Name: a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays
Uploaded: 2017-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays at JoVE.com

Vorremmo ringraziare CSIC per il sostegno finanziario dato a questo progetto, a Mariana Di Doménico per la sua assistenza tecnica con microscopia confocale; per José Leonardo Báez per correzioni suo manoscritto; a Luciano Correa per la sua dedizione alla creazione di video; a Natalia Rosano per prestando la sua voce per il video e Bloomington Drosophila Stock Center per fornire le scorte utilizzate in questo studio. La PA1 monoclonale anti-Ptc sviluppato da Isabel Guerrero è stato ottenuto da inerente allo sviluppo studi Hybridoma Bank (DSHB) sotto l'egida del NICHD e gestito dal dipartimento di scienze biologiche, The University of Iowa, Iowa City, IA 52242.

1 ° giorno
1. raccolta e coltura pupe.
<ol>
	<li>0 h dopo formazione pupario (APF) o membranose usando un pennello bagnato dai flaconcini colte e adagiatele in new fiale a quasi completa il periodo di sviluppo (Vedi 2.1 e 2.2). 
	Nota: Una popolazione sana di mosche dovrebbe essere mantenuta utilizzando protocolli standard di coltura. Dopo tre o quattro giorni in cui le uova vengono deposte, gli adulti possono essere rimossi dai flaconcini per consentire uno sviluppo ottimale degli individui. Sono mantenute a temperatura costante fino a quando le larve instar terza avviare impupamento. La transizione larvale/pupa è contrassegnata dalla formazione di prepupa considerato il h 0 APF. La prepupa è una immobile larva bianca che ha un oblungo, di forma rotonda con sporgenti spiracoli anteriori.</li>
</ol>
2 ° giorno
2. il trasferimento, la dissezione e la fissazione.
<ol>
	<li>Trasferimento alle pupe (2 h prima che il tempo di sviluppo completi) con un pennello, il vetrino da microscopio con nastro biadesivo aderito ad esso. Posizionare le pupe per formare che una riga con i lati dorsale alto e cefalica finisce rivolte nella stessa direzione.</li>
	<li>Restituire il vetrino a temperatura costante e consentire le pupe completare il tempo di sviluppo appropriato (cioè 24-30 h APF). 
	Nota: Il vetrino da microscopio con il nastro biadesivo sarà una piattaforma di dissezione transitoria per rimuovere il caso pupal (Vedi sotto). Il lasso di tempo sul vetrino da microscopio (fuori il flaconcino) aiuta ad per asciugare il caso pupal rendendolo facilmente frangibile con il forcipe.</li>
	<li>Rimuovere l'opercolo dal caso pupal usando il forcipe.</li>
	<li>Rompere il caso con il forcipe (come mostrato nel video) facendo una linea lungo il lato della pupa all'estremità caudale di esso. Con la giusta illuminazione è possibile rilevare la forma interna della pupa rendendo evidente uno spazio appena sopra la cerniera dell'ala pupal. Questo spazio funge da guida per eseguire l'apertura senza danneggiare la pupa.</li>
	<li>Rimuovere le parti del caso, li raccolga fino al confine aperto e li trasportano verso il lato opposto, dove il nastro biadesivo li terrà. Alla fine della dissezione le pupe sarà quasi "nude", solo un piccolo pezzo del caso sarà che coprono la punta posteriore. Nota: Lo scopo di lasciare una piccola quantità di caso sull'estremità caudale superiore è quello di garantire un regolare rilascio dalla custodia il vetrino con il nastro biadesivo. Ragionamento alla base di questa azione è perché se si rimuove troppo del caso si notevolmente rischia di danneggiare la pupa. D'altra parte se si rimuove troppo poco, la pupa non facilmente verrà gratuita del caso.</li>
	<li>Spingere verso il basso (con forcipe) il resto del caso. Questo movimento sarà sollevare l'estremità anteriore della pupa, consentendo sia la testa e il torace a rimanere in una posizione preferenziale di aderire e di essere trasferiti nel passaggio successivo.</li>
	<li>Prendere una nuova diapositiva con nastro biadesivo e invertire la pupa o una riga di pupe. Si consiglia di eseguire questo approccio osservando i movimenti con l'aiuto dello stereomicroscopio per prevenire rotture delle pupe.</li>
	<li>Premere leggermente per far le pupe attacchi al nastro e far scorrere delicatamente il vetrino al fine di rimuovere le pupe dal resto dei casi. Invertire il vetrino da microscopio: le pupe saranno bloccate dal lato dorsale a livello della loro testa / zona del torace.</li>
