JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים פרוטוקול מבחנה אופטימלי לייצור חלקיקים דמויי נגיף SARS-CoV-2 המחקים באופן הדוק את הנגיף האותנטי. גישה זו מאפשרת לחקור מנגנוני זיהום, הרכבה ויציאה של זיהום נגיפי ללא האילוצים של דרישת מעבדת בטיחות ביולוגית ברמה 3.

Abstract

שיטת החלקיקים דמויי הנגיף (SC2-VLP) של תסמונת נשימתית חריפה חמורה - נגיף קורונה 2 (SARS-CoV-2) מציעה כלי רב עוצמה ונגיש לחקר מחזור החיים של SARS-CoV-2 ללא צורך במעבדות בטיחות ביולוגית ברמה 3 (BSL-3). מערכת זו מחקה ביעילות שלבים קריטיים במחזור החיים הנגיפי, כולל הרכבה, אריזת גנום ויציאה, באמצעות מדווח לוציפראז המותך לאות T20 לזיהוי רגיש ומדויק של ייצור חלקיקים נגיפיים. SC2-VLPs נוצרים על ידי ביטוי משותף של חלבונים מבניים של SARS-CoV-2, כולל ממברנה (M), נוקלאוקפסיד (N), מעטפת (E) וספייק (S), יחד עם אות אריזת ה-RNA בתאי HEK-293T. בניגוד למערכות חלקיקים מסורתיות דמויות נגיף, שיטת SC2-VLP מבטיחה כימות מדויק ונאמנות רבה יותר למחזור החיים הנגיפי הטבעי. יתר על כן, בהשוואה לשיטות פסאודו-טיפוס לנטי-ויראליות, המוגבלות לחקר כניסה ויראלית באמצעות שילוב של חלבון S בחלקיקים לנטי-ויראליים מבוססי HIV, מערכת SC2-VLP מספקת פלטפורמה מקיפה יותר לחקר שלבים מרובים של ביולוגיה של SARS-CoV-2. בעוד ששיטה זו עוקפת את הסיכונים בטיפול בנגיף חי ומרחיבה את הנגישות. שיטת SC2-VLP מייצגת התקדמות משמעותית במחקר אנטי-ויראלי ובפיתוח אסטרטגיות טיפוליות נגד SARS-CoV-2.

Introduction

מגיפת COVID-19 התגלתה כאחד ממשברי הבריאות העולמיים ההרסניים ביותר בהיסטוריה המודרנית, וכתוצאה מכך מיליוני מקרי מוות ברחבי העולם1. הנגיף האחראי, SARS-CoV-2, עוקב אחר מחזור חיים מורכב הכולל שלבי מפתח כגון זיהום, שכפול גנום, הרכבה ויציאה. תהליך ההדבקה מתחיל כאשר חלבון הספייק הנגיפי (S) נקשר לקולטן התא המארח, אנזים הממיר אנגיוטנסין 2 (ACE2), מה שמקל על שחרור הגנום הנגיפי לתא המארח 2,3. לאחר מכן, ה-RNA פולימראז התלוי ב-RNA הנגיפי (RdRp) מזרז את השכפול של ה-RNA הגנומי. RNA זה, בקומפלקס עם חלבון הנוקלאוקפסיד (N), יוצר מבנה יציב המזוהה על ידי חלבון הממברנה (M). חלבון M ממלא תפקיד מרכזי בהרכבה הנגיפית על ידי גיוס קומפלקס ה-RNA-N, S, וחלבון המעטפת (E)4,5. לאחר ההרכבה, הוויריון משלים את יציאתו דרך נתיב סחר לא קנוני בתיווך ליזוזום6.

בתגובה למגפה גויסו משאבים גלובליים משמעותיים לפיתוח חיסונים, נוגדנים מנטרלים ותרופות אנטי-ויראליות. הערכת התערבויות אלה הייתה חיונית לקידום מחקר SARS-CoV-27. עם זאת, חקר הנגיף החי מציב אתגרים לוגיסטיים משמעותיים, שכן ניסויים הכוללים את הנגיף חייבים להתבצע במעבדות ברמת בטיחות ביולוגית 3 (BSL-3). הזמינות המוגבלת של מתקני BSL-3 הגבילה את קצב המחקר שמטרתו להבין ולהילחם ב-SARS-CoV-2.

