xCELLigenceリアルタイム細胞解析により、細胞の殺死を、ラベルフリー条件下で、そして数日間にわたって定量的に監視することができます。このシステムは、多数の構築物、エフェクター細胞タイプ、または低エフェクター対ターゲット比での併用療法の同時スクリーニングを可能にする、標的癌細胞の殺死の完全な時間経過を提供する。摂氏37度で一晩培養し、湿度で5%の二酸化炭素を培養するために、DMEM培地中の7つのHEK293FT細胞に1.5倍の10を播種し始めます。
翌朝、レンチウイルスベクタープラスミドDNAの5マイクログラムとレンチウイルス包装ミックスの22.5マイクログラムを2.5ミリリットルのトランスフェクション希釈液に82.5マイクロリットルのトランスフェクション試薬と混合して2.5ミリリットルのトランスフェクション希釈液を混合します。室温で15分間のインキュベーションの後、HEK293FT細胞の皿に反応液を移動させ、細胞をインキュベーターに戻して2回目の一晩インキュベーションを行う。翌朝、上清を19ミリリットルの新鮮なDMEM培養培地に置き換え、細胞を一晩インキュベーターに戻す。
溶液から細胞や破片を除去するために、2日目の朝に遠心分離によってレンチウイルスを沈降させる前に、次の2日間、摂氏4度貯蔵のための単一の50ミリリットルの円錐管に上澄み物を収集します。上清を含むレンチウイルスの約1ミリリットルを除くすべてを超遠心分離用超透明遠心管に移す。超遠心分離後、上清を含む残留ウイルスを慎重に吸引し、ペレットに100マイクロリットルのDMEMを静かに加え、チューブを氷の上に15分間置きます。
インキュベーションの最後に、レンチウイルス溶液を穏やかに混ぜ合わせて、マイナス80°Cで貯蔵するための予冷無菌チューブにします。次に、メーカーの指示に従って定量的RT-PCRによりレンチウイルスの潮量を決定します。CAR-T細胞の生成および拡張のために、細胞培養インキュベーター内の24ウェルプレートの1つのウェルに同数のCD3/CD28被覆マイクロビーズを有するCAR-T細胞培地の1ミリリットルの6つの末梢血単核細胞に1〜2回10回活性化する。
次の2つの朝、1マイクロリットルのトランスダクションエンハンサー剤を細胞と混合し、続いてレンチウイルスを5対1の感染の多重性で添加する。T細胞増殖を2~3日ごとに監視し、必要に応じて新鮮なCAR-T細胞培地を添加し、1ミリリットル当たり6個の細胞に1〜2倍10の細胞を維持する。フローサイトメトリーによるT細胞CAR発現を検出するには、3回10回を5番目のCARおよび非トランスデューセT細胞を個々の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管に移す。
遠心分離によって細胞を収集し、1%のヒト血清を補充したFACSバッファーの200マイクロリットルでペレットを再懸濁する。各細胞サンプルを氷上の個々の5ミリリットルポリスチレンFACSチューブの100マイクロリットルアリコートに分割します。5分後、ヤギの抗マウスFAB2の1マイクロリットルを各細胞タイプの1チューブに加え、PE標識抗タグ抗体の2マイクロリットルを各細胞タイプの他のチューブに完全に混合して追加します。
氷の上で30分後、新鮮なFACSバッファーの3ミリリットルで細胞を洗浄し、遠心分離後に上清をデカントします。残りの上清のペレットを再懸濁し、APC抗CD3の2マイクロリットルと7-AADの2マイクロリットルを各チューブに加えます。抗FAB2抗体で染色されたチューブに短い混合でPE標識ストレプトアビジンの1マイクロリットルを追加し、30分間氷上のすべてのチューブをインキュベートします。
インキュベーションの終了時に、T細胞を前方散乱対側散乱およびCD3対7-AAD発現で測定する標準的なプロトコルに従って、フローサイトメトリーによって細胞を解析する。リアルタイムの細胞増殖力測定の場合、対象細胞培養培地の50~100マイクロリットルをeプレートのウェルに加え、細胞分析装置のバックグラウンドインピーダンスを測定します。トリプシンを用いて培養プレートから標的癌細胞を検出する。
新鮮な培養培地と遠心分離機の15ミリリットルで細胞を洗浄します。がん細胞ペレットを計数用の新鮮培地5ミリリットルで再懸濁し、適切な標的細胞濃度に細胞密度を調整する。適切な数のウェルに細胞を加え、室温で30分間電子プレートを残して、細胞がウェルの底に均等に落ち着くようにします。
平衡期間の終わりに、リアルタイムセルアナライザにプレートを置き、インピーダンスの測定を一晩15分ごとに自動的に開始します。標的細胞の接着および増殖をリアルタイムで追跡することができる。翌朝、エフェクターCARを希釈し、個々のチューブ内の適切な濃度にT細胞を制御し、各ウェルの最終体積が100マイクロリットルになるように、eプレートの各ウェルから50〜100マイクロリットルを除去します。
次に、エフェクターをシードし、適切なエフェクターで適切なウェルでT細胞を制御し、1ウェル当たり培地の100マイクロリットルで標的比を標的とする。次いで、セル分析装置にプレートを戻す前に、室温で30分間Eプレートを平衡化します。標的癌細胞のT細胞媒介性殺傷の有効性を測定するために、CAR-T媒介性殺傷を96時間監視する。
CAR-T細胞の約50%がT細胞の約50%におけるCARの発現を示す抗単鎖可変フラグメント抗体に対して陽性に染色された。本代表的実験では、全ての群に対して10~1つのエフェクター対ターゲット比を用いた。ラジ細胞のみおよびCD22-CAR T細胞処理ラジ細胞は、コントロールT細胞のみおよびMock CAR-T細胞群と比較して有意な殺傷を示した。
今回の実験では、CD47-CAR-T細胞のみが膵臓癌細胞の死滅に有効であった。また、CD47-CAR-T細胞単独からのインピーダンス信号は、CAR-T細胞などの懸濁細胞から生じるインピーダンス信号が最小であり、CAR-T細胞が標的癌細胞に添加された場合の全体的なインピーダンスシグナルに寄与しないことを示す、培地単独ウェルで測定された細胞指標信号をわずかに上回っただけであった。特に、GITR共刺激ドメインは、GITRドメインを含まない元のCAR構築物と比較して、上皮成長因子受容体陽性標的細胞に対するCAR-T細胞の死滅を増強する上でより効果的であることが観察された。
電子プレートウェルから培地を収集し、実験のニーズに応じて、アッセイ中または後のいずれかの時点でサイトカインプロファイルを分析することができます。全体として、xCELLigenceは、バイ特異的T細胞エンゲージおよびオンコ分解性ウイルスから併用療法における免疫チェックポイント阻害剤に至るまで、多様な免疫療法の効力を評価する効率を向上させました。
