Preparazione di coniugati proteici citotossici sito-specifici mediante chimica maleimmide-tiolo e legatura mediata dalla sortasi A

Qui forniamo protocolli dettagliati per una marcatura sito-specifica di proteine con farmaci citotossici utilizzando la reazione maleimmide-tiolo e la legatura mediata dalla sortasi A.

Il cancro è attualmente la seconda causa di morte più comune in tutto il mondo. Il segno distintivo delle cellule tumorali è la presenza di specifiche proteine marcatrici come i recettori del fattore di crescita sulla loro superficie. Questa caratteristica consente lo sviluppo di terapie altamente selettive, i bioconiugati proteici, composti da proteine bersaglio (anticorpi o ligandi recettoriali) collegate a farmaci altamente citotossici da un linker specifico. A causa dell'altissima affinità e selettività delle proteine bersaglio, i bioconiugati riconoscono le proteine marcatrici sulla superficie delle cellule tumorali e utilizzano l'endocitosi mediata dal recettore per raggiungere l'interno della cellula. Il sistema di trasporto vescicolare intracellulare fornisce infine i bioconiugati ai lisosomi, dove la proteolisi separa i farmaci citotossici liberi dal nucleo proteico dei bioconiugati, innescando la morte delle cellule tumorali farmaco-dipendenti. Attualmente, ci sono diversi bioconiugati proteici approvati per il trattamento del cancro e un gran numero è in fase di sviluppo o sperimentazione clinica.

Una delle principali sfide nella generazione dei bioconiugati è l'attaccamento sito-specifico del farmaco citotossico alla proteina bersaglio. Gli ultimi anni hanno portato un enorme progresso nello sviluppo di strategie chimiche ed enzimatiche per la modificazione delle proteine con farmaci citotossici. Qui presentiamo i protocolli dettagliati per l'incorporazione sito-specifica di testate citotossiche in proteine bersaglio utilizzando un metodo chimico che impiega la chimica maleimmide-tiolo e un approccio enzimatico che si basa sulla legatura mediata dalla sortasi A. Utilizziamo la variante ingegnerizzata del fattore di crescita dei fibroblasti 2 e la regione cristallizzabile del frammento dell'immunoglobulina G umana come proteine mirate esemplari e monometil auristatina E e metotrexato come farmaci citotossici modello. Tutte le strategie descritte consentono la generazione altamente efficiente di coniugati citotossici biologicamente attivi di architettura molecolare definita con potenziale per il trattamento selettivo di diversi tumori.

Decenni di sforzi scientifici hanno portato a un enorme progresso nelle nostre conoscenze sui meccanismi molecolari che regolano lo sviluppo e la progressione del cancro. Allo stesso tempo, le possibilità terapeutiche sono ancora in gran parte limitate a causa degli effetti avversi dei farmaci causati dalla loro mancanza di selettività, dalla grande variabilità dei tumori e dalla farmaco-resistenza sviluppata dopo un trattamento prolungato. Negli ultimi anni le terapie antitumorali mirate hanno attirato l'attenzione come approcci nuovi e molto promettenti per il trattamento di diversi tumori. Le terapie mirate si basano su sofisticati sistemi di somministrazione di farmaci che forniscono con precisione il carico utile citotossico alle cellule tumorali e risparmiano quelle sane. Questi includono principalmente nanoparticelle diverse, liposomi e vettori di farmaci a base di proteine.

Le cellule tumorali spesso espongono livelli elevati di proteine marcatrici specifiche sulla loro superficie. I coniugati anticorpo-farmaco (ADC) sono nuove terapie antitumorali a base di proteine, che combinano in un'unica molecola l'estrema specificità degli anticorpi monoclonali e l'elevata potenza citotossica dei farmaci. Una volta legati alla superficie della cellula tumorale, gli ADC utilizzano l'endocitosi mediata dal recettore per entrare nella cellula. Successivamente, gli ADC vengono trasportati attraverso i compartimenti endosomiali ai lisosomi, dove le proteasi degradano gli ADC e rilasciano farmaci citotossici attivi. Attualmente, ci sono otto ADC approvati negli Stati Uniti per il trattamento di diversi tumori, tra cui il carcinoma mammario triplo negativo, il carcinoma mammario HER2 positivo, il cancro uroteliale, il linfoma diffuso a grandi cellule B, la neoplasia ematologica, il linfoma di Hodgkin e la leucemia mieloide acuta. Anche un gran numero di ADC è in fase di sviluppo o è in attesa di approvazione¹. Degno di nota, gli approcci di ingegneria proteica hanno portato allo sviluppo di diverse alternative agli scaffold proteici degli anticorpi monoclonali e ai loro coniugati citotossici. Questi includono diversi frammenti di anticorpi ^2,3, DARPins ^4,5, knottine ^6,7, centirine⁸, affibodies ^9,10 o ligandi recettoriali ingegnerizzati^11,12.

