Name: dissection and staining of drosophila pupal ovaries
Uploaded: 2018-03-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
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Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institutes of Health (RO1 GM079351 di D.K.). Ringraziamo Dorothea Godt per i suoi consigli utili su dissezioni dell'ovaia pupal basato sul suo protocollo originale. Ringraziamo anche Amy Reilein per la sua assistenza e commenti sul manoscritto.

1. EggLaying
<ol><li>Combinare circa uomo dieci e quindici femmina adulto drosofila mosche del genotipo desiderato in un flaconcino di normali alimenti ricchi di volare, completati con lievito. Per evitare sovraffollamento il flaconcino, consentire le femmine accoppiate a deporre le uova per non più di 2 – 4 h14.</li>
	<li>Trasferire gli adulti dal flaconcino in un flacone nuovo toccando il flaconcino di apertura contro una fiala diversa con alimento. Lasciare le uova a sviluppare in larve a temperatura ambiente per 3 – 4 giorni.</li>
</ol>2. selezione di femminile larve
<ol><li>Utilizzando un pennello sottile umido con setole morbide, fanno un movimento di rotolamento con il pennello lungo la parete del flaconcino per trasferire un bicchiere ben riempito fino all'orlo con tampone fosfato salino (PBS): 1x errante terza-instar larve dal flaconcino. Lavare i residui di cibo fuori le larve di trasferirli ad un altro bene riempito con PBS 1X.</li>
	<li>Separare le larve di sesso maschile e femminile usando il forcipe. Identificare le larve maschile da un paio di testicoli grandi, rotondi e traslucidi incorporato nel corpo di grasso sulla parte laterale del corpo circa due-terzi giù dalla sua estremità anteriore15. Le larve femminile sono mediamente più grandi, meno traslucido rispetto ai maschi e hanno gonadi molto più piccole che sono più difficili da rilevare.</li>
	<li>Selezionare contro larve maschile per raccogliere le larve femminile. Raccogliere almeno dieci femmine dal pozzo. Inserire le larve femminile in un separato ben riempito con PBS 1X.</li>
	<li>Forcipe di uso per trasferire le larve femminile delicatamente in un nuovo flacone di cibo fresco volo completati con lievito.</li>
	<li>Collocare il flaconcino con le larve femminili in un luogo buio per facilitare pupariation16. Durante tutta la giornata, monitorare le larve per pupariation. Come ogni larva immobilizza e si sviluppa in un prepupa, la prepupa contro il flaconcino del cerchio e registrare il tempo approssimativo quando si forma prima in un prepupa. La protrusione di spiracoli anteriori e la temporizzazione del pupario formazione17individuare membranose. Consentire la membranose a sviluppare fino al punto di tempo desiderato (misurato in ore dopo la formazione del pupario, APF). Nota: Tutti gli animali che subiscono pupario formazione entro un intervallo di circa 10 h possono essere considerato un prepupa. Stadio pupale inizia circa 12 h dopo la formazione del pupario dopo un molt interna ha avuto luogo.</li>
</ol>3. preparazione pupe per la macchiatura dell'anticorpo
<ol><li>
Formare una pipetta di vetro sottile per essere utilizzato nei passaggi successivi per sgombrare il corpo grasso pupal.
	<ol>
<li>Fondere il vetro in punta di una pipetta Pasteur sopra un bruciatore di Bunsen. Come il vetro si scioglie, è possibile utilizzare pinze per tirare la punta orizzontalmente lontano dal resto della pipetta per formare una punta più sottile.</li>
		<li>Dopo il raffreddamento, rompere una piccola porzione della punta della pipetta per formare un'apertura circolare ordinata. Collegare una lampadina a altra estremità della pipetta.</li>
		<li>Caricare la pipetta con PBS 1X.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per raccogliere le pupe, che sono incollate alla parete del flaconcino, applicare una piccola goccia d'acqua lungo la zona di contatto tra pupa e flaconcino. Attendere 1-2 min per lasciare che la proteina colla sciogliere prima di sollevare delicatamente la pupa fuori il muro con un pennello umido. Trasferire la pupa per un bicchiere ben riempita con 1x PBS. Dedicare un singolo pozzo a pupa per evitare il sovraffollamento del pozzo.</li>
	<li>Mentre afferra l'estremità posteriore della pupa con una coppia di pinze, strappare accuratamente la porzione anteriore del caso pupal con un'altra coppia fino a quando la testa della pupa è visibile.</li>
	<li>Afferrare la punta anteriore-la maggior parte della testa pupal con pinze e tirare delicatamente la pupa fuori del suo caso pupal. Nota: Una parte del corpo grasso può fuoriuscire durante questo processo.</li>
	<li>Separare e scartare la metà anteriore della pupa della metà posteriore fino a quando rimane solo il sacco addominale.</li>
	<li>
Estrarre le cellule di grasso corpo dalla sacca addominale.
	<ol>
<li>Afferrare il sacco addominale contro il fondo del pozzo con la pinzetta in una mano mentre si tiene la pipetta di vetro sottile riempita con PBS 1X in un'altra mano.</li>
		<li>Mirare il puntale sottile verso l'apertura del sacco e lentamente dispensare 1X PBS nell'addome per lavare via le cellule di grasso corporeo che circondano le ovaie pupale. Nota: Le ovaie sono un paio di strutture piccole, traslucidi, striati e oblunghe che deve rimanere all'interno del sacco addominale.</li>
