生产 SARS-CoV-2 病毒样颗粒系统以研究体外病毒生命周期

我们提出了一种优化的 体外 方案，用于生产与真实病毒非常相似的 SARS-CoV-2 病毒样颗粒。这种方法能够研究病毒感染、组装和出口机制，而不受生物安全 3 级实验室的限制。

严重急性呼吸系统综合症-冠状病毒 2 （SARS-CoV-2） 病毒样颗粒 （SC2-VLP） 方法为研究 SARS-CoV-2 生命周期提供了一种强大且易于使用的工具，而无需生物安全 3 级 （BSL-3） 实验室。该系统使用与 T20 信号融合的荧光素酶报告基因，对病毒颗粒的产生进行灵敏和精确的检测，从而有效地模拟病毒生命周期的关键阶段，包括组装、基因组包装和出口。SC2-VLP 是通过共表达 SARS-CoV-2 结构蛋白产生的，包括膜 （M）、核衣壳 （N）、包膜 （E） 和刺突蛋白 （S），以及 HEK-293T 细胞中的 RNA 包装信号。与传统的病毒样颗粒系统不同，SC2-VLP 方法可确保准确定量并提高对自然病毒生命周期的保真度。此外，与仅限于通过将 S 蛋白掺入基于 HIV 的慢病毒颗粒来研究病毒进入的慢病毒假分型方法相比，SC2-VLP 系统为探索 SARS-CoV-2 生物学的多个阶段提供了更全面的平台。虽然这种方法绕过了处理活病毒的风险并扩展了可访问性。SC2-VLP 方法代表了抗病毒研究和 SARS-CoV-2 治疗策略开发的重大进步。

COVID-19 大流行已成为现代历史上最具破坏性的全球健康危机之一，导致全球数百万人死亡¹。导致 SARS-CoV-2 的病毒遵循复杂的生命周期，包括感染、基因组复制、组装和出口等关键阶段。当病毒刺突蛋白 （S） 与宿主细胞受体血管紧张素转换酶 2 （ACE2） 结合时，感染过程开始，促进病毒基因组释放到宿主细胞中 ^2,3。然后，病毒 RNA 依赖性 RNA 聚合酶 （RdRp） 催化基因组 RNA 的复制。该 RNA 与核衣壳蛋白 （N） 复合，形成可被膜蛋白 （M） 识别的稳定结构。M 蛋白通过募集 RNA-N 复合物、S 和包膜蛋白 （E） 在病毒组装中发挥核心作用^4,5。组装后，病毒粒子通过非经典溶酶体介导的运输途径完成其出口⁶。

为应对大流行，已动员大量全球资源来开发疫苗、中和抗体和抗病毒药物。对这些干预措施的评估对于推进 SARS-CoV-2 研究至关重要⁷。然而，研究活病毒存在重大的后勤挑战，因为涉及病毒的实验必须在生物安全 3 级 （BSL-3） 实验室中进行。BSL-3 设施的有限可用性限制了旨在了解和对抗 SARS-CoV-2 的研究步伐。

为了应对这些挑战，SARS-CoV-2 研究中已广泛采用两个主要系统——病毒样颗粒 （VLP） 和慢病毒假型，这两种系统都不需要 BSL-3 遏制⁸。VLP 系统涉及细胞与编码病毒结构蛋白（包括 M、S、E 和 N）的基因的共转染，它们共同产生病毒样颗粒。这些颗粒模拟病毒的结构和功能特性，使其成为研究 SARS-CoV-2 生命周期中关键过程的宝贵工具，甚至是疫苗开发的有效抗原 ^9,10,11。

相反，慢病毒假型系统涉及用 SARS-CoV-2 S 蛋白替换慢病毒中的水泡性口炎病毒 （VSV） G 蛋白，从而能够产生可以掺入荧光素酶或 GFP 等报告基因的慢病毒颗粒。该系统对于研究阻断 S-ACE2 相互作用的中和抗体特别有用¹²。然而，由于使用了 HIV 结构蛋白，慢病毒假型并不能反映 SARS-CoV-2 病毒的组装或排出，而 HIV 结构蛋白介导颗粒在质膜上的释放。

