Name: a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays
Uploaded: 2017-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays at JoVE.com

Wir würden gerne CSIC danken für die finanzielle Unterstützung für dieses Vorhaben, Mariana Di Doménico für ihre technische Hilfe mit der konfokalen Mikroskopie; für José Leonardo Báez für sein Manuskript Korrekturen; an Luciano Correa für sein Engagement für die Erstellung des Videos; für Natalia Rosano für die Kreditvergabe ihre Stimme für das Video und die Bloomington Drosophila Stock Center für die Bereitstellung der Bestände, die in dieser Studie verwendet. Die Apa1 monoklonalen Anti-Ptc entwickelt von Isabel Guerrero war erhalten von Entwicklungsstörungen Studien Hybridoma Bank (DSHB) unter der Schirmherrschaft der NICHD und vom Department of Biological Sciences, The University of Iowa, Iowa City, IA 52242 gepflegt.

Tag1
1. Erhebung und Kultivierung Puppen.
<ol>
	<li>0 h nach Puppenkammer Bildung (APF) oder Prepupae mit einem nassen Pinsel aus kultivierten Fläschchen entfernen und legen Sie sie in neue Fläschchen die Entwicklungszeit fast abgeschlossen (siehe 2.1 und 2.2). 
	Hinweis: Eine gesunde Population von Fliegen mit Kultivierung Standardprotokolle aufzubewahren. Nach drei oder vier Tagen die Eiablage, können die Erwachsenen Fläschchen erlauben eine optimale Entwicklung der Individuen entnommen werden. Sie sind bei einer konstanten Temperatur beibehalten, bis die dritte Instar Larven Verpuppung initiieren. Die Larven/pupal Übergang zeichnet sich durch die Bildung von der Prepupa als 0 h APF. Die Prepupa ist eine immobile weiße Larve, die eine längliche, runde Form mit vorspringenden vorderen Luftlöcher hat.</li>
</ol>
Tag2
2. Übertragung, Dissektion und Fixierung.
<ol>
	<li>Übertragen Sie die Puppen (2 Stunden bevor die Entwicklungszeit ist abschließen) mit einem Pinsel zu den Mikroskop-Objektträger mit doppelseitigem Klebeband befolgt es. Positionieren Sie die Puppen in Form eine Reihe mit dorsalen Seiten auf und cephalic endet mit Blick auf die gleiche Richtung.</li>
	<li>Objektträger auf konstante Temperatur zurück und lassen Sie die Puppen um Entwicklungsstörungen rechtzeitig (d.h. 24-30 h APF) abzuschließen. 
	Hinweis: Die Mikroskop-Objektträger mit doppelseitigem Klebeband werden eine vorübergehende Dissektion Plattform pupal Fall (siehe unten) zu entfernen. Zeitraffer auf dem Objektträger (außerhalb der Durchstechflasche) hilft den pupal Fall macht es mit einer Pinzette leicht zerbrechlich zu trocknen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Kiemendeckel aus der pupal Fall mit Pinzette.</li>
	<li>Brechen den Fall mit der Pinzette (wie im Video gezeigt) machen eine Linie entlang der Seite der Puppe an der kaudalen Ende. Mit der entsprechenden Beleuchtung ist es möglich, die interne Form der Puppe macht einen Raum oberhalb des Scharniers pupal Flügel deutlich zu erkennen. Dieser Raum dient als Leitfaden für die Öffnung durchführen ohne Beschädigung der Puppe.</li>
	<li>Teile der Fall ist, durch die geöffnete Grenze abholen und sie auf die gegenüberliegende Seite, wo sie doppelseitiges Klebeband zu halten wird, zu entfernen. Am Ende der Dissektion werden der Puppen fast "nackt", nur ein kleines Stück des Falles die hintere Spitze bedeckt wird. Hinweis: Das verlassen eine kleine Menge des Falles auf das obere kaudalen Ende dient dazu eine glatte Version aus dem Gehäuse auf der Folie mit doppelseitigem Klebeband. Beweggründe für diese Aktion ist, denn wenn Sie zu viel entfernen der Fall riskieren Sie stark beschädigen die Puppe. Auf der anderen Seite wenn Sie zu wenig entfernen, wird die Puppe nicht leicht der Fall zum Nulltarif.</li>
	<li>Drücken Sie (mit Pinzette) den Rest des Gehäuses. Diese Bewegung löst die vordere Ende die Puppe, so dass der Kopf und die Brust wieder in eine privilegierte Stellung zu halten und im nächsten Schritt übertragen werden.</li>
	<li>Nehmen Sie eine neue Folie mit doppelseitigem Klebeband und auf die Puppe oder Puppen Zeile zu invertieren. Wir empfehlen die Durchführung dieser Ansatz durch die Beobachtung der Bewegungen mit Hilfe des Stereomikroskops, Bruch der Puppen zu verhindern.</li>
	<li>Drücken Sie leicht um zu machen die Puppen auf dem Klebeband kleben und sanft gleiten die Folie um die Puppen aus dem Rest der Fälle zu entfernen. Invertieren der Mikroskop-Objektträger: die Puppen werden an der dorsalen Seite auf der Ebene des Kopfes stecken / Thorax-Bereich.</li>
