Préparation de conjugués protéiques cytotoxiques spécifiques au site par chimie maléimide-thiol et ligature médiée par la sortase A

Nous fournissons ici des protocoles détaillés pour un marquage spécifique au site des protéines avec des médicaments cytotoxiques en utilisant la réaction maléimide-thiol et la ligature médiée par la sorte A.

Le cancer est actuellement la deuxième cause de décès dans le monde. La caractéristique des cellules cancéreuses est la présence de protéines marqueurs spécifiques telles que les récepteurs du facteur de croissance à leur surface. Cette caractéristique permet de développer des thérapies hautement sélectives, les bioconjugués protéiques, composés de protéines ciblées (anticorps ou ligands récepteurs) connectées à des médicaments hautement cytotoxiques par un linker spécifique. En raison de la très grande affinité et de la sélectivité des protéines de ciblage, les bioconjugués reconnaissent les protéines marqueurs à la surface des cellules cancéreuses et utilisent l’endocytose médiée par le récepteur pour atteindre l’intérieur de la cellule. Le système de transport vésiculaire intracellulaire délivre finalement les bioconjugués aux lysosomes, où la protéolyse sépare les médicaments cytotoxiques libres du noyau protéique des bioconjugués, déclenchant la mort des cellules cancéreuses dépendantes des médicaments. À l’heure actuelle, plusieurs bioconjugués protéiques sont approuvés pour le traitement du cancer et un grand nombre d’entre eux sont en cours de développement ou d’essais cliniques.

L’un des principaux défis dans la génération des bioconjugués est une fixation spécifique du médicament cytotoxique à la protéine cible. Ces dernières années ont apporté d’énormes progrès dans le développement de stratégies chimiques et enzymatiques pour la modification des protéines avec des médicaments cytotoxiques. Nous présentons ici les protocoles détaillés pour l’incorporation spécifique au site d’ogives cytotoxiques dans des protéines de ciblage à l’aide d’une méthode chimique utilisant la chimie maléimide-thiol et d’une approche enzymatique qui repose sur la ligature médiée par la sorte A. Nous utilisons une variante modifiée du facteur de croissance des fibroblastes 2 et une région cristallisable fragmentaire de l’immunoglobuline G humaine comme protéines de ciblage exemplaires, ainsi que la monométhylauristatine E et le méthotrexate comme médicaments cytotoxiques modèles. Toutes les stratégies décrites permettent de générer très efficacement des conjugués cytotoxiques biologiquement actifs d’architecture moléculaire définie avec un potentiel de traitement sélectif de divers cancers.

Des décennies d’efforts scientifiques ont permis de faire progresser considérablement nos connaissances sur les mécanismes moléculaires qui régissent le développement et la progression du cancer. Dans le même temps, les possibilités thérapeutiques sont encore largement limitées en raison des effets indésirables des médicaments causés par leur manque de sélectivité, la grande variabilité des tumeurs et la résistance aux médicaments développée après un traitement prolongé. Ces dernières années, les thérapies anticancéreuses ciblées ont attiré l’attention en tant qu’approches nouvelles et très prometteuses pour le traitement de diverses tumeurs. Les thérapies ciblées reposent sur des systèmes sophistiqués d’administration de médicaments qui délivrent avec précision la charge cytotoxique aux cellules cancéreuses et épargnent les cellules saines. Il s’agit principalement de nanoparticules, de liposomes et de vecteurs de médicaments à base de protéines.