כדי להתמודד עם אתגרים אלה, שתי מערכות עיקריות - חלקיק דמוי וירוס (VLP) ופסאודוטיפ לנטי-ויראלי - אומצו באופן נרחב במחקר SARS-CoV-2, שניהם אינם דורשים הכלת BSL-38. מערכת ה-VLP כוללת טרנספקציה משותפת של תאים עם גנים המקודדים חלבונים מבניים ויראליים, כולל M, S, E ו-N, המייצרים יחד חלקיקים דמויי נגיף. חלקיקים אלה מחקים את התכונות המבניות והתפקודיות של הנגיף, מה שהופך אותם לכלי רב ערך לחקר תהליכי מפתח במחזור החיים של SARS-CoV-2, ואפילו לאנטיגן יעיל לפיתוח חיסון 9,10,11.

לעומת זאת, מערכת הפסאודוטיפ של לנטי-ויראלי כוללת החלפת חלבון G של נגיף הסטומטיטיס השלפוחית (VSV) ב-lentivirus בחלבון SARS-CoV-2 S, המאפשר ייצור של חלקיקים לנטי-ויראלים שיכולים לשלב גנים מדווחים כגון לוציפראז או GFP. מערכת זו שימושית במיוחד לחקירת נוגדנים מנטרלים החוסמים את אינטראקציית S-ACE212. עם זאת, פסאודוטיפ לנטי-ויראלי אינו משקף הרכבה או יציאה של נגיף SARS-CoV-2 עקב השימוש בחלבונים מבניים של HIV, המתווכים שחרור חלקיקים בקרום הפלזמה.

כדי להתגבר על מגבלות אלה, סייד ועמיתיו זיהו לאחרונה את אות האריזה של SARS-CoV-2 בתוך גנום ה-RNA שלו, מה שמדגים את הספציפיות של חלבון ה-N לזיהוי גנום ויראלי13. על ידי מיזוג אות האריזה הזה לגנים המדווחים, ניתן לשלב ביעילות את הגנים הללו בחלקיקים דמויי נגיף SARS-CoV-2 (SC2-VLPs)13. אסטרטגיה זו לא רק משכפלת את תהליכי ההרכבה והיציאה של SARS-CoV-2 אלא גם מאפשרת מדידה רגישה של שלבי ההדבקה. במחקר זה, אנו מציגים את המתודולוגיה הניסיונית לשימוש במערכת SC2-VLP ומדגישים שיקולים מרכזיים לביצוע גישה זו.

Protocol

1. יצירת SC2-VLPs

  1. זרע ~ 3.0 × 106 תאי HEK-293T בצלחת תרבית רקמה בקוטר 10 ס"מ עם מדיום שלם DMEM, בתוספת 10% v/v FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
    הערה: כדי להבטיח יעילות טרנספקציה גבוהה וייצור SC2-VLP אופטימלי, יש לשמור על תאי HEK-293T במספרי מעבר נמוכים ~10.
  2. תרבית תא HEK-293T ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך כ-24 שעות, ובדוק את מפגש התאים במיקרוסקופ. המשך אם ~70% מתלכדים.
  3. יש לדלל 60 מיקרוליטר PEI ממלאי של 1 מ"ג/מ"ל ל-200 מיקרוליטר עם מדיום נטול סרום.
  4. הוסף 6.7 מיקרוגרם של פלסמיד N, 10 מיקרוגרם של פלסמיד Luc-T20, 0.016 מיקרוגרם של פלסמיד S ו-3.3 מיקרוגרם של פלסמיד M-IRES-E לתוך 200 מיקרוליטר של מדיום נטול סרום (ראה קובץ משלים 1).
  5. הוסף בעדינות את ה-PEI המדולל משלב 1.3 לתמיסה המכילה פלסמידים המקודדים לחלבוני מבנה ויראלי משלב 1.4, ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. זהו פתרון הטרנספקציה.
  6. זרוק בזהירות את תמיסת הטרנספקציה משלב 1.5 על תאי HEK-293T, וסובב בעדינות את צלחת תרבית הרקמה לערבוב יסודי.
  7. החלף את מדיום תרבית התאים 6 שעות לאחר ההדבקה במדיום השלם DMEM, ודגירה על תאי HEK-293T שהועברו ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 48 שעות.
  8. אספו את הסופרנטנט של תאי HEK-293T הנגועים, שמכיל את SC2-VLPs, ואז סננו את הסופרנטנט דרך מסנן מזרק של 0.45 מיקרומטר כדי להסיר פסולת תאים. זהו מדיום SC2-VLP.
    הערה: ניסינו לייצר SC2-VLPs בשורות תאי HeLa, Vero E6 ו-Caco2, אך לא הושג טיטר ויראלי מדיד, מה שמצביע על הספציפיות של הפרוטוקול עבור תאי HEK-293T.