为了克服这些限制，Syed 等人最近在其 RNA 基因组中发现了 SARS-CoV-2 包装信号，这表明 N 蛋白对病毒基因组识别具有特异性¹³。通过将这种包装信号融合到报告基因，可以有效地将这些基因整合到 SARS-CoV-2 病毒样颗粒 （SC2-VLP） ^中13。该策略不仅复制了 SARS-CoV-2 的组装和出口过程，还允许对感染步骤进行灵敏的测量。在本研究中，我们介绍了使用 SC2-VLP 系统的实验方法，并强调了进行这种方法的关键考虑因素。

1. SC2-VLP 的生成

1. 在直径为 10 cm 的组织培养板中接种 ~3.0^{× 6} 个 HEK-293T 细胞，其中含有补充有 10% v/v FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 完全培养基。
   注：为确保高转染效率和最佳 SC2-VLP 生产，HEK-293T 细胞应保持在低传代数 ~10。
2. 将 HEK-293T 细胞在 37 °C、5% CO₂ 下培养约 24 小时，并在显微镜下检查细胞汇合度。如果汇合度达到 ~70%，则继续。
3. 用无血清培养基将 60 μL PEI 从 1 mg/mL 原液稀释至 200 μL。
4. 将 6.7 μg N 质粒、10 μg Luc-T20 质粒、0.016 μg S 质粒和 3.3 μg M-IRES-E 质粒添加到 200 μL 无血清培养基中（参见 补充文件 1）。
5. 将步骤 1.3 中稀释的 PEI 轻轻加入到含有步骤 1.4 中编码病毒结构蛋白的质粒的溶液中，并在室温下孵育 10 分钟。这是转染解决方案。
6. 小心地将步骤 1.5 中的转染溶液滴到 HEK-293T 细胞上，然后轻轻旋转组织培养板以充分混合。
7. 感染后 6 小时用 DMEM 完全培养基交换细胞培养基，并将转染的 HEK-293T 细胞在 37 °C、5% CO₂ 下孵育 48 小时。
8. 收集含有 SC2-VLP 的感染 HEK-293T 细胞的上清液，然后通过 0.45 μm 注射器过滤器过滤上清液以去除细胞碎片。这是 SC2-VLP 培养基。
   注意：我们尝试在 HeLa、Vero E6 和 Caco2 细胞系中产生 SC2-VLP，但没有获得可测量的病毒滴度，表明该方案对 HEK-293T 细胞具有特异性。

2. SC2-VLP 有效性检查

注：稳定表达 ACE2 和 TMPRSS2 的 HEK-293T 细胞系是使用慢病毒转导方法建立的^14,15。ACE2 和 TMPRSS2 的蛋白质表达通过蛋白质印迹分析确认，遵循类似于步骤 3 中描述的方案（SC2-VLP 成分分析）。

1. 在 96 孔板中接种 4.0 ×^{10 个 4 个} ACE2 和 TMPRSS2 稳定表达的 HEK-293T 细胞，并加入 50 μL 来自步骤 1.8 的 SC2-VLP 培养基。
2. 将 96 孔组织培养板在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 24 小时。
3. 从 96 孔板中取出培养基，在 37 °C 下用 100 μL PBS 缓冲液洗涤一次，其中含有 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄ 和 1.8 mM KH₂PO₄。
4. 用 20 μL 被动裂解缓冲液裂解 HEK-293T ACE2/TMPRSS2 细胞，在室温下在轨道摇床上轻轻摇动样品 15 分钟。
   注：裂解缓冲液含有 25 mM 三磷酸盐 （pH 7.8）、2 mM DTT、2 mM 1,2-二氨基环己烷-N，N，N′，N′-四乙酸、1.25 mg/mL 溶菌酶、2.5 mg/mL BSA、10% 甘油和 1% Triton X-100）。
5. 在冷冻微孔板离心机中以 4,000 × g 在 4 °C 下旋转 96 孔板 15 分钟，然后立即将板转移到冰浴中。
6. 将 100 μL 重构的荧光素酶检测缓冲液添加到不透明的白色 96 孔板中，并加入步骤 2.5 中的 20 μL 裂解物。通过上下吹打 2-3 次来短暂混合它们。
7. 使用读板器测量发光，参数如下： 检测模式：发光;波长范围：全光谱;板规格：96 孔标准不透明板;积分时间：200 毫秒。

