マレイミドチオールケミストリーおよびソーターゼA媒介ライゲーションによる部位特異的細胞傷害性タンパク質コンジュゲートの調製

ここでは、マレイミド-チオール反応およびソーターゼA媒介ライゲーションを使用して、細胞毒性薬物によるタンパク質の部位特異的標識に関する詳細なプロトコールを提供します。

がんは現在、世界で2番目に多い死因です。がん細胞の特徴は、その表面に成長因子受容体などの特定のマーカータンパク質が存在することです。この特徴により、特定のリンカーによって細胞毒性の高い薬物に結合した標的タンパク質(抗体または受容体リガンド)で構成される、高選択的治療薬であるタンパク質バイオコンジュゲートの開発が可能になります。標的タンパク質の親和性と選択性が非常に高いため、バイオコンジュゲートはがん細胞表面のマーカータンパク質を認識し、受容体媒介性エンドサイトーシスを利用して細胞内に到達します。細胞内小胞輸送システムは、最終的にバイオコンジュゲートをリソソームに送達し、そこでタンパク質分解により、バイオコンジュゲートのタンパク質性コアから遊離細胞傷害性薬物が分離され、薬物依存性のがん細胞死を引き起こします。現在、がん治療薬として承認されたタンパク質バイオコンジュゲートはいくつかあり、その多くが開発中または臨床試験中です。

バイオコンジュゲートの生成における主な課題の1つは、標的タンパク質への細胞毒性薬物の部位特異的な結合です。近年、細胞毒性薬によるタンパク質修飾のための化学的および酵素的戦略の開発において、大きな進歩がもたらされています。ここでは、マレイミド-チオール化学を用いた化学的方法と、ソーターゼAを介したライゲーションに依存する酵素的アプローチを用いて、細胞傷害性弾頭を標的タンパク質に部位特異的に組み込むための詳細なプロトコールを紹介します。我々は、例示的な標的タンパク質として、線維芽細胞増殖因子2およびヒト免疫グロブリンGの断片結晶化可能領域の改変変異体を使用し、モデル細胞毒性薬としてモノメチルオーリスタチンEおよびメトトレキサートを使用する。記載されているすべての戦略により、多様ながんの選択的治療の可能性を秘めた、定義された分子構造の生物学的に活性な細胞傷害性コンジュゲートを非常に効率的に生成できます。

何十年にもわたる科学的努力により、がんの発生と進行を支配する分子メカニズムに関する知識は大幅に進歩しました。同時に、選択性の欠如による薬物の副作用、腫瘍の大きなばらつき、および長期治療後に発生する薬剤耐性により、治療の可能性はまだ大きく制限されています。近年、標的抗がん治療薬は、多様な腫瘍に対する新規かつ有望なアプローチとして注目されています。標的療法は、細胞傷害性ペイロードをがん細胞に正確に送達し、健康な細胞を救う高度な薬物送達システムに依存しています。これらには、主に多様なナノ粒子、リポソーム、およびタンパク質ベースの薬物担体が含まれます。

がん細胞は、多くの場合、その表面に特定のマーカータンパク質のレベルが上昇しています。抗体薬物複合体(ADC)は、モノクローナル抗体の極めて高い特異性と薬物の高い細胞毒性を1分子に組み合わせた、タンパク質ベースの新規抗がん治療薬です。がん細胞表面に結合すると、ADCは受容体媒介性エンドサイトーシスを利用して細胞に侵入します。その後、ADCはエンドソームコンパートメントを介してリソソームに輸送され、そこでプロテアーゼがADCを分解し、活性な細胞毒性薬物を放出します。現在、米国では、トリプルネガティブ乳がん、HER2陽性乳がん、尿路上皮がん、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、血液悪性腫瘍、ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病など、さまざまな腫瘍の治療薬として8つのADCが承認されています。また、多数のADCが開発中または承認待ちです¹。注目すべきは、タンパク質工学的アプローチが、モノクローナル抗体に代わる多様なタンパク質スキャフォールドとその細胞傷害性コンジュゲートの開発につながったことです。これらには、異なる抗体フラグメント^2,3、DARPins4,5、knottins6,7、centyrins8、affibodies9,10、または改変された受容体リガンド^11,12が含まれる。