2. בחינת יעילות SC2-VLP

הערה: קו התאים HEK-293T המבטא ביציבות ACE2 ו-TMPRSS2 הוקם באמצעות גישת התמרה לנטי-ויראלית14,15. ביטוי חלבון הן של ACE2 והן של TMPRSS2 אושר על ידי ניתוח כתמים מערביים, בעקבות פרוטוקול דומה לזה שתואר בשלב 3 (ניתוח הרכב SC2-VLP).

  1. זרע 4.0 × 104 תאי HEK-293T עם ביטוי יציב של ACE2 ו-TMPRSS2 בצלחת של 96 בארות והוסף 50 מיקרוליטר של מדיום SC2-VLP משלב 1.8.
  2. דגרו את צלחת תרבית הרקמה בת 96 הבארות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 24 שעות.
  3. הסר את המדיום מצלחת 96 הבארות, ושטוף פעם אחת עם 100 מיקרוליטר של מאגר PBS ב-37 מעלות צלזיוס, המכיל 137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na2HPO4 ו-1.8 מ"מ KH2PO4.
  4. ליז את תאי HEK-293T ACE2/TMPRSS2 עם 20 מיקרוליטר של מאגר ליזה פסיבי, ונדנד בעדינות את הדגימה למשך 15 דקות על שייקר אורביטלי בטמפרטורת החדר.
    הערה: מאגר הליזיס מכיל 25 מ"מ טריס-פוספט (pH 7.8), 2 מ"מ DTT, 2 מ"מ 1,2-דיאמינוציקלוהקסאן-N,N,N′,N′-חומצה טטראצטית, 1.25 מ"ג/מ"ל ליזוזים, 2.5 מ"ג/מ"ל BSA, 10% גליצרול ו-1% טריטון X-100).
  5. סובב את צלחת 96 הבארות ב-4,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה מיקרו-צלחת מקוררת, ולאחר מכן העביר מיד את הצלחת לאמבטיית קרח.
  6. קח 100 מיקרוליטר של מאגר בדיקת לוציפראז משוחזר לצלחת לבנה אטומה של 96 בארות, והוסף 20 מיקרוליטר ליזט משלב 2.5. מערבבים אותם בקצרה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה פי 2-3.
  7. מדוד את הזוהר באמצעות קורא צלחות עם הפרמטרים הבאים: מצב זיהוי: זוהר; טווח אורכי גל: ספקטרום מלא; פורמט צלחת: צלחת אטומה סטנדרטית של 96 בארות; זמן אינטגרציה: 200 אלפיות השנייה.

3. בחינת הרכב SC2-VLP

  1. הוסף 1.36 מ"ל של תמיסת PEG 8000, המכילה 50% PEG 8000 ו-2.2% NaCl, ל-10 מ"ל של מדיום SC2-VLP משלב 1.8.
  2. שומרים את התערובת על שייקר אורביטלי, ומערבבים לאט את התמיסה בטמפרטורה של 4 מעלות למשך הלילה.
  3. צנטריפוגה את התמיסה ב-4 מעלות צלזיוס, 2,000 × גרם למשך 30 דקות, ואספו את גלולת SC2-VLP לניתוח כתמים מערביים16.
    הערה: לניתוח הכתם המערבי, כל המידע לגבי הנוגדנים מסופק בטבלת החומרים.