Les cellules cancéreuses exposent souvent des niveaux élevés de protéines marqueurs spécifiques à leur surface. Les conjugués anticorps-médicament (ADC) sont de nouveaux traitements anticancéreux à base de protéines, qui combinent en une seule molécule l’extrême spécificité des anticorps monoclonaux et la puissance cytotoxique élevée des médicaments. Une fois liés à la surface de la cellule cancéreuse, les ADC utilisent l’endocytose médiée par le récepteur pour pénétrer dans la cellule. Par la suite, les ADC sont transportés via les compartiments endosomaux vers les lysosomes, où les protéases dégradent les ADC et libèrent des médicaments cytotoxiques actifs. À l’heure actuelle, il existe huit ADC approuvés aux États-Unis pour le traitement de diverses tumeurs, notamment le cancer du sein triple négatif, le cancer du sein HER2 positif, le cancer urothélial, le lymphome diffus à grandes cellules B, l’hémopathie maligne, le lymphome hodgkinien et la leucémie myéloïde aiguë. Un grand nombre d’ADC sont également en cours de développement ou en attente d’approbation¹. Des approches d’ingénierie des protéines remarquables ont conduit au développement de diverses alternatives aux anticorps monoclonaux : les échafaudages protéiques et leurs conjugués cytotoxiques. Il s’agit notamment de différents fragments d’anticorps ^2,3, de DARPins ^4,5, de nœuds ^6,7, de centyrines⁸, d’afficorps ^9,10 ou de ligands de récepteurs^{modifiés 11,12}.

Un conjugué cytotoxique à base de protéines réussi doit répondre à plusieurs exigences critiques, à savoir la stabilité du conjugué, sa spécificité extraordinaire, sa haute affinité envers le marqueur spécifique du cancer, l’internalisation rapide du conjugué à l’intérieur de la cellule cancéreuse, son transport efficace vers les lysosomes et la libération intracellulaire efficace de la charge utile active. Une autre caractéristique importante est l’homogénéité des conjugués, qui dépend en grande partie de la stratégie appliquée pour l’attachement de la charge utile aux protéines cibles. Il existe plusieurs méthodes disponibles pour la conjugaison spécifique du site des protéines avec des médicaments cytotoxiques, comme la modification des résidus de cystéine ou de lysine à chaîne latérale des protéines, la fixation du médicament à des acides aminés non naturels incorporés dans les protéines cibles, ou des modifications enzymatiques des protéines cibles (par exemple, avec la transglutaminase, la glycosyltransférase, l’enzyme génératrice de formylglycine, la sortase A). Dans la plupart des cas, les méthodes de conjugaison spécifiques au site nécessitent des modifications des molécules de ciblage (par exemple, via l’ingénierie de la cystéine ou l’introduction de marqueurs peptidiques courts), mais aboutissent à leur tour à une production efficace de conjugué homogène d’intérêt.

Ici, nous fournissons des protocoles pour une conjugaison très efficace spécifique au site de protéines ciblées avec des médicaments cytotoxiques. À titre de protéines exemplaires, nous avons utilisé deux molécules différentes : le fragment cristallisable (Fc) d’IgG humaines et une variante modifiée du facteur de croissance des fibroblastes humains 2 (FGF2). Le fragment Fc fait partie intégrante des ADC typiques, mais il est également présent dans d’autres types de conjugués comme les peptibodies cytotoxiques ou les conjugués de fragments d’anticorps. Le FGF2 est un ligand du récepteur naturel du facteur de croissance des fibroblastes (FGFR) qui a été conçu avec succès pour produire un conjugué cytotoxique sélectif ciblant les cellules cancéreuses surproductrices de FGFR.