		<li>Lavare via che il grasso corporeo cellule fino a quando almeno i due terzi del corpo grasso è andato o fino a quando le ovaie sono visibili vicino all'apertura del sacco addominale. È molto importante eseguire questo passaggio lentamente per non lavare le ovaie fuori l'addome per caso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Esaminare il pozzo per verificare se le ovaie hanno rovesciato fuori durante il lavaggio delle cellule di grasso corporeo. Se le ovaie non sono visibili all'interno del pozzo, essi dovrebbero rimasto nell'addome. Se le ovaie sono usciti, posizionare una nuova pupa nel pozzo e ripetere questo passaggio.</li>
	<li>Trasferire l'addome in una camera di coprioggetto chiaro piena di buffer di fissazione (1x PBS, paraformaldeide al 4%) e mettere il coperchio sulla parte superiore. Per garantire un numero sufficiente di ovaie sopportare la colorazione e il processo di montaggio, sezionare le ovaie più del necessario. Attenzione: Il buffer di fissazione contiene paraformaldeide che è tossico. Si prega di indossare adeguate protezioni quali guanti, occhiali di sicurezza, ecc.</li>
</ol>4. Immunohistochemistry
<ol><li>Durante tutto il processo di colorazione, è necessario utilizzare pinze per spingere delicatamente giù qualsiasi ovaie galleggiante sul fondo del pozzo vetro di copertura per garantire che le ovaie sono completamente immersi nella soluzione di anticorpo.</li>
	<li>Posto di strisce di nastro biadesivo sulla superficie piana di un Nutator e quindi posizionare il coprioggetto chambered sulla superficie adesiva.</li>
	<li>Incubare le ovaie nel buffer di fissazione dal passaggio 3,7 per 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Sciacquare le ovaie tre volte in PBS 1x con 1% Triton X-100 per 5, 10 e 45 min (1h in totale), rispettivamente, per consentire la permeabilizzazione approfondita.</li>
	<li>Bloccare le ovaie in siero di capra normale 10% in PBS 1x con 0,5% Triton X-100 per 30 min.</li>
	<li>Incubare le ovaie durante la notte a 600 µ l di anticorpo primario di scelta diluito alla concentrazione appropriata in PBS 1x con 0,5% Triton X-100 a 4 ° C.</li>
	<li>Sciacquare le ovaie tre volte per 5 min in 1X PBS con 0,5% Triton X-100.</li>
	<li>Incubare le ovaie per 2 h a 600 µ l di anticorpo secondario di scelta diluito alla concentrazione appropriata in PBS 1x con 0,5% Triton X-100 a temperatura ambiente.</li>
	<li>Sciacquare le ovaie due volte per 5 min in 1X PBS con 0,5% Triton X-100 e una volta per 5 min in 1X PBS.</li>
</ol>5. di dissezione e montaggio Pupal ovaie
<ol><li>Mettere una piccola goccia di PBS 1X su un vetrino da microscopio. Forcipe di uso per trasferire il sacco addominale dal coprioggetto chambered a un bicchiere ben riempito con PBS 1X. Dedicare un singolo pozzo a pupa per evitare il sovraffollamento del pozzo.</li>
	<li>Lacerare il sacco addominale e qualsiasi corpo grasso restante con il forcipe. Nota: Le ovaie, che sono un paio di strutture piccole, traslucide, striati e oblunghe, dovrebbero essere visibile all'interno del pozzo. Le ovaie sono spesso strettamente circondate dal corpo grasso, quindi è importante assicurarsi che tutti i grassi corpo è lacerato accuratamente apart.</li>
	<li>Trasferire le ovaie dal pozzo nella goccia di 1X PBS sul microscopio slide afferrando il centro delle ovaie tra le punte della pinza. È molto importante utilizzare una presa salda senza strizzare le ovaie così da non perdere o distruggerli durante il trasferimento. Aggiungere poche gocce di PBS 1x alla diapositiva quando la soluzione si asciuga nel tempo.</li>
	<li>Una volta che tutte le ovaie sono state sezionate e trasferite al microscopio, dispensare 40 µ l di liquido di montaggio su di un vetrino coprioggetti 22 x 22 mm e posto il vetrino coprioggetto delicatamente sopra le ovaie. Lasciate che il pernottamento asciutto diapositiva prima di formazione immagine.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Stem+Cell+Niches:+A+Decade+of+Discovery+Suggests+a+United+View+of+Stem+Cell+Regulation.">Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation.</a> Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).</li><li>Kirilly, D., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+ovary:+an+active+stem+cell+community.">The Drosophila ovary: an active stem cell community.</a> Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).</li><li>Dansereau, D. 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L., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=INSECT+FAT+BODY:+ENERGY,+METABOLISM,+AND+REGULATION.">INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION.</a> Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).</li><li>Zhang, Y., Xi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+Body+Development+and+its+Function+in+Energy+Storage+and+Nutrient+Sensing+in+Drosophila+melanogaster.">Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster.</a> J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).</li><li>Wong, L. C., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Drosophila+Ovaries.">Dissection of Drosophila Ovaries.</a> J Vis Exp. (1), e52 (2006).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse di dichiarare.