4. ניתוח לוקליזציה תת-תאית של S והמוטציות שלו בתאים המייצרים SC2-VLP

  1. זרע ~3.0 × 106 תאי HEK-293T באופן שווה בצלחת התרבות עם תחתית הזכוכית בקוטר 15 מ"מ, ולאחר מכן אפשר לתאים להיצמד ולצמוח עד ~70% מפגש לפני הטרנספקציה.
  2. חזור על הליך הטרנספקציה כמתואר בשלבים 1.3 עד 1.7 ושנה רק את כמויות הפלסמיד באופן הבא: פלסמיד N: 1.3 מיקרוגרם, פלסמיד Luc-T20: 2 מיקרוגרם, פלסמיד S: 0.0032 מיקרוגרם, ופלסמיד M-IRES-E: 0.66 מיקרוגרם.
  3. שטפו בעדינות את צלחת התרבות פעמיים עם 1 מ"ל PBS קר כקרח, ולאחר מכן הוסיפו 1 מ"ל של תמיסת קיבוע 4% פרפורמלדהיד (PFA) בטמפרטורת החדר (RT) למשך 15 דקות.
  4. שטפו את התאים למשך 2 x 5 דקות עם 1 מ"ל PBS ב-RT, ולאחר מכן חלחלו לתאים על ידי הוספת 1 מ"ל של 0.25% טריטון X-100 ב-RT למשך 10 דקות.
  5. שטפו את התאים במשך 2 x 5 דקות עם 1 מ"ל PBS ב-RT, ולאחר מכן הוסיפו 1 מ"ל של אלבומין בסרום בקר 5% (BSA) ב-RT למשך שעה אחת כדי לחסום אינטראקציות נוגדנים לא ספציפיות.
  6. הוסיפו ~200 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית (מספיק כדי לכסות את תחתית הזכוכית) ודגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: תמיסות הנוגדנים העיקריות מוכנות על ידי דילול ב-5% BSA מומס ב-PBS ביחסי הדילול הבאים: נוגדן נגד S של עכבר ב-1:200, נוגדן נגד Sec61β של ארנב ב-1:200, נוגדן נגד GM130 של ארנב ב-1:200 ונוגדנים נגד ERGIC53 ארנב ב-1:200. תמיסת 5% BSA/PBS שימשה הן כמאגר מדלל והן כמאגר חוסם כדי למזער את הקישור הלא ספציפי במהלך הליכי צביעה אימונופלואורסצנטיים הבאים.
  7. הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית, ולאחר מכן שטוף את התאים למשך 3 x 5 דקות עם 1 מ"ל PBS ב-RT.
  8. הוסף תמיסת נוגדנים משנית מצומדת פלואורסצנטית ב-RT למשך שעה, ולאחר מכן שטוף את התאים למשך 3 x 5 דקות עם 1 מ"ל PBS ב-RT.
    הערה יש לבצע את כל השלבים הבאים בחושך או בחשיפה מינימלית לאור כדי למנוע הלבנה פוטו-הלבנה של מצומדים פלואורסצנטיים ולשמור על שלמות האות. שני סוגים של נוגדנים משניים מצומדים פלואורסצנטיים, שמקורם בעכבר או בארנב, משמשים לצביעה של חלבון S או חלבוני סמן אברון התא.
  9. צבעו גרעינים עם תמיסת Hoechst של 2.5 מיקרוגרם/מ"ל ב-RT למשך 5 דקות, ולאחר מכן שטפו את התאים למשך 3 x 5 דקות עם 1 מ"ל PBS ב-RT.
  10. התבונן בצביעה של חלבון S או אברונים ורכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם הפרמטרים הבאים: מצב PMT מוגדר ל-VBF (ללא ממוצע, סריקה רציפה של קו) עם צמצם אוטומטי-קונפוקלי. עבור ערוץ 1 (FITC), השתמש בלייזר 488 ננומטר בהספק של 25% עם פליטה של 500 - 548 ננומטר, HV 525 וולט, רווח פי 1 והיסט של 5%. עבור ערוץ 2 (Alexa Fluor 594), השתמש בלייזר 594 ננומטר בהספק של 25% עם פליטה של 610 - 670 ננומטר, HV 500 וולט, רווח פי 1 והיסט של 5%. עבור ערוץ 3 (DAPI), השתמש בלייזר 405 ננומטר בהספק של 25% עם פליטה של 430 - 470 ננומטר, HV 490 וולט, רווח פי 1 והיסט של 5%.

תוצאות

שלבי היציאה וההרכבה של מחזור החיים של SARS-CoV-2 נחקרו פחות משלבי ההדבקה והשכפול17,18. לפני פיתוח שיטת SC2-VLP, ניתן היה לחקור תהליכים אלה רק באמצעות SARS-CoV-2 חי, מה שהגביל את המחקר למעבדות BSL-313. זרימת העבודה SC2-VLP, המוצגת באיור 1, מתארת את פרוטוקול הניסוי וממחישה את התהליכים המעורבים בשלבים אלה של מחזור החיים של SARS-CoV-2. בגישה זו, פלסמידים המקודדים את החלבונים המבניים של SARS-CoV-2 (M, E, S ו-N) ואות אריזת ה-RNA (T20) מועברים במשותף לתאי HEK-293T. מדווח לוציפראז המותך לאות T20 מאפשר זיהוי רגיש של SC2-VLPs המשוחררים, אשר יכולים להדביק לאחר מכן תאים נמענים המבטאים את קולטני SARS-CoV-2 ACE2 ו-TMPRSS2, כפי שמתואר באיור 1.