Ci sono diversi requisiti critici che devono essere soddisfatti da un coniugato citotossico a base proteica di successo, vale a dire la stabilità del coniugato, la straordinaria specificità, l'elevata affinità del coniugato verso il marcatore specifico del cancro, la rapida internalizzazione del coniugato all'interno della cellula tumorale, il suo trasporto efficiente ai lisosomi e l'efficace rilascio intracellulare del carico utile attivo. Un'altra caratteristica importante è l'omogeneità dei coniugati, che dipende in gran parte dalla strategia applicata per l'attaccamento del payload alle proteine bersaglio. Sono disponibili diversi metodi per la coniugazione sito-specifica di proteine con farmaci citotossici, come la modifica della cisteina a catena laterale delle proteine o dei residui di lisina, l'adesione del farmaco ad amminoacidi innaturali incorporati nelle proteine bersaglio o le modifiche enzimatiche delle proteine bersaglio (ad esempio, con transglutaminasi, glicosiltransferasi, enzima generatore di formilglicina, sortasi A). Nella maggior parte dei casi, i metodi di coniugazione sito-specifici richiedono modifiche delle molecole bersaglio (ad esempio, tramite l'ingegneria della cisteina o l'introduzione di brevi tag peptidici), ma a loro volta portano a una produzione efficiente di coniugato omogeneo di interesse.

Qui forniamo protocolli per la coniugazione sito-specifica altamente efficiente di proteine bersaglio con farmaci citotossici. Come proteine esemplari abbiamo utilizzato due diverse molecole: il frammento cristallizzabile (Fc) di IgG umane e una variante ingegnerizzata del fattore di crescita dei fibroblasti umani 2 (FGF2). Il frammento Fc costituisce parte integrante delle ADC tipiche, ma è presente anche in altri tipi di coniugati come pepticorpi citotossici o coniugati di frammenti di anticorpi. FGF2 è un ligando naturale del recettore del fattore di crescita dei fibroblasti (FGFR) che è stato ingegnerizzato con successo per produrre un coniugato citotossico selettivo che prende di mira le cellule tumorali che sovraproducono FGFR.

