L'analisi cellulare in tempo reale xCELLigence consente di monitorare quantitativamente l'uccisione delle cellule tumorali da parte delle cellule immunitarie in condizioni esenti da etichette e nel corso di più giorni. Questo sistema fornisce un ciclo di tempo completo dell'uccisione di cellule tumorali bersaglio che consente lo screening simultaneo di un gran numero di costrutti, tipi di cellule effettori o terapie di combinazione a bassi rapporti tra effettore e bersaglio. Inizia seminando 1,5 volte 10 alle sette cellule HEK293FT nel mezzo di coltura DMEM in un piatto di coltura cellulare da 150 millilitri per un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica con umidità.
La mattina seguente, mescolare 2,5 millilitri di soluzione di diluizione di trasfezione integrati con cinque microgrammi di DNA plasmide vettoriale lentivirale e 22,5 microgrammi di miscela di imballaggi lentivirali con 82,5 microlitri di reagente di trasfezione in 2,5 millilitri di soluzione di diluizione di trasfezione. Dopo un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente, trasferire la goccia di reazione saggia nel piatto delle cellule HEK293FT e riportare le cellule nell'incubatrice per una seconda incubazione notturna. La mattina seguente, sostituire il supernatante con 19 millilitri di mezzo di coltura DMEM fresco e riportare le cellule nell'incubatrice durante la notte.
Raccogliere il supernatante in un singolo tubo conico da 50 millilitri per quattro gradi Celsius di stoccaggio per i due giorni successivi prima di sedimentare il lentivirus mediante centrifugazione la seconda mattina al fine di rimuovere eventuali cellule o detriti dalla soluzione. Trasferire tutto tranne circa un millilitro del lentivirus contenente supernatante in un tubo di centrifuga ultra chiaro per l'ultracentrifugazione. Dopo l'ultracentrifugazione, aspirare accuratamente il virus residuo contenente supernatante, aggiungere delicatamente 100 microlitri di DMEM al pellet e posizionare il tubo sul ghiaccio per 15 minuti.
Alla fine dell'incubazione, mescolare delicatamente la soluzione e aliquotare la soluzione di lentivirus in tubi sterili prerilusi per la conservazione a meno 80 gradi Celsius. Quindi determinare il formicolio del lentivirus mediante RT-PCR quantitativo secondo le istruzioni del produttore. Per la generazione e l'espansione delle cellule CAR-T, attivare da una a due volte 10 alle sei cellule mononucleari del sangue periferico in un millilitro di mezzo cellulare CAR-T con un numero uguale di microperline rivestite cd3/CD28 in un pozzo di una piastra da 24 pozzetti nell'incubatore di coltura cellulare per 24 ore.
Le due mattine seguenti, mescolare un microlitro di agente potenziatore di trasduzione con le cellule seguito dall'aggiunta di lentivirus a una molteplicità di infezione da cinque a uno. Monitorare la crescita della cellula T ogni due o tre giorni aggiungendo un mezzo cellulare CAR-T fresco, se necessario, per mantenere le cellule a una o due volte 10 alle sei cellule per concentrazione di millilitro. Per rilevare l'espressione CAR della cellula T per citometria a flusso, trasferire tre volte 10 alla quinta cella CAR e T non trasdotto in singoli tubi microcentrifugo da 1,5 millilitri.
Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e resuspendare i pellet in 200 microlitri di tampone FACS integrati con l'1% di siero umano. Dividere ogni campione di cellule in 100 aliquote di microlitri in singoli tubi FACS in polistirolo a cinque millilitri su ghiaccio. Dopo cinque minuti, aggiungere un microlitro di frammenti di FAB2 biotinylati di FAB2 anti-topo di capra a un tubo di ogni tipo di cellula e due microlitri di anticorpo anti-tag etichettato PE all'altro tubo di ogni tipo di cella con miscelazione accurata.
