Questa ricerca mira a progettare e fornire editor epigenomici nelle cellule umane. Lo facciamo fondendo gli effettori della cromatina con dCas9 per una modulazione genica mirata senza introdurre rotture tossiche del DNA. Le sfide ruotano attorno alla fornitura efficiente di editor di epigenomi nelle cellule e alla garanzia di una precisa specificità del bersaglio.
Inoltre, rimane difficile ottenere una repressione genica stabile o transitoria. Questo protocollo evita qualsiasi meccanismo di scissione, riducendo la tossicità e l'instabilità genomica. Descrive due metodi di somministrazione per la modulazione controllata dell'espressione genica senza alterazioni permanenti della sequenza del DNA.
Questi metodi possono essere applicati per testare diverse fusioni con dCas9 e per studiare la biologia di base della cromatina. Gli attuali editor di epigenomi possono essere utilizzati per screening dell'intero genoma e hanno il potenziale per applicazioni terapeutiche. Per iniziare, mantenere le cellule K-562 in un pallone con terreno RPMI integrato con il 10% di FBS e penicillina streptomicina glutammina.
Il giorno della nucleofezione, scongelare l'mRNA di CRISPRoff in una provetta da microcentrifuga sterile priva di RNAsi e agitare delicatamente la provetta. Utilizzare due microgrammi di mRNA per 2,0 volte 10 alla potenza di cinque cellule in ciascun pozzetto di una provetta per PCR posta sul ghiaccio. Preparare la soluzione di nucleofenzione secondo le istruzioni del produttore e lasciarla riscaldare a temperatura ambiente per 15 minuti prima della nucleofezione.
Raccogliete e contate le cellule K-562 utilizzando un contatore di cellule automatizzato con colorazione viva/morta in blu di tripano. Per la nucleofeczione in una cuvetta a strisce, aliquotare circa due volte 10 alla potenza di cinque cellule per campione in una provetta sterile per microcentrifuga. Centrifugare le celle a 500 G per cinque minuti a temperatura ambiente.
Scartare il surnatante. Aggiungere il PBS a temperatura ambiente al pellet della cella e centrifugare nuovamente a 500 G per cinque minuti. Scartare il surnatante.
Risospendere le cellule nella quantità appropriata di soluzione di nucleofettore. Aggiungere il volume calcolato di soluzione cellulare a due microgrammi di soluzione CRISPRoff. Trasferire la cellula e la soluzione di mRNA in una cuvetta, assicurandosi che non si formino bolle, poiché ciò potrebbe compromettere l'efficienza della nucleofezione.
Picchiettare delicatamente la nucleocuvetta per sistemare le cellule sul fondo. Successivamente, nucleotecare le cellule utilizzando il sistema 4D-Nucleofector con il codice di impulsi appropriato. Potrebbe essere necessario ottimizzare il codice dell'impulso per diversi tipi di cellule.
Consultare il produttore se è necessaria un'ulteriore ottimizzazione. Dopo la nucleofezione, aggiungere 80 microlitri di terreno RPMI a ciascun pozzetto utilizzato della Nucleocuvette. Trasferire la sospensione cellulare in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente 400 microlitri di terreno RPMI preriscaldato.
Carica tutti i file standard di citometria a flusso, o FSC, in FlowJo trascinandoli e rilasciandoli in un nuovo foglio di lavoro. Clicca su tutti i campioni per iniziare a realizzare cancelli. Aprire un esempio di controllo facendo doppio clic sul file corrispondente.
Crea un gate per le celle vive in un grafico FSC-A rispetto a SSC-A utilizzando lo strumento poligono. Una scheda di celle attive dovrebbe ora apparire sotto il nome del campione nell'elenco di tutti i campioni. Fare clic con il pulsante destro del mouse su questo cancello e selezionare Copia analisi per raggruppare per applicare questo punto di accesso a tutti i campioni.
Fare doppio clic sul cancello delle celle vive per selezionare solo le celle vive. Cambia gli assi in FSC-H anziché FSC-A. Disegna un poligono per il cancello solo per singole celle.
Per eseguire il gate per le celle che esprimono la guida, fare doppio clic sul gate a cella singola per selezionare solo le celle singole. Cambia gli assi in FSC-A rispetto a PE-CF594-A. Disegna un cancello per guidare le celle che esprimono usando lo strumento poligono.
Fare doppio clic sull'ultima porta di configurazione, singole celle o celle che esprimono la guida. Se si esegue una trasfezione plasmidica in cui l'editor dell'epigenoma codifica per una proteina fluorescente blu, o fusione BFP, creare un gate per le cellule BFP positive per i campioni del secondo giorno. Crea un gate per l'espressione del reporter tracciando BB515-A rispetto a FSC-A per identificare e controllare le cellule GFP negative.
Quindi, applicare questo gate a tutti i campioni. Dopo aver completato la configurazione del cancello, fare clic su editor di tabelle nel pannello superiore. Trascinare le popolazioni per l'analisi, ad esempio le cellule BFP positive e GFP negative.
Nel pannello dell'editor di tabelle, fai clic su Crea tabella e copia i dati prima di incollarli in un foglio di calcolo per i calcoli di normalizzazione. Ora, sottrai il numero di cellule reporter negative, come GFP negative, nel campione di controllo da tutti gli altri campioni. Questo corregge il silenziamento del reporter.
Se si esegue una trasfezione, dividere ogni valore per la percentuale di cellule BFP positive misurata il secondo giorno per normalizzare tutti i valori alla percentuale di celle BFP positive, quindi moltiplicare per 100. Questo produce il valore normalizzato dell'efficienza di trasfezione delle celle modificate. Traccia i dati per creare grafici a linee che rappresentano i cambiamenti nel corso del tempo di modifica dell'epigenoma.
Per tutti gli esperimenti di editing dell'epigenoma, si raccomanda un controllo guida non mirato per confermare che i cambiamenti nei loci bersaglio derivino dall'editing dell'epigenoma piuttosto che dalla sovraespressione o dal legame non specifico dell'editor dell'epigenoma. È importante considerare il metodo di consegna dell'editor di epigenoma. La trasfezione del DNA plasmidico o la nucleofecazione dell'mRNA possono essere preferite dato il contesto sperimentale.
La considerazione del tipo di cellula, della tempistica sperimentale, della lettura della consegna e dell'efficacia della somministrazione può influire sul metodo di somministrazione preferito. Le cellule che esprimono alti livelli di BFP a due giorni dalla trasfezione indicano il successo della trasfezione con l'editor epigenomico. Sia CRISPRoff che CRISPRi mostrano un picco di silenziamento del gene al quinto giorno dopo la trasfezione.
Negli esperimenti di nucleofecazione dell'mRNA, si osserva un forte silenziamento genico entro il terzo giorno dopo la nucleofecazione con CRISPRoff.