Presentiamo due distinte strategie di coniugazione che consentono l'incorporazione sito-specifica di farmaci citotossici. In primo luogo, viene fornito il protocollo per la coniugazione alle catene laterali della cisteina del frammento Fc tramite la chimica maleimmide-tiolo basato sul protocollo¹³ di Hermanson (Figura 1A,B). In questo protocollo, due legami disolfuro vengono inizialmente ridotti con tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP) e i gruppi tiolici liberi risultanti vengono sottoposti a coniugazione con monometil auristatina E (MMAE) tramite la chimica maleimmide-tiolo (Figura 1B). A causa dell'interazione tra i domini costanti della catena pesante 2 e 3 (CH2 e CH3) la struttura dimerica della Fc legata al farmaco è preservata. In secondo luogo, viene presentata la strategia per la generazione di coniugato FGF2 a doppia testata che combina l'ingegneria della cisteina e la legatura mediata dalla sortasi A per l'incorporazione di due farmaci distinti in FGF2 in modo sito-specifico (Figura 1A,C). Viene utilizzata la variante priva di cisteina di FGF2 con KCKSGG N-terminale aggiuntivo con singolo residuo di cisteina esposto e tag peptidico corto LPETGG C-terminale¹². La reazione maleimmide-tiolo consente la coniugazione di MMAE a cisteina all'interno del linker KCKSSG progettato dal nostro gruppo^14,15. Passaggio dipendente dalla sortasi A (basato su Chen et al.)¹⁶ media la legatura del peptide di tetraglicina GGGG-MTX legato al metotrexato (MTX) alla sequenza LPETGG C-terminale, producendo due tipi di coniugati a testata singola (Figura 1C). La sortasi A è una cisteina proteasi che catalizza la reazione di transpeptidazione tra i motivi LPETGG e GGGG. L'enzima si lega al motivo LPETGG all'estremità C della proteina, quindi il legame ammidico tra la treonina e la glicina viene idrolizzato per formare un complesso enzima-substrato. Il passo successivo è l'amminolisi del legame enzima-substrato tioestere, dove il donatore di un gruppo amminico primario è il residuo glicina del motivo tetraglicina¹⁷. La combinazione di questi due approcci genera coniugati a doppia testata FGF2 sito-specifici (Figura 1C). In linea di principio, i protocolli di coniugazione forniti possono essere applicati con successo a qualsiasi proteina di targeting ingegnerizzata di interesse per generare coniugati citotossici selettivi. Inoltre, la versatilità di questo approccio lo rende adatto per molti altri scopi di legatura proteina-proteina e proteina-peptide, nonché per l'adesione di lipidi, polimeri, acidi nucleici e fluorofori a proteine con gruppo sulfidrilico disponibile (o generato dalla riduzione dei legami disolfuro nativi) e/o con l'introduzione di un piccolo tag peptidico.

1. Coniugazione del dominio Fc con MMAE

NOTA: Prima delle coniugazioni sito-specifiche preparare i reagenti chiave: proteina altamente pura di interesse (in questo caso il frammento Fc e la variante FGF2 ingegnerizzata, come punto di partenza 1-5 mg di proteina ricombinante, preparata secondo Sokolowska-Wedzina¹⁸), maleimidocaproyl-Val-Cit-p-amminobenzil alcol (PABC)-monometil auristatina E (MMAE) (ATTENZIONE, agente altamente citotossico, maneggiare con cura), Tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP) e sortasi A¹⁶. Il metotrexato legato al peptide della tetraglicina (GGGG-MTX) (ATTENZIONE, MTX è un agente altamente citotossico, maneggiare con cura) può essere sintetizzato nella fase di supporto solido secondo il metodo di sintesi del peptide in fase solida (SPPS) nella strategia Fmoc¹⁹ o ottenuto da fonti commerciali.