כדי לייעל את כמות הפלסמיד המקודד חלבונים מבניים של SARS-CoV-2 ואת אות האריזה, במיוחד את הפלסמיד S, העברנו תאי HEK-293T עם ריכוזים משתנים של הפלסמיד S. התוצאות חשפו כי יחס פלסמיד S לפלסמיד אחר של 1:10 מספק את התנאים האופטימליים לייצור SC2-VLP (איור 2). ממצא זה מתיישב עם דו"ח קודם של Syed et al. ומסביר באופן סביר מדוע, למרות היותו אחד המרכיבים הנפוצים ביותר בנגיפי SARS-CoV-2, רמת הביטוי של חלבון S נמוכה יחסית לחלבוני M, N ו-E.

מערכת SC2-VLP משמשת כמודל רב עוצמה לחקר תהליך ההרכבה של SARS-CoV-2, ומסכמת נאמנה הן את היווצרות המעטפת הנגיפית והן את אריזת הגנום. הראיות הנוכחיות מדגישות את התפקיד המרכזי של חלבון M בהרכבה, ומאפשרות גיוס של חלבונים מבניים אחרים, כולל N, S ו-E. צביעה חיסונית של חלבונים אלה חושפת את מיקומם בתוך אברונים תת-תאיים, ככל הנראה קומפלקס ERGIC או cis-Golgi, האתרים העיקריים של הרכבת SARS-CoV-219,20. זה מדגיש את הפוטנציאל של מערכת SC2-VLP ככלי רב ערך לניתוח מנגנוני הרכבה ויראליים. כדי לחקור עוד יותר את תפקידו של S בהרכבה, הצגנו את מוטציית H1271E, המשבשת את מיון ה-S בתיווך COPI, ובכך פוגעת בשילוב S בנגיפים21,22. בתאים מקבלים, מוטציה זו הפחיתה משמעותית את פעילות הלוציפראז, ומאשרת שמערכת SC2-VLP לא רק מסכמת נאמנה זיהום נגיפי אלא גם משמשת ככלי רב עוצמה לחקירת הרכבת SARS-CoV-2 - תהליך שאינו נגיש למערכות פסאודוטיפ לנטי-ויראליות קונבנציונליות (איור 3). בנוסף, השתמשנו בגישת סריקה מוטציונית מקיפה, המכוונת לשאריות בודדות (1,255-1,273) בזנב הטרמינלי S C כדי לזהות מוטציות נוספות אשר, כמו H1271E, עשויות להחליש את הרכבת הוויריונים ולהפחית את הטיטר הנגיפי. איור 3 מדגים כי מוטציית E1262H מפחיתה משמעותית את ייצור SC2-VLP, בעוד שהמוטציה הכפולה H1271E/E1262H מבטלת אותו לחלוטין. תוצאות אלה מערבות את E1262 באינטראקציות פוטנציאליות עם גורמים מארחים לא מזוהים. אפיון נוסף של חלבוני מארח הנקשרים לאזור זה, במיוחד אלה התלויים ב-E1261, עשוי לחשוף מנגנונים חדשים השולטים בהרכבת SARS-CoV-2. ביחד, ממצאים אלה מבססים את SC2-VLPs כפלטפורמה רב-תכליתית ורלוונטית מבחינה פיזיולוגית לחקר הרכבה ויראלית במערכות תרבית תאים.

כדי להעריך את הלוקליזציה התת-תאית של חלבון S בתאים המייצרים SC2-VLP, ביצענו ניתוח צביעה חיסונית הן של חלבון S מסוג פרא והן של מוטנט H1271E שלו. התוצאות מדגימות כי חלבון S מתמקם בעיקר עם סמן cis-Golgi GM130, תוך הצגת חפיפה מינימלית עם סמן ER Sec61β או סמן ERGIC ERGIC-53. ממצאים אלה עולים בקנה אחד עם תצפיות קודמות של לוקליזציה תת-תאית של S בזיהום SARS-CoV-2 אותנטי23. לעומת זאת, המוטציה H1271E הציגה דפוס התפלגות מפוזר ולא הראתה קולוקליזציה עם סמן cis-Golgi GM130. זה מצביע על כך שהמוטציה משבשת את הלוקליזציה התקינה לאתר ההרכבה הנגיפית, מה שעשוי להסביר את יכולתה הלקויה להקל על הרכבת הוויריון של SARS-CoV-2 (איור 4). תוצאות אלו מבססות עוד יותר את SC2-VLPs ככלי רב ערך לחקר התפקודים הביולוגיים של S וחלבונים מבניים נגיפיים אחרים.

