し、SC2-VLPシステムがウイルス感染を忠実に再現するだけでなく、従来のレンチウイルス偽タイピングシステムではアクセスできなかったSARS-CoV-2アセンブリを研究するための強力なツールとしても役立つことが確認されました(図3)。さらに、包括的な変異スキャンアプローチを採用し、S C末端尾部の個々の残基(1,255-1,273)を標的とし、H1271Eのようにビリオンの集合を弱め、ウイルス力価を低下させる可能性のある追加の変異を特定しました。図3は、E1262H変異がSC2-VLP産生を有意に減少させる一方で、H1271E/E1262H二重変異体がSC2-VLP産生を完全に消失させることを示しています。これらの結果は、E1262が未同定の宿主因子との潜在的な相互作用に関与していることを示唆しています。この領域に結合する宿主タンパク質、特にE1261に依存するタンパク質のさらなる特性評価により、SARS-CoV-2の集合を支配する新たなメカニズムが明らかになる可能性がある。これらの知見をまとめると、SC2-VLPは、細胞培養システムにおけるウイルス集合を研究するための汎用性が高く、生理学的に関連性のあるプラットフォームとして確立されます。

SC2-VLP産生細胞におけるSタンパク質の細胞内局在を評価するために、野生型Sタンパク質とそのH1271E変異体の両方の免疫染色分析を行いました。その結果、Sタンパク質は主に シスゴルジマーカーGM130と共局在し、ERマーカーSec61βまたはERGICマーカーERGIC-53との重複は最小限に抑えられていることが示されています。これらの知見は、真正なSARS-CoV-2感染におけるS細胞内局在に関するこれまでの観察結果と一致している²³。対照的に、H1271E変異体はびまん性分布パターンを示し、 シスゴルジマーカーGM130との共局在は示されませんでした。このことは、この変異がウイルスの集合部位への適切な局在を阻害し、SARS-CoV-2ウイルスの集合を促進する能力が損なわれていることを説明できることを示唆しています(図4)。これらの結果により、SC2-VLPは、Sやその他のウイルス構造タンパク質の生物学的機能を研究するための貴重なツールとしてさらに確立されました。

図1:SC2-VLPの製造とそのアプリケーションの概略図。 SARS-CoV-2ゲノムRNAパッケージングシグナルであるT20はシアンで強調表示され、Sタンパク質は濃い緑色で示されています。プラスミドは、M、E、N、SS などの SARS-CoV-2 の構造タンパク質をコードし、M と E は 1 つのベクターから共発現します。矢印で示されているように、アセンブリ(薄緑色)、出口(水色)、感染(オレンジ色)など、ウイルスのライフサイクルの主要な段階が示されています。略語:SARS-CoV-2 =重症急性呼吸器症候群-コロナウイルス2;SC2-VLP = SARS-CoV-2-ウイルス様粒子。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:Sをコードするプラスミドのトランスフェクション量に対するSC2-VLP力価の感度 (A) SARS-CoV-2構造タンパク質をコードするプラスミドのトランスフェクション量とgRNAパッケージングシグナルを示す表。(B)SC2-VLP力価は、Sをコードするプラスミドのトランスフェクション量に応じて変化します。略語:SARS-CoV-2 =重症急性呼吸器症候群-コロナウイルス2;SC2-VLP = SARS-CoV-2-ウイルス様粒子;gRNA =ガイドRNA;RLU = 相対発光単位。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:Sアセンブリのビリオンへの調査に使用したSC2-VLPシステム。 (A)COPIの人身売買に影響を与えるS変異体は、SC2-VLP力価の低下をもたらす。(B)SC2-VLP中のSARS-CoV-2 SおよびNタンパク質存在量のウェスタンブロット分析(C)(B)から計算されたSパッケージング効率、SC2-VLP存在量をNタンパク質レベルに正規化した状態。(D)(B)からのSC2-VLP存在量の定量化。略語:SARS-CoV-2 =重症急性呼吸器症候群-コロナウイルス2;SC2-VLP = SARS-CoV-2-ウイルス様粒子;RLU = 相対発光単位;Ctr = コントロール;WT = 野生型;mut = 突然変異体;NS = 有意ではありません。全長SARS-CoV-2スパイク(S)タンパク質に対応するバンドはSとラベル付けされ、S2フラグメント(残基816-1,273)はSタンパク質のC末端部分を表し、SとS2の間の非特異的バンドは^NS24として示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:S細胞内局在を調べるために使用したSC2-VLPシステム。 (A-I)細胞オルガネラマーカーの共染色によるSC2-VLP産生HEK-293T細胞におけるWT Sの代表的な免疫染色画像。(A-C)ERマーカー:(D-F)Sec61β、(G-I)ERGICマーカー:ERGIC-53; シス・ゴルジ複合体マーカー:GM130。(J-L)S E1262H変異体と シスゴルジマーカーGM130の共局在。Sは緑、細胞小器官マーカーは赤、細胞核は青で染色されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:N、Luc-T20プラスミド、Sプラスミド、およびM-IRES-EプラスミドのDNA配列。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