1. Per ridurre i legami disolfuro all'interno del frammento Fc (Figura 1), aggiungere un eccesso molare di TCEP decuplicato sulla proteina Fc (39 μM) in PBS (100 mM NaCl, 18 mM NaH₂PO₄, 33 mM Na₂HPO₄ pH 7,4) e incubare a 37 °C per 1 ora. La soluzione madre di TCEP deve avere un pH regolato con 0,1 M NaOH a 6,0, al fine di prevenire la precipitazione delle proteine a causa di variazioni di pH.
2. Dopo l'incubazione, filtrare le proteine ridotte utilizzando un filtro da 0,2 μm per rimuovere i precipitati proteici.
3. Alla nuova provetta di reazione aggiungere il primo eccesso di MMAE di quattro volte molare (sciogliere MMAE in N,N-dimetilacetammide (DMAc) per preparare una soluzione madre di 40 mM) sui gruppi proteina-SH. Quindi aggiungere il doppio volume di tampone PBS in relazione al volume della proteina Fc. Infine aggiungi il frammento Fc ridotto dal passaggio 1.2.
   NOTA: In questa fase, l'ordine di aggiunta dei reagenti è importante.
4. Eseguire la reazione di coniugazione durante la notte a 15 °C con una rotazione delicata. Queste condizioni lievi impediscono la denaturazione delle proteine.
5. Filtrare la soluzione con il coniugato utilizzando un filtro da 0,2 μm per rimuovere potenziali precipitati.
6. Eseguire SDS-PAGE per analizzare l'efficienza della reazione. Utilizzare gel di separazione al 10%, marcatore proteico da 10 a 250 kDa e analizzare le bande tra 35 e 50 kDa (Figura 2).
   NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa e la miscela di reazione può essere conservata a 4 °C per la conservazione a breve termine o a -80 °C per la conservazione a lungo termine. Tuttavia, il congelamento e lo scongelamento possono causare ulteriori precipitazioni e ridurre le rese di purificazione dei coniugati.
7. Caricare la miscela di reazione su una colonna con perle coniugate con proteina A e lavare via l'eccesso di MMAE con il tampone di lavaggio 1 contenente 300 mM di NaCl, 18 mM di NaH₂PO₄, 33 mM, Na₂HPO₄, 0,1% Tween 20, 2 mM EDTA pH 7,4. Lavare quindi la colonna utilizzando il tampone di lavaggio 2 con 650 mM di NaCl, 18 mM di NaH₂PO₄, 33 mM di Na₂HPO₄, pH 7,4.
   NOTA: Attraverso l'interazione selettiva della regione Fc del coniugato con la proteina A sulle perline, il coniugato viene catturato sulla colonna, mentre l'MMAE non reagito viene lavato via. Questo passaggio è necessario per ottenere un coniugato altamente puro.
8. Eluire il coniugato Fc-MMAE dalla colonna con provette da 0,1 M di citrato di sodio pH da 3,5 a 1,5 mL contenenti 1 M di Tris pH 9,0 (da 1 mL di proteine a 200 μL di 1 M Tris pH 9,0).
9. Dissalare Fc-MMAE a PBS pH 7,4 utilizzando una colonna con resina Sephadex G-25. Questa fase impedisce la denaturazione del coniugato e consente di utilizzare il coniugato in test in vitro e in vivo.
   NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
10. Eseguire SDS-PAGE (10%) per analizzare il coniugato finale Fc-MMAE. Utilizzare gel di separazione al 10%, marcatore proteico da 10 a 250 kDa e analizzare le bande tra 35 e 50 kDa (Figura 2).