Il passo più critico e difficile di questo protocollo prevede la preparazione delle ovaie pupale prima della fissazione. Per garantire che le ovaie, piccole e sepolte dalle cellule di grasso corporeo all'interno dell'addome pupal, sono macchiate sufficientemente con gli anticorpi, è importante non solo strappare una grande apertura nel sacco addominale con il forcipe, ma anche estrarre le cellule di grasso corporeo che ostacolano la ovaie dagli anticorpi. Corretta esecuzione di questo passaggio richiede l'applicazione ...

Ricerca sulle cellule staminali utilizzando Drosophila ovaie è ampiamente sviluppato dalla prima documentazione di una cellula staminale nicchia1,2,3,4. Seguendo lo sviluppo di strumenti genetici di lignaggio traccia, ovaio di Drosophila dissezioni sono stati comunemente utilizzate per lo studio di cellule staminali lignaggi e vie che regolano il mantenimento delle cellule staminali, proliferazione e destino nella nicchia delle cellule staminali di segnalazione. Conoscenza di queste vie di segnalazione può produrre intuizioni potenziali cause di tumori che hanno origine da cellule staminali aberrante attività5,6,7. Inoltre recentemente è stato dimostrato che le cellule staminali somatiche nell'ovaio di Drosophila , conosciuto come le cellule staminali del follicolo (FSCs), fortemente assomigliano cellule staminali intestinale dei mammiferi in molti aspetti della loro organizzazione8. Per questo motivo, Drosophila ovaie sono un sistema di modello altamente utile per studiare il comportamento delle cellule staminali.
Mentre le ovaie larvale e adulte offrono indizi per lo sviluppo iniziale della cellula formativa e l'organizzazione finale della cellula formativa nella nicchia, rispettivamente, l'ovaio pupal è una struttura intermedia in cui la linea germinale e cellule somatiche riorganizzare e stabilire la loro identità 9 , 10. anche se parecchi studi hanno esaminato gli aspetti dello sviluppo del tessuto nell'ovaia pupal10,11,12,13, domande rimangono per quanto riguarda la differenziazione e l'organizzazione spaziale di tipi di cellule ovariche durante lo sviluppo pupa. In particolare, la specifica del FSCs si verifica durante questo periodo. Questo protocollo descrive un metodo per la dissezione e la macchiatura pupale ovaie a intervalli di tempo desiderato — una tecnica che può essere utilizzata in esperimenti di corso di tempo che analizzano lo sviluppo pupale ovaia in dettaglio dalla larvale alla fase adulta.
Per tenere conto le piccole dimensioni, traslucenza e inaccessibilità dell'ovaia pupal all'interno dell'addome pupal, questo protocollo utilizza strumenti come una pipetta di Pasteur su misura con la punta sottile per rimuovere il tessuto addominale grasso corporeo che ostruisce l'accesso dell'anticorpo per il ovaie. Un coprioggetto chiaro, chambered utilizzato durante l'anticorpo che macchia offre una maggiore visibilità delle pupe e una piattaforma più delicata per oscillare le ovaie su un "Nutator". Basato su un protocollo per le dissezioni dell'ovaia larvale di Maimon e Gilboa14, una concentrazione relativamente alta di Triton X-100 è stata impiegata nelle fasi iniziali della procedura di colorazione per massimizzare l'accesso di permeabilizzazione e anticorpo di membrana cellulare per il cellule ovariche.