figure-results-3937
איור 1: ייצוג סכמטי של ייצור SC2-VLP ויישומיו. אות האריזה הגנומי של SARS-CoV-2, T20, מודגש בציאן, בעוד שחלבון S מוצג בירוק כהה. פלסמידים מקודדים חלבונים מבניים של SARS-CoV-2, כולל M, E, N ו-S, כאשר M ו-E מתבטאים במשותף מווקטור יחיד. השלבים העיקריים של מחזור החיים הנגיפי מומחשים, כולל הרכבה (ירוק בהיר), יציאה (כחול בהיר) וזיהום (כתום), כפי שמצוין על ידי חיצים. קיצורים: SARS-CoV-2 = תסמונת נשימתית חריפה חמורה-קורונה 2; SC2-VLP = חלקיק דמוי וירוס SARS-CoV-2. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4743
איור 2: הרגישות של טיטר SC2-VLP לכמות המועברת של הפלסמיד המקודד S. (A) טבלה המציגה את כמויות הטרנספקציה של פלסמידים המקודדים חלבונים מבניים של SARS-CoV-2 ואת אות אריזת ה-gRNA. (B) טיטר SC2-VLP משתנה בתגובה לכמות המועברת של הפלסמיד המקודד S. קיצורים: SARS-CoV-2 = תסמונת נשימתית חריפה חמורה-קורונה 2; SC2-VLP = חלקיק דמוי נגיף SARS-CoV-2; gRNA = RNA מדריך; RLU = יחידות זוהר יחסיות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5505
איור 3: מערכת SC2-VLP המשמשת לחקירת הרכבת S לתוך ויריונים. (A) מוטציות S המשפיעות על סחר ב-COPI מובילות להפחתה בטיטר SC2-VLP. (B) ניתוח כתמים מערביים של שפע חלבוני SARS-CoV-2 S ו-N ב-SC2-VLPs. (C) יעילות אריזה S מחושבת מ-(B), כאשר שפע SC2-VLP מנורמל לרמות חלבון N. (D) כימות שפע SC2-VLP מ-(B). קיצורים: SARS-CoV-2 = תסמונת נשימתית חריפה חמורה-קורונה 2; SC2-VLP = חלקיק דמוי נגיף SARS-CoV-2; RLU = יחידות זוהר יחסיות; Ctr = שליטה; WT = סוג פראי; mut = מוטציה; NS = לא משמעותי. הרצועה המתאימה לחלבון הספייק (S) של SARS-CoV-2 באורך מלא מסומנת כ-S, בעוד שקטע S2 (שאריות 816-1,273) מייצג את החלק הטרמינלי C של חלבון S, ופס לא ספציפי בין S ל-S2 מסומן כ-NS24. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6613
איור 4: מערכת SC2-VLP המשמשת לחקירת לוקליזציה תת-תאית S. (א-י) תמונת צביעה חיסונית מייצגת של WT S בתאי HEK-293T המייצרים SC2-VLP עם צביעה משותפת של סמני אברוני התא. (א-ג) סמן ER: (D-F) Sec61β, (G-I) ERGIC סמן: ERGIC-53; סמן קומפלקס cis-Golgi: GM130. (י-ל) הקו-לוקליזציה של מוטנט S E1262H עם סמן cis-Golgi GM130. S מוצג בירוק, סמני אברוני התא מוצגים באדום, וגרעין התא צבוע בכחול. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: רצפי DNA של פלסמיד N, Luc-T20, פלסמיד S ו-M-IRES-E. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

Discussion

שיטה פשוטה ויעילה למידול מחזור החיים של SARS-CoV-2 במערכות תרבית תאים, ללא האילוצים של מעבדות BSL-3, מייצגת התקדמות מרכזית למחקר נגד SARS-CoV-2. שיטת SC2-VLP עונה על צורך זה, ומציעה פלטפורמה חזקה ונגישה. במחקר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לשיטת SC2-VLP, המתאר שלבים ניסיוניים קריטיים לייצור SC2-VLPs. בנוסף, אנו מדגישים את הרבגוניות והיישומים הפוטנציאליים שלו בקידום ההבנה שלנו בביולוגיה של SARS-CoV-2 והקלה על פיתוח אסטרטגיות אנטי-ויראליות.