	<li>Die nackten Puppen mit 4 % Paraformaldehyd abdecken und 10 min warten. Nach unserer Erfahrung hilft dieser Zeitspanne mit dem Fixativ, ändern Sie die Konsistenz der Nagelhaut, so dass es fest, weniger klebrig und leicht zu handhaben. 
	Hinweis: Zum Ausführen der Ribonukleinsäure (RNA) Extraktion Ersatz Paraformaldehyd für Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), die mit RNase freies Wasser und entfernen Sie die pupal Flügel machen einen Schnitt (mit Hilfe der Schere) in der Nähe der Anschlusspunkt der einzelnen Anhängsel. Mit Pinzette, übertragen Sie die pupal Flügel zu einem Microcentrifuge Schlauch mit 1 mL Guanidinium-Thiocyanat und Phenol-Reagenz. Nach dem Sammeln einer Gesamtmenge von 50-80-Flügel, Lagern Sie den Microcentrifuge Schlauch bei-80 ° C bis zur Durchführung der RNA-Extraktion10,11.</li>
	<li>Machen Sie einen kleinen Schnitt an der Hinge-Region des Flügels oder in seiner Nähe. Lassen Sie das Fixiermittel, das Flügel-Epithel zu erreichen. Mit Hilfe einer Pipette (p200) bündig Fixativ über dem Flügel. Beim ersetzen spülen fixieren die kontaminierten mit neuem. Denken Sie nach dem Spülen, Flügel Fixiermittel für 5 Minuten. 
	Hinweis: Obwohl dieses Manöver hilft, den Großteil der kontaminierenden Gewebe wegzuräumen, einige Hemocytes und Fett-Tröpfchen können bleiben gefangen zwischen den dorsalen und ventralen epithelialen Schichten des Flügels (siehe Abbildung 1A).</li>
	<li>Reißen mit Zangen von der Kutikula Grenze (wie im Video gezeigt) das Loch erweitert und ermöglicht die Freisetzung von Flügel Epithel aus der Kutikula Sac. Sobald das Flügel-Gewebe freigegeben wird, lassen Sie es in die Paraformaldehyd-Lösung um 30 min Zinsbindung abzuschließen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Flächenflieger auf einer 4 quoll Plastikschale mit PBST gefüllt (Triton x-100 0,05 %). Laden über Nacht bei 4 ° C.</li>
</ol>
Tag3
(3) Primärantikörper Inkubation.
<ol>
	<li>Permeabilize das Gewebe die pupal Flügel in PBST Inkubation (Triton x-100 0,2 %) für 15 min mit einem rockigen Plattform, um eine sanfte flüssige Mitte Bewegung zu erleichtern. 
	Hinweis: Bis Montage der Proben, sollten die Schritte mit einem rockigen Plattform durchgeführt werden.</li>
	<li>Die Proben unter Verwendung PBSTA zu blockieren (BSA 3 % Triton x-100 0,1 %) für 1 h.</li>
	<li>Verwenden Sie den gleichen Puffer verdünnen Sie den primären Antikörper (Maus Anti-Ptc, 1: 100) und die pupal Flügel über Nacht bei 4 ° c inkubieren</li>
</ol>
Tag 4
(4) sekundäre Antikörper Inkubationszeit.
<ol>
	<li>Wash Proben 4 x 10 min mit PBST (Triton x-100 0,05 %)</li>
	<li>Inkubieren mit sekundären Antikörper (z. B.Anti-Maus zu Fluorochrom konjugiert) verdünnt, um entsprechende Konzentration im PBSTA (BSA 3 % Triton x-100 0,1 %) bei Raumtemperatur im Dunkeln für 2 h. 
	Hinweis: Wenn es geeignet ist, verwenden Sie, 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) und/oder Phalloidin um das Gewebe counterstain. Fügen Sie diese Sonden mit dem sekundären Antikörper unter Berücksichtigung der Emissionswellenlänge von Fluorochromes, die Überlappung der Signale zu verhindern.</li>
	<li>Wash Proben 4 x 10 min mit PBST (Triton x-100 0,05 %)</li>
</ol>
5. Montage
<ol>
	<li>Bereiten Sie eine Beispielfolie, indem Sie 4 Punkte von transparenten Nagellack auf Objektträger, als wären sie die Ecken eines Quadrats.</li></ol>Sie werden die Punkte, wo die Deckgläsern ruhen werden, zur Zerkleinerung des Gewebes zu vermeiden.
	<li>Platz 30 µL Medien (Glycerin/Tris-HCl 80 %) in der Mitte des Platzes die Punkte gemacht mit Nagellack ohne eine der Ecken (Punkte) zu montieren. Nehmen Sie eine Pipette mit einer gelben abgeschnittenen Spitze, laden Sie einige Montage-Medien und ziehen Sie dann in mehreren pupal Flügel.</li>
	<li>Übertragen Sie pupal Flügel auf den Punkt der Montage Medien auf den Objektträger. Mit Hilfe einer Spitze die Montage-Medien zu verbreiten und die pupal Flügel, um zu verhindern, schwimmende sinken. Die Morphologie des Gewebes wird einbehalten, wenn die Flügel flach bleiben, wenn das Deckglas auf gelegt wird. Vor dem Deckglas, Luftblasen zu entfernen.</li>
	<li>Senken Sie das Deckglas auf den Proben die Generation von Luftblasen zu verhindern versucht. Diese Bewegung kann mit Hilfe der Zange erfolgen.</li>