	<li>Coprire tutte le pupe nude con paraformaldeide al 4% e attendere 10 min. Nella nostra esperienza, questo lasso di tempo con il fissativo aiuta a cambiare la consistenza della cuticola rendendola costante, meno appiccicoso e facile da gestire. 
	Nota: Per eseguire l'estrazione di acido ribonucleico (RNA), paraformaldeide sostituto per tampone fosfato salino (PBS) realizzati con RNAsi libera acqua e rimuovere le ali pupale effettuando un taglio (con l'ausilio di forbici) vicino al punto di cerniera di ciascuna appendice. Usando il forcipe, trasferire l'ala pupal ad un tubo del microcentrifuge con 1 mL di reagente fenolo e tiocianato di guanidinium. Dopo aver raccolto un totale di 50-80 Ali, conservare il tubo del microcentrifuge a-80 ° C fino a eseguire il RNA estrazione10,11.</li>
	<li>Praticare una piccola incisione alla regione cerniera dell'ala o vicino ad esso. Consentire il fissativo raggiungere l'epitelio dell'ala. Utilizzando una pipetta (p200) a filo fissativa sopra l'ala. Quando lo svuotamento di sostituire i contaminati fissarsi con nuovi. Dopo il lavaggio, mantenere ala in fissativo per 5 min. 
	Nota: Anche se questa manovra aiuta a sgombrare la maggior parte del tessuto contaminante, alcuni emociti e goccioline di grasso possono rimanere intrappolate tra gli strati epiteliali dorsali e ventrali dell'ala (Vedi Figura 1A).</li>
	<li>Strappare con la pinzetta dai confini della cuticola (come mostrato nel video) espandendo il foro e consentire il rilascio dell'epitelio ala dal sac cuticola. Una volta rilasciato il tessuto di ala, lasciarlo nella soluzione di paraformaldeide per completare 30 min di fissazione.</li>
	<li>Trasferire le ali fisse in un uno 4-saldata piatto di plastica riempito con PBST (Triton X-100 0,05%). Archivio durante la notte a 4 ° C.</li>
</ol>
3 ° giorno
3. incubazione primaria dell'anticorpo.
<ol>
	<li>Permeabilize il tessuto incubando le ali pupale in PBST (Triton X-100 0,2%) per 15 min usando una piattaforma oscillante per facilitare un movimento medio liquido dolce. 
	Nota: Fino al montaggio dei campioni, la procedura deve essere eseguita utilizzando una piattaforma a dondolo.</li>
	<li>Bloccare i campioni utilizzando PBSTA (BSA 3%, Triton X-100 0,1%) per 1 h.</li>
	<li>Utilizzare lo stesso buffer per diluire l'anticorpo primario (topo anti-Ptc, 1: 100) e incubare le ali pupale durante la notte a 4 ° C.</li>
</ol>
4 ° giorno
4. incubazione anticorpo secondario.
<ol>
	<li>Lavaggio campioni 4 x 10 min ciascuno con PBST (Triton X-100 0,05%)</li>
	<li>Incubare con anticorpo secondario (ad es., anti-topo coniugato al fluorocromo) diluita a concentrazione appropriata in PBSTA (BSA 3%, Triton X-100 0,1%) a temperatura ambiente al buio, per 2 h. 
	Nota: Se è appropriato, è possibile utilizzare 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e/o falloidina per colorante di contrasto del tessuto. Aggiungi queste sonde con l'anticorpo secondario tenendo conto della lunghezza d'onda di emissione dei fluorocromi per evitare la sovrapposizione dei segnali.</li>
	<li>Lavaggio campioni 4 x 10 min ciascuno con PBST (Triton X-100 0,05%)</li>
</ol>
5. montaggio
<ol>
	<li>Preparare un vetrino inserendo 4 puntini di smalto trasparente sul vetrino da microscopio come se fossero i vertici di un quadrato.</li></ol>Essi saranno i punti dove riposerà i coprioggetti, contribuendo a evitare lo schiacciamento del tessuto.
	<li>Posto 30 µ l di montanti (glicerolo/Tris-HCl 80%) al centro della Piazza dei punti realizzati con smalto senza toccare uno qualsiasi degli angoli (puntini). Prendere una pipetta con una punta gialla ritagliata, caricare alcuni mezzi di montaggio e quindi disegnare in diverse ali pupale.</li>
	<li>Trasferimento pupale Ali al puntino di supporti di montaggio sul vetrino da microscopio. Con l'aiuto di una punta, sviluppa i mezzi di montaggio e affondare le ali pupale per impedire loro di galleggiare. La morfologia del tessuto viene mantenuta se le ali restano piatte quando il vetro di copertura è posto su. Prima di mettere il vetro di copertura, è necessario rimuovere le bolle d'aria.</li>
	<li>Abbassare il coprioggetto sui campioni cercando di evitare la generazione di bolle d'aria. Questo movimento può essere fatto con l'ausilio di pinze.</li>