BSL-3研究室の制約を受けずに、細胞培養システムにおけるSARS-CoV-2のライフサイクルをモデル化するシンプルで効果的な方法は、抗SARS-CoV-2研究にとって極めて重要な進歩です。SC2-VLP法はこのニーズを満たし、堅牢でアクセス可能なプラットフォームを提供します。この研究では、SC2-VLP法の詳細なプロトコルを提供し、SC2-VLPを作製するための重要な実験ステップを概説します。さらに、SARS-CoV-2生物学の理解を深め、抗ウイルス戦略の開発を促進するためのその汎用性と潜在的なアプリケーションを強調します。

従来のSARS-CoV-2 VLPおよびレンチウイルスシュードタイピング法は、抗SARS-CoV-2研究で広く使用されています^8,25。従来のVLP法では、SARS-CoV-2の構造タンパク質M、N、E、Sが共発現してウイルス粒子を作製します²⁶、その存在量は通常、WB分析によって監視されます。しかし、ウイルス構造タンパク質は、エクソソームなどの他の膜構造にも組み込まれており、ウイルス粒子のWB分析を複雑にしている²⁷。これに対し、SC2-VLP法では、T20シグナルにレポーター遺伝子が融合しているため、レポーターをウイルス粒子に効率的にパッケージングすることができます。これにより、WB分析だけに頼ることなく、粒子の存在量を高感度かつ特異的に検出することができます。さらに、SC2-VLP法は、従来のVLP法と比較して、生きたSARS-CoV-2の全ライフサイクルをより忠実に模倣しています。

SC2-VLP法は、いくつかの重要な点でレンチウイルスの疑似タイピングアプローチを凌駕しています。レンチウイルス疑似タイピングシステムは、HIV-1ウイルスのフレームワークに依存しており、ビリオンが組み立てられ、原形質膜から出芽します。対照的に、SARS-CoV-2ビリオンはERGICまたは シスゴルジ複合体内で組み立てられ、それらのライフサイクルの根本的な違いを強調しています。この不一致により、レンチウイルス疑似タイピング法は、SARS-CoV-2のライフサイクルの主要な段階(複製、アセンブリ、エグレスなど)の研究には適さず、ウイルスの侵入や感染の研究への適用が制限されます。

SC2-VLP法は、SARS-CoV-2のライフサイクルを研究するためのシンプルで強力なツールです。真正ウイルスを使用しないため、この方法はBSL-3施設へのアクセスを必要とせずに多くの研究所で採用できます。しかし、SC2-VLPシステムから得られた知見を生きたSARS-CoV-2を用いて検証し、その精度と生物学的関連性を確保することは依然として重要です。

著者には、開示すべき利益相反はありません。

この研究は、北京中医薬大学(BUCM)(90011451310011)のスタートアップファンドプログラムの支援を受けました。BUCMのMa博士研究室の全てのメンバーに、実験に関する貴重な議論と支援をいただいたことに感謝いたします。