שיטות מסורתיות של SARS-CoV-2 VLP ופסאודוטיפ לנטי-ויראלי נמצאות בשימוש נרחב במחקר נגד SARS-CoV-2 8,25. בשיטת VLP המסורתית, חלבונים מבניים של SARS-CoV-2 M, N, E ו-S מתבטאים במשותף ליצירת חלקיקים נגיפיים26, כאשר שכיחותם מנוטרת בדרך כלל על ידי ניתוח WB. עם זאת, חלבונים מבניים נגיפיים משולבים גם במבני ממברנה אחרים, כגון אקסוזומים, מה שמסבך את ניתוח WB של חלקיקים נגיפיים27. לעומת זאת, שיטת SC2-VLP משלבת גן מדווח המותך לאות T20, ומאפשר אריזה יעילה של המדווח לחלקיקים נגיפיים. זה מאפשר זיהוי רגיש וספציפי של שפע החלקיקים מבלי להסתמך אך ורק על ניתוח WB. יתר על כן, שיטת SC2-VLP מחקה נאמנה יותר את מחזור החיים המלא של SARS-CoV-2 חי בהשוואה לשיטת ה-VLP המסורתית.

שיטת SC2-VLP עולה על גישת הפסאודוטיפ הלנטי-ויראלי במספר היבטים קריטיים. מערכת הפסאודוטיפ הלנטי-ויראלית מסתמכת על מסגרת נגיף ה-HIV-1, שבה מורכבים נגיפים וניצנים מקרום הפלזמה. לעומת זאת, נגיפים של SARS-CoV-2 מורכבים בתוך קומפלקס ERGIC או cis-Golgi, מה שמדגיש הבדל מהותי במחזורי החיים שלהם. פער זה הופך את שיטת הפסאודו-טיפוס הלנטי-ויראלית לבלתי מתאימה לחקר שלבי מפתח במחזור החיים של SARS-CoV-2, כגון שכפול, הרכבה ויציאה, מה שמגביל את תחולתה לחקירת כניסה וזיהום נגיפי.

שיטת SC2-VLP היא כלי פשוט ורב-עוצמה לחקר מחזור החיים של SARS-CoV-2. על ידי אי מעורבות הנגיף האותנטי, ניתן לאמץ שיטה זו על ידי מעבדות רבות מבלי לדרוש גישה למתקני BSL-3. עם זאת, נותר חיוני לאמת ממצאים הנגזרים ממערכת SC2-VLP באמצעות SARS-CoV-2 חי כדי להבטיח את דיוקם ואת הרלוונטיות הביולוגית שלהם.

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית קרן הסטארט-אפ באוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סינית (BUCM) (90011451310011). אנו מביעים את תודתנו לכל חברי מעבדת ד"ר מא ב-BUCM על הדיון והסיוע שלא יסולא בפז בניסויים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Bovine Serum Albumin (BSA)Cell Signaling Technology9998S
Confocal Laser Scanning MicroscopeOlympusFV3000
DMEMCorning10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermofisherA5670402
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) antibodyInvitrogenA11001dilution ratio: IF 1:1000
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 594) antibodyAbcamab150080dilution ratio: IF 1:1000
HEK-293T cell lineNational Infrastructure of Cell Line Resource (NICR)NICR-293T-001To ensure high transfection efficiency and optimal SC2-VLP production, HEK-293T cells should be maintained at low passage numbers (≤ P10).
Hoechst 33342InvitrogenH1399Working concentration: 2.5 μg/mL
Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1500
Luc-T20Addgene177941
Mouse monoclonal anti-GAPDHProteintech60004-1-Igdilution ratio: WB 1:20,000
Mouse monoclonal anti-S RBDAbclonalA23771dilution ratio: IF 1:200
OptiMEMThermofisher31985070serum-free medium for transfection
PEG3350Sigma-AldrichP3635
PEG8000Sigma-AldrichP2139
Penicillin-StreptomycinThermofisher15140122
Polyethyleneimine (PEI)Thermofisher43896.01
Promega passive lysis bufferPromegaE1941
Rabbit polyclonal anti-ACE2Proteintech21115-1-APdilution ratio: WB 1:1000
Rabbit polyclonal anti-ERGIC53Proteintech13364-1-APdilution ratio: IF 1:200
Rabbit polyclonal anti-GM130Proteintech11308-1-APdilution ratio: IF 1:200
Rabbit polyclonal anti-SAbcamab272504dilution ratio: WB 1:1000
Rabbit polyclonal anti-Sec61βProteintech15087-1-APdilution ratio: IF 1:200
Rabbit polyclonal anti-TMPRSS2Abcamab109131dilution ratio: WB 1:1000
SARS-CoV-2 M-IRES-E plasmidAddgene177938
SARS-CoV-2 N plasmidAddgene177959
SARS-CoV-2 Nucleoprotein Rabbit mAbAbclonalA21042dilution ratio: WB 1:4000
SARS-CoV-2 S plasmidAddgene177960
Secondary Antibody, HRP, Goat anti-Mouse IgG (H+L)Invitrogen31460dilution ratio: WB 1:5000
Secondary Antibody, HRP, Goat anti-Rabbit IgG (H+L)Invitrogen31430dilution ratio: WB 1:5000
SpectraMax i3x plate reader Molecular DevicesSpectraMax i3x