Nous présentons deux stratégies de conjugaison distinctes permettant l’incorporation spécifique au site de médicaments cytotoxiques. Tout d’abord, le protocole de conjugaison aux chaînes latérales de cystéine du fragment Fc via la chimie maléimide-thiol basé sur le protocole¹³ de Hermanson est fourni (Figure 1A,B). Dans ce protocole, deux liaisons disulfures sont initialement réduites avec la tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP) et les groupes thiols libres qui en résultent sont soumis à la conjugaison avec la monométhyl auristatine E (MMAE) via la chimie maléimide-thiol (Figure 1B). En raison de l’interaction entre les domaines constants de la chaîne lourde 2 et 3 (CH2 et CH3), la structure dimérique du Fc lié au médicament est préservée. Deuxièmement, la stratégie de génération du conjugué FGF2 à double ogive est présentée, qui combine l’ingénierie de la cystéine et la ligature médiée par la sortase A pour l’incorporation de deux médicaments distincts dans le FGF2 d’une manière spécifique au site (Figure 1A, C). La variante sans cystéine de FGF2 portant un KCKSGG N-terminal supplémentaire avec un seul résidu de cystéine exposé et une étiquette peptidique courte LPETGG C-terminale est utilisée¹². La réaction maléimide-thiol permet la conjugaison de MMAE à cystéine dans l’agent de liaison KCKSSG conçu par notre groupe^14,15. Pas dépendant de la sortase A (basé sur Chen et al.)¹⁶ médie la ligature du peptide tétraglycine GGGG-MTX lié au méthotrexate (MTX) à la séquence C-terminale LPETGG, produisant deux types de conjugués à ogive unique (Figure 1C). La sortase A est une protéase cystéine qui catalyse la réaction de transpeptidation entre les motifs LPETGG et GGGG. L’enzyme se lie au motif LPETGG à l’extrémité C-terminale de la protéine, puis la liaison amide entre la thréonine et la glycine est hydrolysée pour former un complexe enzyme-substrat. L’étape suivante est l’aminolyse de la liaison enzyme-substrat du thioester, où le donneur d’un groupe amino primaire est le résidu glycine du motif tétraglycine¹⁷. La combinaison de ces deux approches permet d’obtenir des conjugués d’ogives doubles FGF2 spécifiques au site (figure 1C). En principe, à condition que les protocoles de conjugaison puissent être appliqués avec succès à toute protéine de ciblage d’intérêt modifiée pour générer des conjugués cytotoxiques sélectifs. De plus, la polyvalence de cette approche la rend adaptée à de nombreuses autres fins de ligature protéine-protéine et protéine-peptide, ainsi que pour la fixation de lipides, de polymères, d’acides nucléiques et de fluorophores à des protéines avec un groupe sulfhydryle disponible (ou générées par réduction de liaisons disulfure natives) et/ou avec un petit marqueur peptidique introduit.

1. Conjugaison du domaine Fc avec MMAE

REMARQUE : Avant les conjugaisons spécifiques au site, préparez les réactifs clés : protéine d’intérêt très pure (dans ce cas, le fragment Fc et la variante FGF2 modifiée, comme point de départ 1-5 mg de protéine recombinante, préparée selon Sokolowska-Wedzina¹⁸), maléimidocaproyl-Val-Cit-p-aminobenzyl alcohol (PABC)-monométhyl auristatine E (MMAE) (ATTENTION, agent hautement cytotoxique, manipuler avec précaution), Tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP) et sortase A¹⁶. Le méthotrexate lié au peptide de tétraglycine (GGGG-MTX) (ATTENTION, MTX est un agent hautement cytotoxique, à manipuler avec précaution) peut être soit synthétisé sur la phase de support solide selon la méthode de synthèse des peptides en phase solide (SPPS) dans la stratégie Fmoc¹⁹, soit obtenu à partir de sources commerciales.