3. 检查 SC2-VLP 成分

1. 从步骤 1.8 开始，将 1.36 mL 含有 50% PEG 8000 和 2.2% NaCl 的 PEG 8000 溶液添加到 10 mL 的 SC 2-VLP 培养基中。
2. 将混合物保存在轨道振荡器上，并在 4 °C 下缓慢混合溶液过夜。
3. 将溶液在 4 °C、2,000 × g 下离心 30 分钟，并收集 SC2-VLP 沉淀用于蛋白质印迹分析¹⁶。
   注：对于蛋白质印迹分析，材料 表中提供了有关抗体的所有信息。

4. S 及其突变体在 SC2-VLP 产生细胞中的亚细胞定位分析

1. 将 ~3.0 ×^{10 6} 个 HEK-293T 细胞均匀接种在直径为 15 mm 的玻璃底培养皿中，然后让细胞粘附并生长直至 ~70% 汇合，然后再转染。
2. 按照步骤 1.3 到 1.7 中的说明重复转染程序，仅修改质粒数量，如下所示：N 质粒：1.3 μg，Luc-T20 质粒：2 μg，S 质粒：0.0032 μg，和 M-IRES-E 质粒：0.66 μg。
3. 用 1 mL 冰冷的 PBS 轻轻洗涤培养皿两次，然后在室温 （RT） 下加入 1 mL 4% 多聚甲醛 （PFA） 固定液 15 分钟。
4. 在 RT 下用 1 mL PBS 洗涤细胞 2 x 5 分钟，然后在 RT 下加入 1 mL 0.25% Triton X-100 透化细胞 10 分钟。
5. 在 RT 下用 1 mL PBS 洗涤细胞 2 x 5 分钟，然后在 RT 下加入 1 mL 5% 牛血清白蛋白 （BSA） 1 小时以阻断非特异性抗体相互作用。
6. 加入 ~200 μL 一抗溶液（足以覆盖玻璃底部），并在 4 °C 下孵育过夜。
   注：一抗溶液是通过用溶解在 PBS 中的 5% BSA 按以下稀释比例稀释来制备的：小鼠抗 S 抗体为 1：200，兔抗 Sec61β 抗体为 1：200，兔抗 GM130 抗体为 1：200，兔抗 ERGIC53 抗体为 1：200。5% BSA/PBS 溶液用作稀释剂和封闭缓冲液，以最大限度地减少后续免疫荧光染色过程中的非特异性结合。
7. 去除一抗溶液，然后在 RT 下用 1 mL PBS 洗涤细胞 3 x 5 分钟。
8. 在 RT 下加入荧光偶联的二抗溶液 1 小时，然后在 RT 下用 1 mL PBS 洗涤细胞 3 x 5 分钟。
   注：所有后续步骤必须在黑暗或最小光照下进行，以防止荧光偶联物发生光漂白并保持信号完整性。两种来源于小鼠或兔的荧光偶联二抗用于对 S 蛋白或细胞器标志物蛋白进行染色。
9. 在 RT 下用 2.5 μg/mL Hoechst 溶液对细胞核染色 5 分钟，然后在 RT 下用 1 mL PBS 洗涤细胞 3 x 5 分钟。
10. 观察 S 蛋白或细胞器染色并使用具有以下参数的共聚焦显微镜获取图像：PMT 模式设置为具有自动共聚焦孔径的 VBF（无平均，线顺序扫描）。对于通道 1 （FITC），使用 488 nm 激光器，功率为 25%， 发射波长为 500 - 548 nm，HV 为 525 V，增益为 1 倍，偏移为 5%。对于通道 2 （Alexa Fluor 594），使用 594 nm 激光器，功率为 25%，发射波长为 610 - 670 nm，HV 为 500 V，增益为 1 倍，偏移为 5%。对于通道 3 （DAPI），使用 405 nm 激光器，功率为 25%，发射波长为 430 - 470 nm，HV 为 490 V，增益为 1 倍，偏移为 5%。

SARS-CoV-2 生命周期的出口和组装步骤的研究少于感染和复制步骤^17,18。在 SC2-VLP 方法开发之前，这些过程只能使用活体 SARS-CoV-2 进行研究，研究仅限于 BSL-3 实验室¹³。SC2-VLP 工作流程（如图 1 所示）概述了实验方案，并说明了 SARS-CoV-2 生命周期的这些步骤所涉及的过程。在这种方法中，编码 SARS-CoV-2 结构蛋白（M、E、S 和 N）和 RNA 包装信号 （T20） 的质粒被共转染到 HEK-293T 细胞中。与 T20 信号融合的荧光素酶报告基因能够灵敏地检测释放的 SC2-VLP，然后可以感染表达 SARS-CoV-2 受体 ACE2 和 TMPRSS2 的受体细胞，如图 1 所示。