<ol>
	<li>Serrano, N., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limb+morphogenesis:+connections+between+patterning+and+growth.">Limb morphogenesis: connections between patterning and growth.</a> Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+and+appendage+development+in+Drosophila.">Compartments and appendage development in Drosophila.</a> Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).</li><li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+disc+development+in+the+fly:+the+early+stages.">Wing disc development in the fly: the early stages.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).</li><li>Beira, J. V., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+legacy+of+Drosophila+imaginal+discs.">The legacy of Drosophila imaginal discs.</a> Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).</li><li>De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+vein+pattern+variations+in+insect+wings.">Developmental basis for vein pattern variations in insect wings.</a> Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+vein+patterning+in+Drosophila+and+the+analysis+of+intercellular+signaling.">Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+lines+in+the+Drosophila+wing:+initiation+of+wing+vein+development.">Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).</li><li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing:+The+development+of+the+veins.">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li><li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Bolatto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+distribution+of+Patched-related+protein+in+the+Drosophila+embryo.">Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo.</a> Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).</li><li>Zuniga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+encoding+novel+secreted+and+transmembrane+proteins+are+temporally+and+spatially+regulated+during+Drosophila+melanogaster+embryogenesis.">Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis.</a> BMC Biol. 7, 61 (2009).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Methode der Dissektion in diesem Video beschrieben kann zur Vorbereitung hochwertige Proben von Drosophila pupal Flügel aus verschiedenen Entwicklungsstufen für viele Arten von Techniken (z. B. Immunfluoreszenz, cDNA Synthese zu PCR-Assays, in-vitro- Flügel Entwicklung). In Bezug auf diese Methode der beteiligten Wissenschaftler nutzten 24-30 h APF. Es sollte jedoch kein Hindernis in die wesentlichen Schritte in Dissektion der jüngere oder ältere Puppe. Änderungen müssen vorgenommen...