<ol>
	<li>Serrano, N., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limb+morphogenesis:+connections+between+patterning+and+growth.">Limb morphogenesis: connections between patterning and growth.</a> Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+and+appendage+development+in+Drosophila.">Compartments and appendage development in Drosophila.</a> Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).</li><li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+disc+development+in+the+fly:+the+early+stages.">Wing disc development in the fly: the early stages.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).</li><li>Beira, J. V., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+legacy+of+Drosophila+imaginal+discs.">The legacy of Drosophila imaginal discs.</a> Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).</li><li>De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+vein+pattern+variations+in+insect+wings.">Developmental basis for vein pattern variations in insect wings.</a> Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+vein+patterning+in+Drosophila+and+the+analysis+of+intercellular+signaling.">Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+lines+in+the+Drosophila+wing:+initiation+of+wing+vein+development.">Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).</li><li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing:+The+development+of+the+veins.">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li><li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Bolatto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+distribution+of+Patched-related+protein+in+the+Drosophila+embryo.">Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo.</a> Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).</li><li>Zuniga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+encoding+novel+secreted+and+transmembrane+proteins+are+temporally+and+spatially+regulated+during+Drosophila+melanogaster+embryogenesis.">Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis.</a> BMC Biol. 7, 61 (2009).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il metodo della dissezione descritto in questo video può essere utilizzato per preparare campioni di alta qualità di Drosophila pupale ali dalle fasi differenti di sviluppo per molti tipi di tecniche (ad es., immunofluorescenza, sintesi di cDNA per analisi di PCR, in vitro sviluppo di ala). In termini di questo metodo lo scienziato coinvolto hanno usato 24-30 h APF. Tuttavia, non ci dovrebbe essere nessun ostacolo entro i passi essenziali nella dissezione di pupa più giovane o più anziani....