Dopo 30 minuti sul ghiaccio, lavare le cellule con tre millilitri di tampone FACS fresco e dopo aver centrifugato decantare i supernaganti. Rimescolare il pellet nel supernatante rimanente e aggiungere due microlitri di anti-CD3 APC e due microlitri di 7-AAD ad ogni tubo. Aggiungere un microlitro di Streptavidin con etichetta PE con una breve miscelazione al tubo macchiato con anticorpo anti-FAB2 e incubare tutti i tubi sul ghiaccio per 30 minuti.
Alla fine dell'incubazione, analizzare le cellule per citometria del flusso secondo protocolli standard che gating le cellule T per dispersione in avanti rispetto alla dispersione laterale e CD3 contro 7-AAD espressione. Per un saggio di potenza della citolisi in tempo reale, aggiungere da 50 a 100 microlitri di mezzo di coltura cellulare target a ogni pozzo di una piastra elettronica e misurare l'impedenza di fondo in uno strumento di analizzatore di celle. Rilevare le cellule tumorali bersaglio dalla piastra di coltura usando la tripside.
Lavare le cellule in 15 millilitri di mezzo di coltura fresco e centrifuga. Resuspend il pellet di cellule tumorali in cinque millilitri di mezzo fresco per il conteggio e regolare la densità cellulare alla concentrazione cellulare target appropriata. Aggiungere le cellule al numero appropriato di pozzi e lasciare la piastra elettronica per 30 minuti a temperatura ambiente per consentire alle cellule di depositarsi uniformemente sul fondo dei pozzi.
Al termine del periodo di equilibrazione, posizionare la piastra nell'analizzatore di celle in tempo reale e iniziare automaticamente la misurazione dell'impedenza ogni 15 minuti durante la notte. L'adesione e la proliferazione delle cellule bersaglio possono essere monitorate in tempo reale. La mattina seguente, diluire l'effettore CAR e controllare le celle T alla concentrazione appropriata in singoli tubi e rimuovere da 50 a 100 microlitri da ogni pozzo della piastra elettronica in modo che il volume finale in ogni pozzo sia di 100 microlitri.
Successivamente, seminare l'effettore e controllare le cellule T nei pozzi appropriati al rapporto tra efficacere appropriato e bersaglio in 100 microlitri di mezzo per pozzo. Quindi equilibrare la piastra elettronica per 30 minuti a temperatura ambiente prima di restituire la piastra al sistema di analizzatore di celle. Per misurare l'efficacia dell'uccisione mediata della cellula T delle cellule tumorali bersaglio, monitorare l'uccisione mediata car-t per 96 ore.
Circa il 50% delle cellule CAR-T macchiate positive per anticorpi a frammento variabile a catena singola che indicano l'espressione di CAR in circa il 50% delle cellule T. In questo esperimento rappresentativo, per tutti i gruppi è stato utilizzato un rapporto tra effettore e bersaglio da 10 a uno. Solo le cellule Raji e le cellule Raji trattate con cellule CD22-CAR T mostravano uccisioni significative rispetto ai soli gruppi cellulari T di controllo e Mock CAR-T.
In questo esperimento, solo le cellule CD47-CAR-T furono efficaci nell'uccidere le cellule tumorali pancreatiche. Inoltre, il segnale di impedenza proveniente dalle sole cellule CD47-CAR-T era solo leggermente superiore al segnale dell'indice cellulare misurato nei pozzi di media da soli indicando che il segnale di impedenza risultante da cellule di sospensione come le cellule CAR-T è minimo e non contribuisce al segnale di impedenza generale quando le cellule CAR-T vengono aggiunte alle cellule tumorali bersaglio. In particolare, il dominio co-stimolante GITR è stato osservato per essere più efficace nel migliorare l'uccisione delle cellule CAR-T contro le cellule bersaglio positive del recettore del fattore di crescita epiteliale rispetto ai costrutti CAR originali senza il dominio GITR.
Il mezzo proveniente dai pozzi della piastra elettronica può essere raccolto per analizzare il profilo della citochina nei punti di tempo durante o dopo il saggio in base alle esigenze dell'esperimento. Nel complesso, xCELLigence ha migliorato l'efficienza della valutazione della potenza di diverse immunoterapie che vanno da engager di cellule T bi-specifiche e virus oncolitici agli inibitori del punto di controllo immunitario nelle terapie combinato.