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 Forceps, biology</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ-10A</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Analysis software</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zen</td><td></td></tr><tr><td>9 Depression Glass Spot Plates</td><td>Pyrex</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet bulb</td><td>Various vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bunsen burner</td><td>Various vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm glass coverslips No 1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Double-sided tape</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>Clay Adams</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine brush #0, #3-#5</td><td>Various vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gilson Pipetman Starter Kit</td><td>Thomas Scientific</td><td>F167300</td><td>Contains p20, p200, p1000 pipettors</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td>Dilute to 1x PBS</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>5000121</td><td>Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration</td></tr><tr><td>Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000)</td><td>Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore)</td><td></td><td>Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration</td></tr><tr><td>Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum)</td><td>Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)</td><td></td><td>Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration</td></tr><tr><td>Fly vials</td><td>Denville Scientific</td><td>V9406</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Balls, For Wide Vials</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-102W</td><td></td></tr><tr><td>Yeast, Bakers Dried Active</td><td>MP Biomedicals</td><td>101400</td><td></td></tr><tr><td>Fly food</td><td>Produced in laboratory</td><td></td><td>Mixture of water, brewer&#039;s yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid</td></tr><tr><td>Male and female &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and staining of drosophila pupal ovaries

A differenza di adulto Drosophila ovaie, pupale ovaie sono relativamente difficili da accedere ed esaminare a causa della loro piccola dimensione, traslucenza e che incassa all'interno di un caso pupal. La sfida di dissezione pupale ovaie si trova anche nella loro posizione fisica all'interno della pupa: le ovaie sono circondate dalle cellule di grasso corporeo all'interno dell'addome pupal, e queste cellule di grasso deve essere rimosso per consentire la macchiatura dell'anticorpo appropriato. Per superare queste sfide, questo protocollo utilizza personalizzate pipette Pasteur per estrarre le cellule del corpo di grasso dall'addome pupal. Inoltre, un coprioggetto chambered viene utilizzato al posto di un tubo del microcentrifuge durante il processo di colorazione per migliorare la visibilità delle pupe. Tuttavia, nonostante questi ed altri vantaggi degli strumenti utilizzati nel presente protocollo, corretta esecuzione di queste tecniche può coinvolgere ancora diversi giorni di pratica a causa delle piccole dimensioni delle ovaie pupale. Le tecniche descritte in questo protocollo potrebbero essere applicate agli esperimenti di corso di tempo in cui le ovaie sono analizzate nelle varie fasi di sviluppo pupa.

Corretta esecuzione di questa procedura dovrebbe provocare macchiatura dell'anticorpo chiaro che rivela la struttura e l'organizzazione cellulare di ovaio pupal di Drosophila . Immunohistochemistry descritte in questo protocollo può essere utilizzato per identificare tipi cellulari comunemente macchiati nelle ovaie larvale e adulte. Cellule del gambo pupal derivato da sciamano cellule18 (delineato da Fasciclin III in bianco) sono mostrati nella <strong cl...

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Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

L'ovaio di Drosophila è un sistema eccellente modello per studiare lo sviluppo di nicchia delle cellule staminali. Anche se i metodi per la dissezione ovaie larvale e adulte sono stati pubblicati, le dissezioni pupal ovaia richiedono tecniche differenti che non sono stati pubblicati in dettaglio. Qui descriviamo un protocollo per la dissezione, colorazione e montaggio pupale ovaie.