Ali di Drosophila sono sviluppate dai dischi immaginali ala. La primordiale di questi dischi ala vengono messe da parte durante lo sviluppo embrionale come piccoli gruppi di 20-30 cellule immaginale che invaginano dall'epitelio embrionale. Mentre la larva cresce alla terza fase instar, mitosi si verifica nelle cellule immaginale in specifici momenti caratteristici alzando i suoi numeri (circa 50000 cellule) e formando l'ala disco1,2,3, 4. Come le cellule proliferano, essi moda un epitelio tubulare, risultante in una spirale auto-pieghevole compatta. Durante impupamento, l'epitelio disco telescopi fuori all'ala forma i due strati e le vene longitudinali iniziare come lacune tra di loro, che si verifica due volte durante ala dello sviluppo5,6.
La disposizione delle vene sempre ha un modello identico; la capacità di identificare facilmente ogni alterazione all'interno della formazione di vene rende mutazioni estremamente visibile (ad esempio mancanti o aggiuntivi vene, cambiamenti in vena posizioni, ecc.). Interessante, le variazioni di fenotipo sono solitamente le prove delle mutazioni nei componenti noti o romanzo di vie che sono rilevanti per lo sviluppo dell'ala di segnalazione. Una delle vie che svolge un ruolo nella determinazione della posizione e della manutenzione della vena e intervein territori è il pathway di Hedgehog (Hh)6,7,8.
Data l'importanza dell'ala pupal come sistema modello, sarà importante ottenere campioni di buona qualità per lavorare con. In passato, gli scienziati che hanno pubblicato i protocolli per sezionare Drosophila Ali non hanno dato una guida appropriata per raggiungere campioni realizzabili. Senza la Guida di un ricercatore, uno non può visualizzare chiaramente il processo. In questi approcci alternativi per dissezione la pupa è divisa in due, separando l'ala dal tessuto circostante e ripetutamente lavata per rimuovere i detriti. Questo tipo di approccio sostiene di lasciare l'ala libera di contamina, ma a causa di precedenti esperienze il processo è più lento e c'è una maggiore probabilità di compromettere la struttura delle ali fragili9.
La procedura qui descritta è stata sviluppata dall'esigenza di trovare un metodo veloce ed efficiente per ottenere campioni di pupal ala adatti per rilevare specifiche proteine o trascrizioni utilizzando protocolli immunodetection o analisi di reazione a catena (PCR) della polimerasi. Per illustrare questo, l'espressione e la localizzazione di Patched (Ptc o il recettore canonico del pathway di Hh) viene rilevato in campioni di pupal ala, fornendo un protocollo che include dettagli rilevanti per svolgere con successo la completa procedura.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscope with cool light illumination</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Rocking platform</td><td>Biometra (WT 16)</td><td>042-500</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>StarFrost</td><td>8037/1</td><td></td></tr><tr><td>Cover glasses (24 x 32 mm)</td><td>Deltalab</td><td>D102432</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Lawton</td><td>63-1400</td><td></td></tr><tr><td>Multi-well plastic dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>144444</td><td></td></tr><tr><td>p100 or p200 pipette</td><td>Finnpipette (Labsystems)</td><td>9400130</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS (Dulbecco)</td><td>Gibco</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Bio Basic INC.</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Mallinckrodt</td><td>5092</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>497</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Ambion</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>DEPC treated water</td><td>MO.BIO</td><td>17011-200</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL&lt;br/&gt; (working dilution 1/800)</td><td>Invitrogen</td><td>A11030</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 &amp;mu;g/mL&lt;br/&gt; (working dilution 1/100)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td></td><td>By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI, 1 mg/mL&lt;br/&gt; (working dilution 1/5000)</td><td>Invitrogen</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol&lt;br/&gt; (1/600 working dilution)</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Canton S (fly stock)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays

Lo sviluppo dell'ala in Drosophila melanogaster è un modello ideale per studiare la morfogenesi a livello del tessuto. Queste appendici si sviluppano da un gruppo di cellule che si chiamano dischi immaginali ala formate durante lo sviluppo embrionale. In stadi larvali si sviluppano i dischi immaginali, aumentando il numero delle cellule e formando strutture epiteliali monostrati. All'interno del caso pupal, i dischi immaginali bud fuori e piegare in doppii strati lungo una linea che diventa il futuro margine dell'ala. Durante questo processo, le vene longitudinali primodia provengono vena cellule sulle superfici dorsali e ventrali prospettica dell'ala. Durante la fase di pupa le strisce delle cellule della vena di ogni superficie comunicano al fine di generare tubi stretti; allo stesso tempo, la croce-vene iniziano la loro formazione.
Con l'aiuto di marcatori molecolari appropriati, è possibile identificare gli elementi principali che compongono l'ala durante il suo sviluppo. Per questo motivo, la capacità di rilevare con precisione le trascrizioni o proteine in questa struttura è fondamentale per lo studio della loro abbondanza e localizzazione relazionati al processo di sviluppo dell'ala.
La procedura qui descritta si concentra sulla manipolazione pupale Ali, fornendo istruzioni dettagliate su come sezionare l'ala durante la fase di pupa. La dissezione del tessuto pupal è più difficile da eseguire rispetto alle loro controparti in terzo instar larve. Ecco perché questo approccio è stato sviluppato, per ottenere campioni di alta qualità rapido ed efficiente. Dettagli di come immunostain e Monte questi esempi di ala, per consentire la visualizzazione delle proteine o dei componenti delle cellule, vengono forniti nel protocollo. Con poca esperienza è possibile raccogliere Ali pupal di alta qualità di 8-10 in un breve lasso di tempo.

Il protocollo offre un metodo semplice per ottenere campioni di pupal ala che conservano la morfologia familiare dell'ala. Da queste preparazioni è possibile ottenere gli stack di immagini che potrebbero essere proiettati all'esterno come 2D o 3D, per studiare la distribuzione e/o l'arricchimento di proteine durante la differenziazione dell'ala. Un protocollo simile (vedere la nota in 2.9) consente di raccogliere il campione di grande ala pupale (che coinvolge 50-80 pupal Ali) necessario...