为了优化编码 SARS-CoV-2 结构蛋白的质粒量和包装信号，尤其是 S 质粒，我们用不同浓度的 S 质粒转染了 HEK-293T 细胞。结果表明，1：10 的 S 质粒与其他质粒的比例为 SC2-VLP 生产提供了最佳条件（图 2）。这一发现与 Syed 等人之前的报告一致，并合理地解释了为什么尽管 S 蛋白是 SARS-CoV-2 病毒粒子中最丰富的成分之一，但与 M、N 和 E 蛋白相比，S 蛋白的表达水平相对较低。

SC2-VLP 系统是研究 SARS-CoV-2 组装过程的强大模型，忠实地概括了病毒包膜形成和基因组包装。目前的证据强调了 M 蛋白在组装中的核心作用，促进了其他结构蛋白（包括 N、S 和 E）的募集。这些蛋白质的免疫染色揭示了它们在亚细胞器中的定位，可能是 ERGIC 或顺式高尔基复合体，这是 SARS-CoV-2 组装的主要位点^19,20.这强调了 SC2-VLP 系统作为剖析病毒组装机制的宝贵工具的潜力。为了进一步探索 S 在组装中的作用，我们引入了 H1271E 突变，它破坏了 COPI 介导的 S 分选，从而损害了 S 掺入病毒粒子^21,22。在受体细胞中，这种突变显著降低了荧光素酶活性，证实了 SC2-VLP 系统不仅忠实地概括了病毒感染，而且还是研究 SARS-CoV-2 组装的有力工具，SARS-CoV-2 组装是传统慢病毒假型系统无法接近的过程（图 3）。我们进一步采用了一种全面的突变扫描方法，靶向 S C 末端尾部的单个残基 （1,255-1,273），以识别其他突变，如 H1271E，可能会减弱病毒粒子组装并降低病毒滴度。图 3 表明 E1262H 突变显着减少了 SC2-VLP 的产生，而 H1271E/E1262H 双突变体完全消除了它。这些结果表明 E1262 与未识别的宿主因子的潜在相互作用有关。进一步表征与该区域结合的宿主蛋白，特别是那些依赖于 E1261 的宿主蛋白，可能会揭示控制 SARS-CoV-2 组装的新机制。总的来说，这些发现将 SC2-VLPs 确立为研究细胞培养系统中病毒组装的多功能且生理相关平台。

为了评估 S 蛋白在产生 SC2-VLP 的细胞中的亚细胞定位，我们对野生型 S 蛋白及其 H1271E 突变体进行了免疫染色分析。结果表明，S 蛋白主要与 顺式高尔基体标志物 GM130 共定位，同时与 ER 标志物 Sec61β 或 ERGIC 标志物 ERGIC-53 的重叠最小。这些发现与之前对真实 SARS-CoV-2 感染中 S 亚细胞定位的观察结果一致²³。相比之下，H1271E 突变体表现出弥漫分布模式，并且与 顺式高尔基体标记 GM130 没有共定位。这表明该突变破坏了病毒组装位点的正确定位，可能解释了其促进 SARS-CoV-2 病毒粒子组装的能力受损的原因（图 4）。这些结果进一步确立了 SC2-VLPs 是研究 S 和其他病毒结构蛋白生物学功能的宝贵工具。