1. Pour réduire les liaisons disulfure à l’intérieur du fragment Fc (figure 1), ajouter un excès molaire dix fois plus important de PTEP sur la protéine Fc (39 μM) dans du PBS (100 mM NaCl, 18 mM NaH₂PO₄, 33 mM Na₂HPO₄ pH 7,4) et incuber à 37 °C pendant 1 h. Le pH de la solution mère de PTEP doit être ajusté avec 0,1 M NaOH à 6,0, afin d’empêcher la précipitation des protéines due aux changements de pH.
2. Après l’incubation, filtrez la protéine réduite à l’aide d’un filtre de 0,2 μm pour éliminer les précipités protéiques.
3. Au nouveau tube réactionnel, ajoutez d’abord un excès molaire quadruple de MMAE (dissoudre MMAE dans du N,N-diméthylacétamide (DMAc) pour préparer une solution mère de 40 mM) sur les groupes protéine-SH. Ajoutez ensuite le double du volume de tampon PBS par rapport au volume de la protéine Fc. Enfin, ajoutez le fragment Fc réduit à partir de l’étape 1.2.
   REMARQUE : Dans cette étape, l’ordre d’ajout des réactifs est important.
4. Effectuer la réaction de conjugaison pendant la nuit à 15 °C avec une rotation douce. Ces conditions bénignes empêchent la dénaturation des protéines.
5. Filtrer la solution avec un conjugué à l’aide d’un filtre de 0,2 μm pour éliminer les précipités potentiels.
6. Effectuez SDS-PAGE pour analyser l’efficacité de la réaction. Utilisez du gel de séparation à 10 %, un marqueur protéique de 10 à 250 kDa et analysez les bandes entre 35 et 50 kDa (Figure 2).
   REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici, et le mélange réactionnel stocké soit à 4 °C pour un stockage à court terme, soit à -80 °C pour un stockage à long terme. Cependant, le gel et la décongélation peuvent provoquer des précipitations supplémentaires et diminuer les rendements de purification conjuguée.
7. Chargez le mélange réactionnel sur une colonne avec des billes conjuguées à la protéine A et rincez l’excès de MMAE avec le tampon de lavage 1 contenant 300 mM de NaCl, 18 mM de NaH₂PO₄, 33 mM, Na₂HPO₄, 0,1 % Tween 20, 2 mM EDTA pH 7,4. Laver ensuite la colonne à l’aide du tampon de lavage 2 avec 650 mM NaCl, 18 mM NaH₂PO₄, 33 mM Na₂HPO₄, pH 7,4.
   REMARQUE : Par l’interaction sélective de la région Fc du conjugué avec la protéine A sur les billes, le conjugué est capturé sur la colonne, tandis que les MMAE n’ayant pas réagi sont lavés. Cette étape est nécessaire pour obtenir un conjugué très pur.
8. Éluer le conjugué Fc-MMAE de la colonne avec du citrate de sodium 0,1 M pH 3,5 à 1,5 mL dans des tubes contenant 1 M Tris pH 9,0 (1 mL de protéines pour 200 μL de 1 M Tris pH 9,0).
9. Dessaler Fc-MMAE à PBS pH 7,4 à l’aide d’une colonne avec de la résine Sephadex G-25. Cette étape empêche la dénaturation du conjugué et permet de l’utiliser dans des essais in vitro et in vivo.
   REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.
10. Réaliser SDS-PAGE (10 %) pour analyser le conjugué Fc-MMAE final. Utilisez du gel de séparation à 10 %, un marqueur protéique de 10 à 250 kDa et analysez les bandes entre 35 et 50 kDa (Figure 2).