タンパク質ベースの細胞傷害性コンジュゲートを成功させるには、コンジュゲートの安定性、並外れた特異性、がん特異的マーカーに対するコンジュゲートの高い親和性、がん細胞内部へのコンジュゲートの急速な内在化、リソソームへの効率的な輸送、および活性ペイロードの効果的な細胞内放出など、いくつかの重要な要件があります。もう一つの重要な特徴は、コンジュゲートの均質性であり、これは標的タンパク質へのペイロードの付着に適用される戦略に大きく依存します。タンパク質と細胞毒性薬物との部位特異的結合には、タンパク質の側鎖システインまたはリジン残基の修飾、標的タンパク質に組み込まれた非天然アミノ酸への薬物の結合、標的タンパク質の酵素修飾(トランスグルタミナーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホルミルグリシン生成酵素、ソルターゼAなど)など、いくつかの方法があります。ほとんどの場合、部位特異的標識法では、標的分子の修飾(システインエンジニアリングや短いペプチドタグの導入など)が必要ですが、その結果、目的の均質なコンジュゲートが効率的に生成されます。

ここでは、標的タンパク質と細胞毒性薬物の高効率な部位特異的結合のためのプロトコールを提供します。例示的なタンパク質として、我々は2つの異なる分子、すなわちヒトIgGのフラグメント結晶化可能(Fc)とヒト線維芽細胞成長因子2(FGF2)の改変体を用いた。Fcフラグメントは、一般的なADCの不可欠な部分を構成しますが、細胞傷害性ペプチド体や抗体フラグメントのコンジュゲートなど、他のタイプのコンジュゲートにも存在します。FGF2は、天然の線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)リガンドであり、FGFRを過剰に産生するがん細胞を標的とする選択的な細胞傷害性コンジュゲートを生成することに成功しました。

私たちは、細胞毒性薬物の部位特異的な組み込みを可能にする2つの異なる結合戦略を提示します。まず、Hermansonのプロトコル¹³に基づくマレイミド-チオールケミストリーを介してFcフラグメントのシステイン側鎖に結合するためのプロトコルが提供されます(図1A、B)。このプロトコルでは、2つのジスルフィド結合が最初にトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)で還元され、得られた遊離チオール基をマレイミド-チオール化学を介してモノメチルアウリスタチンE(MMAE)との結合にかけます(図1B)。定常重鎖ドメイン2と3(CH2とCH3)の間の相互作用により、薬物結合Fcの二量体構造は保存されます。次に、システインエンジニアリングとソーターゼAを介したライゲーションを組み合わせて、2つの異なる薬物を部位特異的にFGF2に組み込むという、二重弾頭FGF2コンジュゲートの生成戦略が提示されます(図1A、C)。単一の露出したシステイン残基およびC末端LPETGG短いペプチドタグを有する追加のN末端KCKSGGを有するFGF2のシステインフリー変異体が使用される¹²。マレイミド-チオール反応により、私たちのグループが設計したKCKSSGリンカー内でMMAEとシステインを結合させることができます^14,15。Sortase A依存性ステップ(Chen et al.に基づく)^図16は、メトトレキサート(MTX)結合テトラグリシンペプチドGGGG-MTXのC末端LPETGG配列へのライゲーションを媒介し、2種類の単一弾頭複合体を生じる(図1C)。Sortase Aは、LPETGGモチーフとGGGGモチーフ間のトランスペプチド化反応を触媒するシステインプロテアーゼです。酵素はタンパク質のC末端でLPETGGモチーフに結合し、次にスレオニンとグリシンとの間のアミド結合が加水分解されて酵素-基質複合体を形成します。次のステップは、チオエステル酵素-基質結合のアミノ分解であり、ここで、第一級アミノ基の供与体はテトラグリシンモチーフ¹⁷のグリシン残基である。これら2つのアプローチを組み合わせると、部位特異的なFGF2二重弾頭コンジュゲートが生成されます(図1C)。原則として、標識プロトコルは、選択的な細胞傷害性コンジュゲートを生成するために、目的の任意の操作された標的タンパク質にうまく適用できます。さらに、このアプローチの汎用性は、他の多くのタンパク質-タンパク質およびタンパク質-ペプチドライゲーションの目的、ならびに脂質、ポリマー、核酸、および蛍光色素の、利用可能なスルフヒドリル基を有する(または天然のジスルフィド結合の還元によって生成される)タンパク質および/または導入された小さなペプチドタグを有するタンパク質への結合に適しています。

1. FcドメインとMMAEの結合

注:部位特異的標識の前に、主要な試薬を準備します:目的の高純度タンパク質(この場合、Fcフラグメントおよび改変FGF2バリアント、開始点として1〜5 mgの組換えタンパク質、Sokolowska-Wedzina¹⁸に従って調製)、マレイミドカプロイル-Val-Cit-p-アミノベンジルアルコール(PABC)-モノメチルアウリスタチンE(MMAE)(注意、細胞毒性の高い薬剤、取り扱いには注意)、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)およびソーターゼA¹⁶.テトラグリシンペプチド(GGGG-MTX)に結合したメトトレキサート(注意、MTXは細胞毒性の高い薬剤ですので、取り扱いには注意が必要です)は、Fmoc戦略¹⁹の固相ペプチド合成(SPPS)法に従って固体支持相で合成するか、または市販の供給源から得ることができます。

1. Fcフラグメント内のジスルフィド結合を減少させるには(図1)、PBS(100 mM NaCl、18 mM NaH₂PO₄、33 mM Na₂HPO₄ pH 7.4)中のFcタンパク質(39 μM)に10倍モル過剰のTCEPを添加し、37°Cで1時間インキュベートします。 pH変化によるタンパク質の沈殿を防ぐため。
2. インキュベーション後、0.2 μmフィルターを使用して還元タンパク質をろ過し、タンパク質沈殿物を除去します。
3. 新しい反応チューブに、タンパク質-SH基の上に最初の4倍モル過剰のMMAE(MMAEを N,N-ジメチルアセトアミド(DMAc)に溶解して40 mMストック溶液を調製)を追加します。次に、Fcタンパク質の体積に対して2倍の量のPBSバッファーを追加します。最後に、ステップ1.2から減少したFcフラグメントを追加します。
   注:このステップでは、試薬の添加順序が重要です。
4. コンジュゲーション反応を15°Cで一晩中、穏やかに回転させて行います。これらの穏やかな条件は、タンパク質の変性を防ぎます。
5. 0.2 μmフィルターを使用してコンジュゲートで溶液をろ過し、潜在的な沈殿物を除去します。
6. SDS-PAGEを実施して、反応の効率を解析します。10% 分離ゲル、10 〜 250 kDa タンパク質マーカーを使用し、35 〜 50 kDa のバンドを分析します(図 2)。
   注:プロトコールはここで一時停止でき、反応混合物を4°Cで短期保存するか、-80°Cで長期保存するかのいずれかで保存します。ただし、凍結融解により追加の沈殿が発生し、コンジュゲート精製の収率が低下する可能性があります。
7. 反応混合物をプロテインA標識ビーズを含むカラムにロードし、300 mM NaCl、18 mM NaH₂PO₄、33 mM、Na₂HPO₄、0.1% Tween 20、2 mM EDTA pH 7.4を含む洗浄バッファー1で過剰なMMAEを洗い流します。次に、Washing Buffer 2 を使用してカラムを 650 mM NaCl、18 mM NaH₂PO₄、33 mM Na₂HPO₄、pH 7.4 で洗浄します。
   注:コンジュゲートのFc領域とビーズ上のプロテインAとの選択的相互作用により、コンジュゲートはカラム上に捕捉され、未反応のMMAEは洗い流されます。このステップは、高純度のコンジュゲートを得るために必要です。
8. 1 M Tris pH 9.0 を含む 0.1 M クエン酸ナトリウム pH 3.5 から 1.5 mL チューブ (1 mL のタンパク質と 200 μL の 1 M Tris pH 9.0) でカラムから Fc-MMAE コンジュゲートを溶出します。
9. Sephadex G-25樹脂を含むカラムを使用して、Fc-MMAEをPBS pH 7.4に脱塩します。このステップにより、コンジュゲートの変性が防止され、コンジュゲートをin vitroおよびin vivo試験で使用できるようになります。
   注:プロトコルはここで一時停止できます。
10. SDS-PAGE(10%)を実施して、最終的なFc-MMAEコンジュゲートを解析します。10% 分離ゲル、10 〜 250 kDa タンパク質マーカーを使用し、35 〜 50 kDa のバンドを分析します(図 2)。

2. 人工FGF2の結合

1. ソーターゼA媒介ライゲーションによるGGGG-MTXの遺伝子操作FGF2のC末端LPETGG配列への標識
   1. N末端KCKSGGおよびC末端LPETGG配列を含む精製精製されたFGF2(このステップでは標識に使用)を、G-25樹脂を含むカラムを使用して、ソーターゼA反応バッファー(25 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、10 mM(NH₄)₂SO₄、5 mM CaCl₂)に移します。Sortase A Reaction Bufferでタンパク質濃度を1 μMに調整します。
   2. DMAcに溶解したGGGG-MTXペプチドをタンパク質溶液に直接添加し、最終濃度100 μMにします。
   3. ソーターゼAを最終濃度0.1 μMまで添加し、15°Cで12時間、穏やかに回転させてインキュベートします。ステップ2.1.1-2.1.3で使用する試薬の濃度は、達成すべきコンジュゲートの収量と、標的タンパク質の生化学的特性(タンパク質精製の有効性、その溶解性、安定性)によって大きく左右されます。効果的なソーターゼA反応のためには、LPETGG含有標的タンパク質の10倍から100倍低いソーターゼAの濃度と、LPETGGタグ付きタンパク質の100倍高いGGGG-MTXの濃度を出発点として使用します。
   4. 反応混合物をヘパリンセファロースカラムにロードします。
   5. 未反応の分子を25 mM HEPES pH 7.4で洗い流します。
   6. 反応の生成物(FGF2.MTX)と25 mM HEPES、pH 7.4、2 M NaCl。
      注:プロトコルはここで一時停止できます。
   7. SDS-PAGEを使用してコンジュゲーションの効率を解析します。15% 分離ゲル、10 〜 250 kDa のタンパク質マーカーを使用し、15 〜 25 kDa のバンドを分析します(図 3)。
2. マレイミド-チオール反応による改変FGF2のN末端KCKSGG配列へのMMAEの結合
   1. 反応バッファー(25 mM HEPES pH 7.0、10 mM (NH₄)₂SO₄、10 mM メチオニン、0.1 mM EDTA)に、N末端KCKSGGおよびC末端LPETGG配列を含むFGF2をSephadex G-25樹脂カラムを用いて脱塩工学しました。Reaction Bufferでタンパク質濃度を25 μMに調整します。
   2. MMAEをDMAcに溶解し、40 mMのストック溶液を調製します。
   3. 新しい反応チューブに、タンパク質-SH基よりもMMAEの最初の4倍モル過剰を追加します。次に、FGF2タンパク質の容量に対して2倍の容量のPBSバッファーを追加します。最後にFGF2タンパク質を追加します。
      注:このステップでは、試薬の添加順序が重要です。
   4. 20°Cで1時間、穏やかに回転させて反応を行います。
   5. 反応混合物をカルボキシメチル(CM)-セファロースカラムにロードし、25 mM HEPES pH 7.4で過剰な非結合細胞毒性物質を洗い流します。これらの穏やかな条件は、タンパク質の変性を防ぎます。
   6. MMAEを溶出します。25 mM HEPES、pH 7.4、0.5 M NaCl のカラムからの FGF2 コンジュゲート。
      注:プロトコルはここで一時停止できます。
   7. SDS-PAGEを使用してコンジュゲーションの効率を解析します。15% 分離ゲル、10 〜 250 kDa のタンパク質マーカーを使用し、15 〜 25 kDa のバンドを分析します(図 3)。
3. マレイミド‐チオール化学とソーターゼA媒介ライゲーションの組み合わせを用いたエンジニアリングFGF2の二重弾頭複合体の調製
   注:人工FGF2のデュアル弾頭コンジュゲートを生成するには、ステップ2.1と2.2が組み合わされます。最初のMMAE。FGF2コンジュゲートは、マレイミド-チオール化学(ステップ2.2)を介して産生され、MMAEのC末端LPETGGタグへのGGGG-MTXとソーターゼAの結合に使用されます。FGF2 (ステップ 2.1)。また、逆の手順も可能です(最初にソーターゼAを介した標識、次にマレイミド-チオール反応)。
   1. 手順2.2.1-2.2.7を使用して、モノ置換MMAEを調製します。FGF2コンジュゲート。
   2. Sephadex G-25樹脂を含むカラムを使用して、バッファーをsortase A Reaction Buffer(25 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、10 mM (NH₄)₂SO₄、5 mM CaCl₂)に交換します。
   3. 2.1.2-2.1.7の説明に従って続行します。

提示されたプロトコルは、異なる細胞毒性薬物を目的のタンパク質に結合するための2つの異なる戦略を説明しています。さらに、個々の戦略の組み合わせが示され、これにより、部位特異的な方法で二重弾頭細胞傷害性コンジュゲートを生成することができます。

図2のSDS-PAGEゲルに示されているように(レーン2対3)、マレ?...

多様ながん種に対する選択的治療薬の設計に対する関心が高いため、標的タンパク質に異なるカーゴを部位特異的に結合させる戦略が急務となっています。標的タンパク質の部位特異的な修飾は、開発された生理活性コンジュゲートの均一性を確保するため、現代の治療薬の前提条件として重要です。化学的方法と酵素的方法の両方があり、選択したタンパク質にカ...

著者は何も開示していません。

この研究は、ポーランド科学財団のFirst TEAMおよびReintegrationプログラム(POIR.04.04.00-00-43B2/17-00;POIR.04.04.00-00-00-5E53/18-00)は、欧州地域開発基金の下で欧州連合が共同出資し、L.O.とA.S.M.Zの作品がOPUS(2018/31/B/NZ3/01656)と国立科学センターのSonata Bis(2015/18/E/NZ3/00501)の支援を受けました。A.S.Wの研究は、国立科学センターからのMiniatura助成金(2019/03/X/NZ1/01439)によって支援されました。