图 1：SC2-VLP 生产及其应用的示意图。 SARS-CoV-2 基因组 RNA 包装信号 T20 以青色突出显示，而 S 蛋白以深绿色显示。质粒编码 SARS-CoV-2 的结构蛋白，包括 M、E、N 和 S，其中 M 和 E 从单个载体共表达。图中说明了病毒生命周期的关键阶段，包括组装（浅绿色）、出口（浅蓝色）和感染（橙色），如箭头所示。缩写：SARS-CoV-2 = 严重急性呼吸系统综合症-冠状病毒 2;SC2-VLP = SARS-CoV-2 病毒样颗粒。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：SC2-VLP 滴度对编码 S 的质粒转染量的敏感性。 （A） 表格显示了编码 SARS-CoV-2 结构蛋白的质粒的转染量和 gRNA 包装信号。（B） SC2-VLP 滴度随编码 S 的质粒的转染量而变化。缩写：SARS-CoV-2 = 严重急性呼吸系统综合症-冠状病毒 2;SC2-VLP = SARS-CoV-2 病毒样颗粒;gRNA= 向导 RNA;RLU = 相对发光单位。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：用于研究 S 组装成病毒粒子的 SC2-VLP 系统。 （A） 影响 COPI 运输的 S 突变体导致 SC2-VLP 滴度降低。（B） SC2-VLP 中 SARS-CoV-2 S 和 N 蛋白丰度的蛋白质印迹分析。（C） 根据 （B） 计算 S 包装效率，SC2-VLP 丰度归一化为 N 蛋白水平。（D） （B） 中 SC2-VLP 丰度的定量。缩写：SARS-CoV-2 = 严重急性呼吸系统综合症-冠状病毒 2;SC2-VLP = SARS-CoV-2 病毒样颗粒;RLU = 相对发光单位;Ctr = 控制;WT = 野生型;mut = 突变体;NS = 不显著。对应于全长 SARS-CoV-2 刺突 （S） 蛋白的条带标记为 S，而 S2 片段（残基 816-1,273）代表 S 蛋白的 C 端部分，S 和 S2 之间的非特异性条带表示为 NS²⁴。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：用于研究 S 亚细胞定位的 SC2-VLP 系统。 （A-I）WT S 在产生 SC2-VLP 的 HEK-293T 细胞中与细胞器标志物共染色的代表性免疫染色图像。（A-C）ER 标志物：（DF） Sec61β，（GI） ERGIC 标志物：ERGIC-53; 顺式-高尔基复合体标记物：GM130。（J-L）S E1262H 突变体与 顺式高尔基体标记 GM130 的共定位。S 显示为绿色，细胞器标志物显示为红色，细胞核显示为蓝色。 请单击此处查看此图的较大版本。

补充文件 1：N、Luc-T20 质粒、S 质粒和 M-IRES-E 质粒的 DNA 序列。请点击此处下载此文件。

一种简单有效的方法来模拟细胞培养系统中的 SARS-CoV-2 生命周期，而不受 BSL-3 实验室的限制，代表了抗 SARS-CoV-2 研究的关键进步。SC2-VLP 方法满足了这一需求，提供了一个稳定且可访问的平台。在这项研究中，我们提供了 SC2-VLP 方法的详细方案，概述了生产 SC2-VLP 的关键实验步骤。此外，我们强调了其多功能性和潜在应用，以促进我们对 SARS-CoV-2 生物学的理解和促进抗病毒策略的开发。

传统的 SARS-CoV-2 VLP 和慢病毒假型分型方法广泛用于抗 SARS-CoV-2 研究 ^8,25。在传统的 VLP 方法中，SARS-CoV-2 结构蛋白 M、N、E 和 S 共表达以产生病毒颗粒²⁶，其丰度通常通过 WB 分析进行监测。然而，病毒结构蛋白也被掺入其他膜结构中，例如外泌体，使病毒颗粒的 WB 分析复杂化²⁷。相比之下，SC2-VLP 方法结合了与 T20 信号融合的报告基因，能够将报告基因有效地包装成病毒颗粒。这允许对颗粒丰度进行灵敏和特异性的检测，而无需仅依赖 WB 分析。此外，与传统的 VLP 方法相比，SC2-VLP 方法更忠实地模拟了活 SARS-CoV-2 的整个生命周期。

SC2-VLP 方法在几个关键方面优于慢病毒假型方法。慢病毒假型系统依赖于 HIV-1 病毒框架，其中病毒粒子从质膜组装并出芽。相比之下，SARS-CoV-2 病毒粒子组装在 ERGIC 或 顺式高尔基复合体中，突出了它们生命周期的根本差异。这种差异使得慢病毒假型方法不适合研究 SARS-CoV-2 生命周期的关键阶段，例如复制、组装和出口，从而限制了其对病毒进入和感染研究的适用性。

SC2-VLP 方法是研究 SARS-CoV-2 生命周期的一种简单而强大的工具。由于不涉及真正的病毒，许多实验室可以采用这种方法，而无需访问 BSL-3 设施。然而，使用活体 SARS-CoV-2 验证 SC2-VLP 系统得出的结果以确保其准确性和生物学相关性仍然至关重要。

作者没有需要披露的利益冲突。

这项工作得到了北京中医药大学 （BUCM） （90011451310011） 创业基金计划的支持。我们感谢 BUCM 马 博士实验室的所有成员，感谢他们对实验的宝贵讨论和帮助。