Drosophila Flügel werden aus den Flügel imaginalen Scheiben entwickelt. Das ursprüngliche dieser Flügel Discs während der Embryonalentwicklung als kleine Gruppen von 20-30 imaginalen Zellen, die aus embryonalen Epithel Biomembran beiseite. Während die Larve in die dritte Stufe der Instar wächst, tritt Mitose in die imaginalen Zellen zu bestimmten charakteristischen Zeiten heben seine Zahlen (ca. 50000 Zellen) und bilden die Flügel1,2,3Disc, 4. Da die Zellen sich vermehren, Mode sie eine röhrenförmige Epithel, was zu einer selbst faltbare kompakte Spirale. Während der Verpuppung die Scheibe Epithel Teleskope Form der zweischichtigen Flügel und die longitudinalen Venen beginnen als Lücken zwischen ihnen, dem tritt zweimal während Flügel Entwicklungsstörungen5,6.
Die Anordnung der Adern immer hat eine identische Muster; die Möglichkeit auf einfache Weise jede Veränderung innerhalb der Venen-Formation macht Mutationen extrem sichtbar (z.B. fehlende oder zusätzliche Adern, Änderungen in der Vene Positionen, etc..). Interessanterweise sind die Phänotyp-Variationen in der Regel der Nachweis von Mutationen in bekannten oder neuen Komponenten der Signalwege, die für Flügel Entwicklung relevant sind. Die Wege, die eine Rolle bei der Bestimmung der Position und Pflege Vene und intervein Gebiete gehört der Igel (Hh) Weg6,7,8.
Angesichts der Bedeutung der pupal Flügel als Modellsystem, wird es wichtig, gute Qualitätsproben mit arbeiten zu erhalten sein. In der Vergangenheit haben Wissenschaftler, die Protokolle, um Drosophila Flügel sezieren veröffentlicht haben einen passenden Guide, praktikable Proben zu erreichen nicht gegeben. Ohne die Führung eines Forschers kann nicht eindeutig den Prozess zu visualisieren. In dieser alternativen sezierenden Ansätze ist Puppe aufgeteilt in zwei, trennt die Flügel aus den umliegenden Gewebe und wiederholt gewaschen, um die Ablagerungen zu entfernen. Diese Art von Ansatz Ansprüche lassen die Flügel frei von Verunreinigungen, aber aufgrund der bisherigen Erfahrungen ist des Prozess langsamer und gibt es eine höhere Wahrscheinlichkeit einer Beeinträchtigung der Struktur der zerbrechlichen Flügeln9.
Die hier beschriebene Vorgehensweise wurde von der Nachfrage, eine schnelle und effiziente Methode pupal Flügel Proben geeignet, um bestimmte Proteine oder Abschriften mit Immunodetection Protokolle oder Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Assays erkennen erhalten finden entwickelt. Zur Veranschaulichung, der Ausdruck und die Lokalisierung von flickte (Ptc oder den kanonischen Rezeptor des Hh-Signalwegs) in pupal Flügel Proben, Bereitstellung eines Protokolls, die relevanten Details erfolgreich durchzuführen die komplette enthält erkannt wird Verfahren.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscope with cool light illumination</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Rocking platform</td><td>Biometra (WT 16)</td><td>042-500</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>StarFrost</td><td>8037/1</td><td></td></tr><tr><td>Cover glasses (24 x 32 mm)</td><td>Deltalab</td><td>D102432</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Lawton</td><td>63-1400</td><td></td></tr><tr><td>Multi-well plastic dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>144444</td><td></td></tr><tr><td>p100 or p200 pipette</td><td>Finnpipette (Labsystems)</td><td>9400130</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS (Dulbecco)</td><td>Gibco</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Bio Basic INC.</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Mallinckrodt</td><td>5092</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>497</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Ambion</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>DEPC treated water</td><td>MO.BIO</td><td>17011-200</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL&lt;br/&gt; (working dilution 1/800)</td><td>Invitrogen</td><td>A11030</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 &amp;mu;g/mL&lt;br/&gt; (working dilution 1/100)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td></td><td>By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI, 1 mg/mL&lt;br/&gt; (working dilution 1/5000)</td><td>Invitrogen</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol&lt;br/&gt; (1/600 working dilution)</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Canton S (fly stock)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays

Flügel-Entwicklung in Drosophila Melanogaster ist ein ideales Modell für das Studium Morphogenese Gewebe Ebene. Diese Anhängsel entwickeln sich aus einer Gruppe von Zellen benannt Flügel imaginalen Scheiben gebildet während der Embryonalentwicklung. In die Larvenstadien wachsen die imaginalen Scheiben, Erhöhung der Anzahl der Zellen und monolayered epitheliale Strukturen bilden. Im Inneren der pupal Fall die imaginalen Scheiben Knospe heraus und Falten in Bilayer entlang einer Linie, die die künftige Marge des Flügels wird. Während dieses Prozesses stammen die longitudinale Primodia Venen Vene Zellen auf den zukünftigen dorsalen und ventralen Flächen des Flügels. Während das Puppenstadium kommunizieren die Streifen der Vene Zellen jeder Fläche um die enge Röhren zu generieren; zum gleichen Zeitpunkt beginnen die Kreuz-Venen ihrer Entstehung.
Mit Hilfe von entsprechenden molekularen Markern ist es möglich, die wichtigsten Elemente des Flügels während seiner Entwicklung zu komponieren zu identifizieren. Aus diesem Grund ist die Fähigkeit, präzise Abschriften oder Proteine in dieser Struktur erkennen kritischer für die Untersuchung ihrer Fülle und Lokalisierung, die im Zusammenhang mit den Entwicklungsprozess des Flügels.
Die Vorgehensweise hier konzentriert sich auf Manipulation pupal Flügel, eine ausführliche Anleitung zum Umgang mit den Flügel während das Puppenstadium zu sezieren. Die Zerlegung des pupal Gewebe ist schwieriger durchzuführen als ihre Gegenstücke in Dritte Instar Larven. Deshalb ist dieser Ansatz entwickelt wurde, um schnell und effizient hochwertige Proben zu erhalten. Details wie Immunostain und montieren diese Flügel Proben ermöglichen die Visualisierung von Proteinen oder Zellbestandteile, im Protokoll zur Verfügung gestellt werden. Mit wenig Erfahrung ist es möglich, 8-10 hochwertige pupal Flügel in kurzer Zeit zu sammeln.

Das Protokoll bietet eine einfache Methode für den Erhalt der pupal Flügel-Proben, die die vertraute Morphologie des Flügels zu behalten. Von diesen Vorbereitungen ist es möglich, Stapel von Bildern zu erhalten, die als 2-D oder 3-d, zu untersuchen, Verbreitung und/oder die Anreicherung von Proteinen während der Differenzierung des Flügels projiziert werden konnte. Ein ähnliches Protokoll (siehe Anmerkung in 2,9) lässt sich die große pupal Flügel-Probe (mit 50-80 pupal Flügel) ...

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A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Die Fähigkeit, präzise Abschriften oder Proteine in Drosophila Gewebe erkennen ist entscheidend für die Untersuchung ihrer Fülle und Lokalisierung, die im Zusammenhang mit den Entwicklungsprozess. Hier ist die Beschreibung eines einfachen Verfahrens pupal Flügel zu sezieren. Diese Flügel können als Muster in verschiedenen Techniken (PCR-Assay, Immunohistochemistry, etc.) verwendet werden.