2. Coniugazione di FGF2 ingegnerizzato

1. Coniugazione di GGGG-MTX alla sequenza LPETGG C-terminale di FGF2 ingegnerizzato tramite legatura mediata dalla sortasi A
   1. Trasferire FGF2 ingegnerizzato purificato contenente la sequenza N-terminale KCKSGG e C-terminale LPETGG (utilizzata in questa fase per la coniugazione) al tampone di reazione della sortasi A (25 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 5 mM CaCl₂) utilizzando una colonna con resina G-25. Regolare la concentrazione proteica a 1 μM con il tampone di reazione della sortasi A.
   2. Aggiungere il peptide GGGG-MTX disciolto in DMAc, direttamente alla soluzione proteica fino a una concentrazione finale di 100 μM.
   3. Aggiungere la sortasi A a una concentrazione finale di 0,1 μM e incubare per 12 ore a 15 °C con una leggera rotazione. Le concentrazioni dei reagenti da utilizzare nelle fasi 2.1.1-2.1.3 sono in gran parte determinate dalla resa di coniugato da ottenere e dalle caratteristiche biochimiche della proteina bersaglio (efficacia della purificazione delle proteine, sua solubilità e stabilità). Per un'efficace reazione della sortasi A, utilizzare un punto di partenza da dieci a cento volte più basso di una concentrazione di sortasi A rispetto alla proteina bersaglio contenente LPETGG e una concentrazione di GGGG-MTX 100 volte superiore rispetto alla proteina marcata con LPETGG.
   4. Caricare la miscela di reazione su una colonna di eparina sefarosio.
   5. Lavare via le molecole non reagite con 25 mM HEPES pH 7.4.
   6. Eluire il prodotto della reazione (FGF2. MTX) con 25 mM di HEPES, pH 7,4 con 2 M di NaCl.
      NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
   7. Analizza l'efficienza della coniugazione utilizzando SDS-PAGE. Utilizzare gel di separazione al 15%, marcatore proteico da 10 a 250 kDa e analizzare le bande tra 15 e 25 kDa (Figura 3).
2. Coniugazione di MMAE alla sequenza N-terminale KCKSGG di FGF2 ingegnerizzato tramite reazione maleimide-tiolo
   1. Desalinare FGF2 ingegnerizzato contenente la sequenza N-terminale KCKSGG e C-terminale LPETGG nel tampone di reazione (25 mM HEPES pH 7,0, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 10 mM metionina, 0,1 mM EDTA) utilizzando una colonna con resina Sephadex G-25. Regolare la concentrazione di proteine a 25 μM con il tampone di reazione.
   2. Sciogliere MMAE in DMAc per preparare una soluzione madre da 40 mM.
   3. Al nuovo tubo di reazione aggiungere il primo eccesso molare di MMAE quattro volte rispetto ai gruppi proteina -SH. Quindi aggiungere il doppio volume di tampone PBS in relazione al volume della proteina FGF2. Infine aggiungere la proteina FGF2.
      NOTA: In questa fase l'ordine di aggiunta dei reagenti è importante.
   4. Eseguire la reazione per 1 ora a 20 °C con una leggera rotazione.
   5. Caricare la miscela di reazione su una colonna di carbossimetile (CM)-sefarosio e lavare via l'eccesso di agente citotossico non coniugato con 25 mM di HEPES pH 7,4. Queste condizioni lievi impediscono la denaturazione delle proteine.
   6. Eluire l'MMAE. FGF2 coniugato dalla colonna con 25 mM di HEPES pH 7,4 con 0,5 M di NaCl.
      NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
   7. Analizza l'efficienza della coniugazione utilizzando SDS-PAGE. Utilizzare gel di separazione al 15%, marcatore proteico da 10 a 250 kDa e analizzare le bande tra 15 e 25 kDa (Figura 3).
3. Preparazione di una doppia testata coniugata di FGF2 ingegnerizzato utilizzando una combinazione di chimica maleimmide-tiolo e legatura mediata da sortasi A
   NOTA: Per la generazione di coniugati a doppia testata di FGF2 ingegnerizzati, i passaggi 2.1 e 2.2 sono combinati. Prima MMAE. Il coniugato FGF2 è prodotto tramite la chimica maleimmide-tiolo (passaggio 2.2) e utilizzato per l'attacco di GGGG-MTX con sortasi A al tag LPETGG C terminale di MMAE. FGF2 (passaggio 2.1). Inoltre, è possibile anche una procedura inversa (prima coniugazione mediata dalla sortasi A, poi reazione maleimide-tiolo).
   1. Utilizzare i passaggi 2.2.1-2.2.7 per la preparazione di MMAE monosostituiti. Coniugato FGF2.
   2. Sostituire il tampone con il tampone di reazione sortasi A (25 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 5 mM CaCl₂) utilizzando una colonna con resina Sephadex G-25.
   3. Continuare come descritto nei punti 2.1.2-2.1.7.

I protocolli presentati descrivono due distinte strategie per la coniugazione di diversi farmaci citotossici in proteine di interesse. Inoltre, viene mostrata una combinazione di strategie individuali che consente di generare coniugati citotossici a doppia testata in modo sito-specifico.

Come mostrato sui gel SDS-PAGE in Figura 2 (corsia 2 vs. 3), la reazione maleimmide-tiolo consente di raggiungere quasi il 100% di efficienza per...

A causa dell'elevato interesse per la progettazione di terapie selettive contro diversi tipi di cancro, vi è un urgente bisogno di strategie che consentano l'attaccamento sito-specifico di carichi distinti alle proteine bersaglio. La modifica sito-specifica delle proteine bersaglio è fondamentale in quanto garantisce l'omogeneità dei coniugati bioattivi sviluppati, un prerequisito per le terapie moderne. Esistono diversi metodi, sia chimici che enzimatici, che consentono l'attacco sit...

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo lavoro è stato sostenuto dal First TEAM e dai programmi di reintegrazione della Fondazione per la scienza polacca (POIR.04.04.00-00-43B2/17-00; POIR.04.04.00-00-5E53/18-00) cofinanziato dall'Unione Europea nell'ambito del Fondo Europeo di Sviluppo Regionale, assegnato a L.O e A.S. M.Z il lavoro è stato sostenuto da OPUS (2018/31/B/NZ3/01656) e Sonata Bis (2015/18/E/NZ3/00501) del National Science Centre. Il lavoro di A.S.W è stato sostenuto dalla sovvenzione Miniatura del National Science Centre (2019/03/X/NZ1/01439).