2. Conjugaison du FGF2 modifié

1. Conjugaison de GGGG-MTX à la séquence LPETGG C-terminale de FGF2 modifié via une ligature médiée par la sortase A
   1. Transférer le FGF2 purifié contenant la séquence N-terminale KCKSGG et C-terminale LPETGG (utilisée dans cette étape pour la conjugaison) dans le tampon réactionnel de la sorte A (25 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 5 mM CaCl₂) à l’aide d’une colonne avec de la résine G-25. Ajustez la concentration en protéines à 1 μM avec le tampon de réaction sortase A.
   2. Ajouter le peptide GGGG-MTX dissous dans le DMAc, directement à la solution protéique jusqu’à une concentration finale de 100 μM.
   3. Ajouter la sortase A à une concentration finale de 0,1 μM et incuber pendant 12 h à 15 °C avec une rotation douce. Les concentrations des réactifs à utiliser dans les étapes 2.1.1 à 2.1.3 sont largement déterminées par le rendement en conjugué à obtenir et les caractéristiques biochimiques de la protéine ciblée (efficacité de purification des protéines, solubilité et stabilité). Pour une réaction de sorte A efficace, utilisez un point de départ de dix à cent fois plus faible que la concentration de sorte A que la protéine cible contenant du LPETGG et une concentration 100 fois plus élevée de GGGG-MTX que la protéine marquée LPETGG.
   4. Chargez le mélange réactionnel sur une colonne d’héparine sépharose.
   5. Laver les molécules n’ayant pas réagi avec 25 mM HEPES pH 7,4.
   6. Éluer le produit de la réaction (FGF2. MTX) avec 25 mM HEPES pH 7,4 avec 2 M NaCl.
      REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.
   7. Analysez l’efficacité de la conjugaison à l’aide de SDS-PAGE. Utilisez un gel de séparation à 15 %, un marqueur protéique de 10 à 250 kDa et analysez les bandes entre 15 et 25 kDa (Figure 3).
2. Conjugaison de MMAE à la séquence N-terminale KCKSGG de FGF2 modifié par réaction maléimide-thiol
   1. Dessaler le FGF2 contenant la séquence N-terminale KCKSGG et C-terminale LPETGG dans le tampon de réaction (25 mM HEPES pH 7,0, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 10 mM méthionine, 0,1 mM EDTA) à l’aide d’une colonne avec de la résine Sephadex G-25. Ajustez la concentration en protéines à 25 μM avec le tampon de réaction.
   2. Dissoudre les MMAE dans le DMAc pour préparer une solution mère de 40 mM.
   3. Au nouveau tube réactionnel, ajoutez d’abord un excès molaire de MMAE sur les groupes protéique -SH. Ajoutez ensuite le double volume de tampon PBS par rapport au volume de la protéine FGF2. Enfin, ajoutez la protéine FGF2.
      REMARQUE : Dans cette étape, l’ordre d’ajout des réactifs est important.
   4. Effectuer la réaction pendant 1 h à 20 °C avec une rotation douce.
   5. Chargez le mélange réactionnel sur une colonne de carboxyméthyle (CM)-sépharose et rincez l’excès d’agent cytotoxique non conjugué avec 25 mM HEPES pH 7,4. Ces conditions bénignes empêchent la dénaturation des protéines.
   6. Éluer le MMAE. FGF2 conjugué de la colonne avec 25 mM HEPES pH 7,4 avec 0,5 M NaCl.
      REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.
   7. Analysez l’efficacité de la conjugaison à l’aide de SDS-PAGE. Utilisez un gel de séparation à 15 %, un marqueur protéique de 10 à 250 kDa et analysez les bandes entre 15 et 25 kDa (Figure 3).
3. Préparation d’un conjugué à double ogive de FGF2 incorporé par l’intermédiaire de la combinaison de la chimie maléimide-thiol et de la ligature médiée par la sortase A
   REMARQUE : Pour la génération de conjugués à deux ogives de FGF2 conçus, les étapes 2.1 et 2.2 sont combinées. Premier MMAE. Le conjugué FGF2 est produit par chimie maléimide-thiol (étape 2.2) et utilisé pour la fixation de GGGG-MTX avec la sorte ase A à l’étiquette LPETGG terminale C de MMAE. FGF2 (étape 2.1). De plus, une procédure inverse est également possible (d’abord la conjugaison médiée par la sortase A, puis la réaction maléimide-thiol).
   1. Utiliser les étapes 2.2.1 à 2.2.7 pour la préparation du MMAE mono-substitué. FGF2.
   2. Remplacez le tampon par le tampon de réaction sortase A (25 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 5 mM CaCl₂) à l’aide d’une colonne avec de la résine Sephadex G-25.
   3. Continuer comme décrit aux points 2.1.2 à 2.1.7.

Les protocoles présentés décrivent deux stratégies distinctes pour la conjugaison de différents médicaments cytotoxiques en protéines d’intérêt. De plus, une combinaison de stratégies individuelles est mise en évidence qui permet de générer des conjugués cytotoxiques à double ogive d’une manière spécifique au site.

Comme le montrent les gels SDS-PAGE de la figure 2 (voie 2 vs. 3), la réaction maléimide-thiol...

En raison du grand intérêt pour la conception de thérapies sélectives contre divers types de cancer, il existe un besoin urgent de stratégies permettant de fixer des cargaisons distinctes aux protéines ciblées à un site spécifique. La modification spécifique du site des protéines de ciblage est essentielle car elle garantit l’homogénéité des conjugués bioactifs développés, une condition préalable aux thérapies modernes. Il existe plusieurs méthodes, à la fois chimi...

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce travail a été soutenu par la First TEAM et les programmes de réintégration de la Fondation pour la science polonaise (POIR.04.04.00-00-43B2/17-00 ; POIR.04.04.00-00-5E53/18-00) cofinancé par l’Union européenne dans le cadre du Fonds européen de développement régional, attribué à L.O et A.S. M.Z les travaux ont été soutenus par OPUS (2018/31/B/NZ3/01656) et Sonata Bis (2015/18/E/NZ3/00501) du Centre national des sciences. Les travaux d’A.S.W ont été soutenus par une subvention Miniatura du Centre national des sciences (2019/03/X/NZ1/01439).