Eine schnelle und effiziente Methode, um Pupal Flügel von Drosophila geeignet für Immunodetections oder PCR-Assays sezieren

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

8.0K Aufrufe.  Laboratorio de Biología del Desarrollo. Die Fähigkeit, präzise Abschriften oder Proteine in Drosophila Gewebe erkennen ist entscheidend für die Untersuchung ihrer Fülle und Lokalisierung, die im Zusammenhang mit den Entwicklungsprozess. Hier ist die Beschreibung eines einfachen Verfahrens pupal Flügel zu sezieren. Diese Flügel können als Muster in verschiedenen Techniken (PCR-Assay, Immunohistochemistry, etc.) verwendet werden.

Serie: A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

Dissektion von Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Forschung

Genetik

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Neurowissenschaften

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Präparation und Färbung von Drosophila Pupal Eierstöcke

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Entwicklungsbiologie

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and behavioral evolution. Drosophila olfactory tissues house the olfactory receptor neurons (ORNs) that detect volatile chemical cues in addition to hydro- and thermo-sensory neurons. In this protocol, we describe the dissection of developing peripheral olfactory tissue of the adult Drosophila species. We first describe how to stage and age Drosophila larvae, followed by the dissection of the antennal disc from early pupal stages, followed by the dissection of the antennae from mid-pupal stages and adults. We also show methods where preparations can be utilized in molecular techniques, such as the RNA extraction for qRT-PCR, RNAseq, or immunohistochemistry. These methods can also be applied to other Drosophila species after species-specific pupal development times are determined, and respective stages are calculated for appropriate aging.

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Here, we present a protocol to stage and dissect developing olfactory tissue from Drosophila species. The dissected tissue can later be used for molecular analyses, such as quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) or RNA sequencing (RNAseq), as well as in vivo analyses such as immunohistochemistry or in situ hybridization.

Vorbereitung, Entwicklung von peripheren olfaktorische Gewebe für Molekulare und immunhistochemische Analysen in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

Dissektion der Drosophila Pupal Netzhaut Immunohistochemistry, westlichen Analyse und RNA-Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in multicellular organisms. The TGF-&#946; superfamily includes TGF-&#946;, bone morphogenetic protein (BMPs), Activins, Growth and Differentiation Factors, and Nodals. It has long been known that the amount of ligand exposed to cells is important for its effects. It was thought that long-range concentration gradients set up embryonic pattern. However, recently it has become clear that the timing of exposure to these ligands is also important for their downstream transcriptional consequences. A TGF-&#946; superfamily ligand cannot have a developmental consequence until it is released from the cell in which it was produced. Until recently, it was difficult to determine when these ligands were released from cells. Here we show how to measure the release of a Drosophila BMP called Decapentaplegic (Dpp) from the cells of the wing primordium or wing disc. This method could be modified for other systems or signaling ligands.

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The timing of exposure to ligands may impact their developmental consequences. Here we show how to image release of a Drosophila bone morphogenetic protein (BMP) called Dpp from cells of the wing disc.

Imaging Dpp Release von einer Drosophila Wing Disc

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

Drosophila Puppenstadium Abdomen Immunhistochemie

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Biologie

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

Langfristig In Vivo Verfolgung von entzündlichen Zelldynamik in Drosophila Puppen

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Immunologie und Infektion

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

Sezieren, Fixieren und Visualisieren der Drosophila pupal notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...

Drosophila Larva Imaginal Disc Dissection: A Method to Observe Developing Epithelia

Source: Morimoto, K. and Tamori, Y. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/55901/" target="_blank">Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia</a>. J. Vis. Exp. (2017).
When staining Drosophila imaginal discs, often a rough dissection is performed where the discs are exposed but remain attached to the body. Once stained, the discs of interest are isolated and mounted. The example protocol demonstrates a procedure for wing imaginal disc dissection and mounting.

Drosophila Dissektion der Imaginalscheibe der Larva: Eine Methode zur Beobachtung der Entwicklung von Epithelien

Source: Morimoto, K. and Tamori, Y. Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia. J. Vis. Exp. (2017).
When staining Drosophila ...