References

  1. Narayanan, S. A., et al. A comprehensive SARS-CoV-2 and COVID-19 review, Part 2: host extracellular to systemic effects of SARS-CoV-2 infection. Eur J Hum Genet. 32 (1), 10-20 (2024).
  2. Shang, J., et al. Structural basis of receptor recognition by SARS-CoV-2. Nature. 581 (7807), 221-224 (2020).
  3. Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
  4. Zhang, Z., et al. Structure of SARS-CoV-2 membrane protein essential for virus assembly. Nat Commun. 13 (1), 4399(2022).
  5. Han, Y., et al. SARS-CoV-2 N protein coordinates viral particle assembly through multiple domains. J Virol. 98 (11), e0103624(2024).
  6. Ghosh, S., et al. beta-coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway. Cell. 183 (6), 1520-1535.e14 (2020).
  7. Andrews, H. S., Herman, J. D., Gandhi, R. T. Treatments for COVID-19. Annu Rev Med. 75, 145-157 (2024).
  8. Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513(2020).
  9. Sultana, R., Stahelin, R. V. Strengths and limitations of SARS-CoV-2 virus-like particle systems. Virology. 601, 110285(2025).
  10. Xu, R., Shi, M., Li, J., Song, P., Li, N. Construction of SARS-CoV-2 virus-like particles by mammalian expression system. Front Bioeng Biotechnol. 8, 862(2020).
  11. Plescia, C. B., et al. SARS-CoV-2 viral budding and entry can be modeled using BSL-2 level virus-like particles. J Biol Chem. 296, 100103(2021).
  12. Cruz-Cardenas, J. A., et al. A pseudovirus-based platform to measure neutralizing antibodies in Mexico using SARS-CoV-2 as proof-of-concept. Sci Rep. 12 (1), 17966(2022).
  13. Syed, A. M., et al. Rapid assessment of SARS-CoV-2-evolved variants using virus-like particles. Science. 374 (6575), 1626-1632 (2021).
  14. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  15. Matsuyama, S., et al. Enhanced isolation of SARS-CoV-2 by TMPRSS2-expressing cells. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (13), 7001-7003 (2020).
  16. Alegria-Schaffer, A., Lodge, A., Vattem, K. Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection. Methods Enzymol. 463, 573-599 (2009).
  17. V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 155-170 (2021).
  18. Yang, H., Rao, Z. Structural biology of SARS-CoV-2 and implications for therapeutic development. Nat Rev Microbiol. 19 (11), 685-700 (2021).
  19. Katiyar, H., Arduini, A., Li, Y., Liang, C. SARS-CoV-2 assembly: Gaining infectivity and beyond. Viruses. 16 (11), 1648(2024).
  20. Klein, S., et al. SARS-CoV-2 structure and replication characterized by in situ cryo-electron tomography. Nat Commun. 11 (1), 5885(2020).
  21. Li, Y., et al. SARS-CoV-2 spike host cell surface exposure promoted by a COPI sorting inhibitor. Acta Pharm Sin B. 13 (7), 3043-3053 (2023).
  22. Dey, D., et al. A single C-terminal residue controls SARS-CoV-2 spike trafficking and incorporation into VLPs. Nat Commun. 14 (1), 8358(2023).
  23. Christie, S. M., et al. Single-virus tracking reveals variant SARS-CoV-2 spike proteins induce ACE2-independent membrane interactions. Sci Adv. 8 (49), eabo3977(2022).
  24. Guo, L., et al. Targetable elements in SARS-CoV-2 S2 subunit for the design of pan-coronavirus fusion inhibitors and vaccines. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 197(2023).
  25. Mi, D., Hu, J., Qian, Z. A lentiviral pseudotype system to characterize SARS-CoV-2 glycoprotein. Methods Mol Biol. 2610, 187-199 (2023).
  26. Swann, H., et al. Minimal system for assembly of SARS-CoV-2 virus like particles. Sci Rep. 10 (1), 21877(2020).
  27. Xia, B., et al. Extracellular vesicles mediate antibody-resistant transmission of SARS-CoV-2. Cell Discov. 9 (1), 2(2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

220SARS CoV 2COVID 19

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved