Preparación de conjugados de proteínas citotóxicas específicas del sitio mediante la química de maleimida-tiol y la ligadura mediada por sortasa A

Aquí proporcionamos protocolos detallados para un marcaje específico del sitio de proteínas con fármacos citotóxicos mediante la reacción de maleimida-tiol y la ligadura mediada por la sortasa A.

El cáncer es actualmente la segunda causa más común de muerte en todo el mundo. El sello distintivo de las células cancerosas es la presencia de proteínas marcadoras específicas, como los receptores del factor de crecimiento, en su superficie. Esta característica permite el desarrollo de terapias altamente selectivas, los bioconjugados proteicos, compuestos por proteínas diana (anticuerpos o ligandos receptores) conectadas a fármacos altamente citotóxicos por un enlazador específico. Debido a la alta afinidad y selectividad de las proteínas dirigidas, los bioconjugados reconocen las proteínas marcadoras en la superficie de las células cancerosas y utilizan la endocitosis mediada por receptores para llegar al interior de la célula. En última instancia, el sistema de transporte vesicular intracelular entrega los bioconjugados a los lisosomas, donde la proteólisis separa los fármacos citotóxicos libres del núcleo proteico de los bioconjugados, lo que desencadena la muerte de las células cancerosas dependientes de fármacos. Actualmente, existen varios bioconjugados de proteínas aprobados para el tratamiento del cáncer y un gran número está en desarrollo o ensayos clínicos.

Uno de los principales desafíos en la generación de los bioconjugados es la unión del fármaco citotóxico a la proteína diana. Los últimos años han traído un tremendo progreso en el desarrollo de estrategias químicas y enzimáticas para la modificación de proteínas con fármacos citotóxicos. Aquí presentamos los protocolos detallados para la incorporación de ojivas citotóxicas en proteínas objetivo utilizando un método químico que emplea la química de maleimida-tiol y un enfoque enzimático que se basa en la ligadura mediada por la sortasa A. Utilizamos una variante modificada del factor de crecimiento de fibroblastos 2 y una región cristalizable fragmentada de la inmunoglobulina G humana como proteínas dirigidas ejemplares y monometil auristatina E y metotrexato como fármacos citotóxicos modelo. Todas las estrategias descritas permiten la generación altamente eficiente de conjugados citotóxicos biológicamente activos de arquitectura molecular definida con potencial para el tratamiento selectivo de diversos cánceres.

Décadas de esfuerzos científicos han llevado a un enorme avance en nuestro conocimiento sobre los mecanismos moleculares que gobiernan el desarrollo y la progresión del cáncer. Al mismo tiempo, las posibilidades terapéuticas siguen siendo muy limitadas debido a los efectos adversos de los fármacos causados por su falta de selectividad, la gran variabilidad de los tumores y la resistencia a los fármacos que se desarrolla tras un tratamiento prolongado. Las terapias dirigidas contra el cáncer han ganado atención en los últimos años como enfoques novedosos y muy prometedores para el tratamiento de diversos tumores. Las terapias dirigidas se basan en sofisticados sistemas de administración de fármacos que entregan con precisión la carga citotóxica a las células cancerosas y evitan las sanas. Estos incluyen principalmente nanopartículas, liposomas y portadores de fármacos basados en proteínas.

Las células cancerosas a menudo exponen niveles elevados de proteínas marcadoras específicas en su superficie. Los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) son nuevos tratamientos anticancerígenos basados en proteínas, que combinan en una molécula la extrema especificidad de los anticuerpos monoclonales y la alta potencia citotóxica de los fármacos. Una vez unidos a la superficie de la célula cancerosa, los ADC utilizan la endocitosis mediada por receptores para entrar en la célula. Posteriormente, los ADC se transportan a través de compartimentos endosomales a los lisosomas, donde las proteasas degradan los ADC y liberan fármacos citotóxicos activos. Actualmente, hay ocho ADC aprobados en los EE. UU. para el tratamiento de diversos tumores, incluido el cáncer de mama triple negativo, el cáncer de mama HER2 positivo, el cáncer urotelial, el linfoma difuso de células B grandes, la neoplasia hematológica maligna, el linfoma de Hodgkin y la leucemia mieloide aguda. Un gran número de ADC también están en desarrollo o a la espera de aprobación¹. Cabe destacar que los enfoques de ingeniería de proteínas han llevado al desarrollo de diversas alternativas a los andamios de proteínas de anticuerpos monoclonales y sus conjugados citotóxicos. Estos incluyen diferentes fragmentos de anticuerpos ^2,3, DARPins ^4,5, knottins ^6,7, centirinas⁸, affibodies ^9,10 o ligandos receptores modificados^11,12.

Hay varios requisitos críticos que deben cumplirse para un conjugado citotóxico exitoso basado en proteínas, a saber, la estabilidad del conjugado, la especificidad extraordinaria, la alta afinidad del conjugado hacia el marcador específico del cáncer, la rápida internalización del conjugado en el interior de la célula cancerosa, su transporte eficiente a los lisosomas y la liberación intracelular efectiva de la carga útil activa. Otra característica importante es la homogeneidad de los conjugados, que depende en gran medida de la estrategia aplicada para la unión de la carga útil a las proteínas objetivo. Existen varios métodos disponibles para la conjugación de proteínas con fármacos citotóxicos, como la modificación de los residuos de cisteína o lisina de la cadena lateral de las proteínas, la unión del fármaco a aminoácidos no naturales incorporados a las proteínas diana o las modificaciones enzimáticas de las proteínas diana (por ejemplo, con transglutaminasa, glicosiltransferasa, enzima generadora de formilglicina, sortasa A). En la mayoría de los casos, los métodos de conjugación específicos del sitio requieren modificaciones de las moléculas objetivo (por ejemplo, a través de la ingeniería de cisteína o la introducción de etiquetas peptídicas cortas), pero a su vez dan como resultado una producción eficiente de conjugado homogéneo de interés.

Aquí proporcionamos protocolos para la conjugación altamente eficiente de proteínas dirigidas a proteínas con fármacos citotóxicos. Como proteínas ejemplares, utilizamos dos moléculas diferentes: el fragmento cristalizable (Fc) de IgG humana y una variante modificada del factor de crecimiento de fibroblastos humanos 2 (FGF2). El fragmento Fc constituye una parte integral de los ADC típicos, pero también está presente en otros tipos de conjugados como los pepticuerpos citotóxicos o los conjugados de fragmentos de anticuerpos. FGF2 es un ligando natural del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) que se diseñó con éxito para producir un conjugado citotóxico selectivo dirigido a las células cancerosas productoras de FGFR.

Presentamos dos estrategias de conjugación distintas que permiten la incorporación de fármacos citotóxicos en sitios específicos. En primer lugar, se proporciona el protocolo para la conjugación a las cadenas laterales de cisteína del fragmento Fc a través de la química de maleimida-tiol basada en el protocolo¹³ de Hermanson (Figura 1A,B). En este protocolo, dos enlaces disulfuro se reducen inicialmente con tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) y los grupos tiol libres resultantes se someten a conjugación con monometil auristatina E (MMAE) a través de la química de maleimida-tiol (Figura 1B). Debido a la interacción entre los dominios de cadena pesada constante 2 y 3 (CH2 y CH3), se conserva la estructura dimérica del Fc ligado al fármaco. En segundo lugar, se presenta la estrategia para la generación de un conjugado de FGF2 de doble ojiva que combina la ingeniería de cisteína y la ligadura mediada por la sortasa A para la incorporación de dos fármacos distintos en FGF2 de forma específica para cada sitio (Figura 1A,C). Se utiliza la variante sin cisteína de FGF2 que lleva KCKSGG N-terminal adicional con un solo residuo de cisteína expuesto y una etiqueta de péptido corto LPETGG C-terminal¹². La reacción maleimida-tiol permite la conjugación de MMAE a cisteína dentro del enlazador KCKSSG diseñado por nuestro grupo^14,15. Paso dependiente de la sortasa A (basado en Chen et al.)¹⁶ media la ligadura del péptido de tetraglicina GGGG-MTX unido a metotrexato (MTX) a la secuencia LPETGG C-terminal, produciendo dos tipos de conjugados de ojivas individuales (Figura 1C). La sortasa A es una proteasa de cisteína que cataliza la reacción de transpeptidación entre motivos LPETGG y GGGG. La enzima se une al motivo LPETGG en el extremo C de la proteína, luego el enlace amida entre la treonina y la glicina se hidroliza para formar un complejo enzima-sustrato. El siguiente paso es la aminólisis del enlace enzima-sustrato tioéster, donde el donante de un grupo amino primario es el residuo de glicina del motivo tetraglicina¹⁷. La combinación de estos dos enfoques genera conjugados de doble ojiva FGF2 específicos del sitio (Figura 1C). En principio, los protocolos de conjugación proporcionados se pueden aplicar con éxito a cualquier proteína dirigida diseñada de interés para generar conjugados citotóxicos selectivos. Además, la versatilidad de este enfoque lo hace adecuado para muchos otros propósitos de ligadura proteína-proteína y proteína-péptido, así como para la unión de lípidos, polímeros, ácidos nucleicos y fluoróforos a proteínas con grupo sulfhidrilo disponible (o generadas por reducción de enlaces disulfuro nativos) y/o con etiqueta peptídica pequeña introducida.

1. Conjugación del dominio FC con MMAE

NOTA: Antes de las conjugaciones específicas del sitio, prepare los reactivos clave: proteína de alta pureza de interés (en este caso, el fragmento Fc y la variante FGF2 diseñada, como punto de partida 1-5 mg de proteína recombinante, preparada de acuerdo con Sokolowska-Wedzina¹⁸), maleimidocaproil-Val-Cit-p-aminobencil alcohol (PABC)-monometil auristatina E (MMAE) (PRECAUCIÓN, agente altamente citotóxico, manéjelo con cuidado), Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) y sortasa A¹⁶. El metotrexato unido al péptido de tetraglicina (GGGG-MTX) (ATENCIÓN, MTX es un agente altamente citotóxico, manéjelo con cuidado) puede sintetizarse en la fase de soporte sólido de acuerdo con el método de síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) en la estrategia Fmoc¹⁹ u obtenerse de fuentes comerciales.

1. Para reducir los enlaces disulfuro dentro del fragmento Fc (Figura 1), agregue un exceso molar diez veces mayor de TCEP sobre la proteína Fc (39 μM) en PBS (100 mM NaCl, 18 mM NaH₂PO₄, 33 mM Na₂HPO₄ pH 7.4) e incube a 37 °C durante 1 h. La solución madre de TCEP debe tener un pH ajustado con 0,1 M de NaOH a 6,0, con el fin de evitar la precipitación de proteínas por los cambios de pH.
2. Después de la incubación, filtre la proteína reducida con un filtro de 0,2 μm para eliminar los precipitados de proteína.
3. Al nuevo tubo de reacción, agregue el primer exceso molar cuádruple de MMAE (disuelva MMAE en N,N-dimetilacetamida (DMAc) para preparar una solución madre de 40 mM) sobre los grupos proteína -SH. A continuación, añada el doble de volumen de tampón PBS en relación con el volumen de la proteína Fc. Por último, agregue el fragmento Fc reducido del paso 1.2.
   NOTA: En este paso, es importante el orden de adición de los reactivos.
4. Lleve a cabo la reacción de conjugación durante la noche a 15 °C con una rotación suave. Estas condiciones leves evitan la desnaturalización de las proteínas.
5. Filtre la solución con conjugado utilizando un filtro de 0,2 μm para eliminar los posibles precipitados.
6. Realice SDS-PAGE para analizar la eficiencia de la reacción. Utilice gel de separación al 10%, marcador proteico de 10 a 250 kDa y analice bandas entre 35 y 50 kDa (Figura 2).
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí y la mezcla de reacción se puede almacenar a 4 °C para el almacenamiento a corto plazo o a -80 °C para el almacenamiento a largo plazo. Sin embargo, la congelación y descongelación pueden causar precipitaciones adicionales y disminuir los rendimientos de purificación de conjugados.
7. Cargue la mezcla de reacción en una columna con perlas conjugadas con proteína A y lave el exceso de MMAE con el tampón de lavado 1 que contiene 300 mM de NaCl, 18 mM de NaH₂PO₄, 33 mM, Na₂HPO₄, 0,1% Tween 20, 2 mM de EDTA pH 7,4. A continuación, lave la columna con el tampón de lavado 2 con 650 mM de NaCl, 18 mM de NaH₂PO₄, 33 mM de Na₂HPO₄, pH 7,4.
   NOTA: A través de la interacción selectiva de la región Fc del conjugado con la proteína A en las perlas, el conjugado se captura en la columna, mientras que los MMAE sin reaccionar se eliminan. Este paso es necesario para obtener un conjugado de alta pureza.
8. Eluir el conjugado Fc-MMAE de la columna con tubos de citrato de sodio 0,1 M con pH 3,5 a 1,5 mL que contengan 1 M Tris pH 9,0 (1 mL de proteína por 200 μL de 1 M Tris pH 9,0).
9. Desala Fc-MMAE a PBS pH 7.4 utilizando una columna con resina Sephadex G-25. Este paso evita la desnaturalización del conjugado y permite que el conjugado se utilice en pruebas in vitro e in vivo.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
10. Realizar SDS-PAGE (10%) para analizar el conjugado final Fc-MMAE. Utilice gel de separación al 10%, marcador proteico de 10 a 250 kDa y analice bandas entre 35 y 50 kDa (Figura 2).

2. Conjugación de FGF2 de ingeniería

1. Conjugación de GGGG-MTX a la secuencia LPETGG C-terminal de FGF2 diseñado mediante ligadura mediada por sortasa A
   1. Transfiera FGF2 purificado que contiene KCKSGG N-terminal y secuencia LPETGG C-terminal (utilizada en este paso para la conjugación) al tampón de reacción de sortasa A (25 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 10 mM (NH₄)₂, SO₄, 5 mM, CaCl₂) utilizando una columna con resina G-25. Ajuste la concentración de proteínas a 1 μM con tampón de reacción de sortasa A.
   2. Añadir el péptido GGGG-MTX disuelto en DMAc, directamente a la solución proteica hasta una concentración final de 100 μM.
   3. Añadir sortasa A hasta una concentración final de 0,1 μM e incubar durante 12 h a 15 °C con una rotación suave. Las concentraciones de reactivos que deben utilizarse en los pasos 2.1.1-2.1.3 están determinadas en gran medida por el rendimiento del conjugado que se pretende conseguir y las características bioquímicas de la proteína objetivo (eficacia de la purificación de la proteína, su solubilidad y estabilidad). Para una reacción eficaz de la sortasa A, utilice un punto de partida con una concentración de la sortasa A diez a cien veces menor que la proteína objetivo que contiene LPETGG y una concentración 100 veces mayor de GGGG-MTX que la proteína marcada con LPETGG.
   4. Cargue la mezcla de reacción en una columna de heparina sefarosa.
   5. Lave las moléculas no reaccionadas con 25 mM HEPES pH 7.4.
   6. Eluir el producto de la reacción (FGF2. MTX) con 25 mM HEPES pH 7.4 con 2 M de NaCl.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
   7. Analice la eficiencia de la conjugación utilizando SDS-PAGE. Utilice gel de separación al 15%, marcador de proteínas de 10 a 250 kDa y analice bandas entre 15 y 25 kDa (Figura 3).
2. Conjugación de MMAE a la secuencia KCKSGG N-terminal de FGF2 diseñado mediante reacción de maleimida-tiol
   1. Desalinización de FGF2 que contiene KCKSGG N-terminal y secuencia LPETGG C-terminal al tampón de reacción (25 mM HEPES pH 7.0, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 10 mM metionina, 0.1 mM EDTA) utilizando una columna con resina Sephadex G-25. Ajuste la concentración de proteínas a 25 μM con el tampón de reacción.
   2. Disuelva MMAE en DMAc para preparar 40 mM de solución madre.
   3. Al nuevo tubo de reacción se añade el primer exceso molar cuádruple de MMAE sobre los grupos proteína -SH. A continuación, añada el doble volumen de tampón PBS en relación con el volumen de la proteína FGF2. Por último, agregue la proteína FGF2.
      NOTA: En este paso, el orden de adición de reactivos es importante.
   4. Llevar a cabo la reacción durante 1 h a 20 °C con una rotación suave.
   5. Cargue la mezcla de reacción en una columna de carboximetilo (CM)-Sepharose y lave el exceso del agente citotóxico no conjugado con 25 mM HEPES pH 7.4. Estas condiciones leves evitan la desnaturalización de las proteínas.
   6. Eluir el MMAE. FGF2 conjugado de la columna con 25 mM HEPES pH 7,4 con 0,5 M de NaCl.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
   7. Analice la eficiencia de la conjugación utilizando SDS-PAGE. Utilice gel de separación al 15%, marcador de proteínas de 10 a 250 kDa y analice bandas entre 15 y 25 kDa (Figura 3).
3. Preparación de un conjugado de ojiva dual de FGF2 ingeniado mediante una combinación de química de maleimida-tiol y ligadura mediada por sortasa A
   NOTA: Para la generación de ojivas duales conjugadas de FGF2 de ingeniería, se combinan los pasos 2.1 y 2.2. Primer MMAE. El conjugado FGF2 se produce mediante la química de maleimida-tiol (paso 2.2) y se utiliza para la unión de GGGG-MTX con sortasa A a la etiqueta LPETGG del terminal C de MMAE. FGF2 (paso 2.1). Además, también es posible el procedimiento inverso (primero conjugación mediada por la sortasa A, luego reacción de maleimida-tiol).
   1. Utilice los pasos 2.2.1-2.2.7 para la preparación de MMAE monosustituidos. FGF2 conjugado.
   2. Cambie el tampón por el tampón de reacción de la sortasa A (25 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 5 mM CaCl₂) utilizando una columna con resina Sephadex G-25.
   3. Continúe como se describe en 2.1.2-2.1.7.

Los protocolos presentados describen dos estrategias distintas para la conjugación de diferentes fármacos citotóxicos en proteínas de interés. Además, se muestra una combinación de estrategias individuales que permite generar conjugados citotóxicos duales de ojivas de una manera específica para cada sitio.

Como se muestra en los geles SDS-PAGE en la Figura 2 (carril 2 vs. 3), la reacción de maleimida-tiol permite alcanza...

Debido al gran interés en el diseño de terapias selectivas contra diversos tipos de cáncer, existe una necesidad urgente de estrategias que permitan la unión específica del sitio de distintas cargas a las proteínas diana. La modificación específica del sitio de las proteínas diana es fundamental, ya que garantiza la homogeneidad de los conjugados bioactivos desarrollados, un requisito previo para la terapéutica moderna. Existen varios métodos, tanto químicos como enzimáticos...

Los autores no tienen nada que revelar.

Este trabajo fue apoyado por el Primer EQUIPO y los programas de Reintegración de la Fundación para la Ciencia Polaca (POIR.04.04.00-00-43B2/17-00; POIR.04.04.00-00-5E53/18-00) cofinanciado por la Unión Europea en el marco del Fondo Europeo de Desarrollo Regional, adjudicado a L.O y A.S. M.Z. El trabajo ha contado con el apoyo de OPUS (2018/31/B/NZ3/01656) y Sonata Bis (2015/18/E/NZ3/00501) del Centro Nacional de Ciencias. El trabajo de A.S.W fue apoyado por la beca Miniatura del Centro Nacional de Ciencias (2019/03/X/NZ1/01439).