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A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

La capacità di rilevare con precisione le trascrizioni o proteine nei tessuti della drosofila è fondamentale per lo studio della loro abbondanza e localizzazione relazionati al processo di sviluppo. Ecco la descrizione di una procedura semplice per dissecare pupale ali. Queste ali possono essere utilizzate come campioni in diverse tecniche (immunohistochemistry, analisi di PCR, ecc.).

Un metodo rapido ed efficiente per sezionare Pupal ali della drosofila adatto per Immunodetections o analisi di PCR

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

a-rapid-efficient-method-to-dissect-pupal-wings-drosophila-suitable

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

8.0K Views.  Laboratorio de Biología del Desarrollo. La capacità di rilevare con precisione le trascrizioni o proteine nei tessuti della drosofila è fondamentale per lo studio della loro abbondanza e localizzazione relazionati al processo di sviluppo. Ecco la descrizione di una procedura semplice per dissecare pupale ali. Queste ali possono essere utilizzate come campioni in diverse tecniche (immunohistochemistry, analisi di PCR, ecc.).

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Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

Dissezione dei muscoli di volo di Drosophila melanogaster per gli approcci Omics

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Ricerca

Genetica

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualizzazione dei Propriorecettori in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve e pupe

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Neuroscienze

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Dissezione e colorazione delle ovaie Pupal Drosophila

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Biologia dello sviluppo

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and behavioral evolution. Drosophila olfactory tissues house the olfactory receptor neurons (ORNs) that detect volatile chemical cues in addition to hydro- and thermo-sensory neurons. In this protocol, we describe the dissection of developing peripheral olfactory tissue of the adult Drosophila species. We first describe how to stage and age Drosophila larvae, followed by the dissection of the antennal disc from early pupal stages, followed by the dissection of the antennae from mid-pupal stages and adults. We also show methods where preparations can be utilized in molecular techniques, such as the RNA extraction for qRT-PCR, RNAseq, or immunohistochemistry. These methods can also be applied to other Drosophila species after species-specific pupal development times are determined, and respective stages are calculated for appropriate aging.

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Here, we present a protocol to stage and dissect developing olfactory tissue from Drosophila species. The dissected tissue can later be used for molecular analyses, such as quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) or RNA sequencing (RNAseq), as well as in vivo analyses such as immunohistochemistry or in situ hybridization.

Preparare lo sviluppo di tessuto periferico olfattivo per molecolare e l'analisi di Immunohistochemical in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

Dissezione della drosofila Pupal Retina per immunoistochimica, analisi occidentale e isolamento del RNA

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in multicellular organisms. The TGF-&#946; superfamily includes TGF-&#946;, bone morphogenetic protein (BMPs), Activins, Growth and Differentiation Factors, and Nodals. It has long been known that the amount of ligand exposed to cells is important for its effects. It was thought that long-range concentration gradients set up embryonic pattern. However, recently it has become clear that the timing of exposure to these ligands is also important for their downstream transcriptional consequences. A TGF-&#946; superfamily ligand cannot have a developmental consequence until it is released from the cell in which it was produced. Until recently, it was difficult to determine when these ligands were released from cells. Here we show how to measure the release of a Drosophila BMP called Decapentaplegic (Dpp) from the cells of the wing primordium or wing disc. This method could be modified for other systems or signaling ligands.

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The timing of exposure to ligands may impact their developmental consequences. Here we show how to image release of a Drosophila bone morphogenetic protein (BMP) called Dpp from cells of the wing disc.

Imaging Dpp Release da un disco ala Drosophila

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

Drosophila pupa Addome Immunoistochimica

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Biologia

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

Monitoraggio a lungo termine In Vivo della cellula infiammatoria dinamica all'interno della drosofila pupe

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Immunologia e infezioni

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

Dissezione, fissaggio e visualizzazione della Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...

Drosophila Larva Imaginal Disc Dissection: A Method to Observe Developing Epithelia

Source: Morimoto, K. and Tamori, Y. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/55901/" target="_blank">Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia</a>. J. Vis. Exp. (2017).
When staining Drosophila imaginal discs, often a rough dissection is performed where the discs are exposed but remain attached to the body. Once stained, the discs of interest are isolated and mounted. The example protocol demonstrates a procedure for wing imaginal disc dissection and mounting.

drosofila Dissezione del disco immaginale larvale: un metodo per osservare lo sviluppo degli epiteli

Source: Morimoto, K. and Tamori, Y. Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia. J. Vis. Exp. (2017).
When staining Drosophila ...