Dissezione e colorazione delle ovaie Pupal Drosophila

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

9.3K Views.  Columbia University. L'ovaio di Drosophila è un sistema eccellente modello per studiare lo sviluppo di nicchia delle cellule staminali. Anche se i metodi per la dissezione ovaie larvale e adulte sono stati pubblicati, le dissezioni pupal ovaia richiedono tecniche differenti che non sono stati pubblicati in dettaglio. Qui descriviamo un protocollo per la dissezione, colorazione e montaggio pupale ovaie.

Video: Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection of Drosophila Ovaries

Dissezione di ovaie Drosophila

Ricerca

Biologia

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Imaging Upright di<em&gt; Drosophila</em&gt; Chambers Egg

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Biologia dello sviluppo

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ribonucleoprotein particle movement, mRNA localization, organelle movement, and cytoskeletal dynamics. There are several methods for live imaging that have been developed. Due to the fact that each method involves dissecting individual ovarioles placed in media or halocarbon oil, cellular damage due to hypoxia and/or physical manipulation will inevitably occur over time. One downstream effect of hypoxia is to increase oxidative damage in the cells. The purpose of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries after induction of controlled cellular damage. Here, we use hydrogen peroxide to induce cellular oxidative damage and give examples of the effects of such damage on two subcellular structures, mitochondria and Clu bliss particles. However, this method is applicable to any subcellular structure. The limitations are that hydrogen peroxide can only be added to aqueous media and would not work for imaging that uses halocarbon oil. The advantages are that hydrogen peroxide is readily available and inexpensive, acts quickly, its concentrations can be modulated, and oxidative damage is a good approximation of damage caused by hypoxia as well as general tissue damage due to manipulation.

The objective of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries.

Visualizzazione degli effetti dei danni ossidativi sulle camere delle uova Drosophila utilizzando l&apos;imaging dal vivo

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment and maintenance of epithelial tissue morphology and organ morphogenesis. Moreover, the BM is essential for tissue modeling, serving as a signaling platform, and providing external forces to shape tissues and organs. Despite the many important roles that the BM plays during normal development and pathological conditions, the biological pathways controlling the intracellular trafficking of BM-containing vesicles and how basal secretion leads to the polarized deposition of BM proteins are poorly understood. The follicular epithelium of the Drosophila ovary is an excellent model system to study the basal deposition of BM membrane proteins, as it produces and secretes all major components of the BM. Confocal and super-resolution imaging combined with image processing in fixed tissues allows for the identification and characterization of cellular factors specifically involved in the intracellular trafficking and deposition of BM proteins. This article presents a detailed protocol for staining and imaging BM-containing vesicles and deposited BM using endogenously tagged proteins in the follicular epithelium of the Drosophila ovary. This protocol can be applied to address both qualitative and quantitative questions and it was developed to accommodate high-throughput screening, allowing for the rapid and efficient identification of factors involved in the polarized intracellular trafficking and secretion of vesicles during epithelial tissue development.

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane is essential for tissue and organ morphogenesis during development. To better understand the mechanisms leading to proper placement of this structure, the protocol presented describes methods to visualize and characterize the intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins in epithelial cells using confocal and super-resolution microscopy.

Imaging confocale e a super-risoluzione del traffico intracellulare polarizzato e della secrezione di proteine della membrana basale durante l'oogenesi della drosophila

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissezione e colorazione di Drosophila Larvali ovaie

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

Drosophila pupa Addome Immunoistochimica

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Dissezione e Immunostaining di immaginale dischi da<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

Studiare mitocondriale Struttura e funzione in<em&gt; Drosophila</em&gt; ovaie

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

Colorazione delle goccioline per nidi e lipidi degli ovociti nelle larve di Drosophila

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

Dissezione, fissaggio e visualizzazione della Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...

Dissezione e colorazione delle ovaie Pupal Drosophila

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Dissezione di ovaie Drosophila

Imaging Upright di

Visualizzazione degli effetti dei danni ossidativi sulle camere delle uova Drosophila utilizzando l'imaging dal vivo

Imaging confocale e a super-risoluzione del traffico intracellulare polarizzato e della secrezione di proteine della membrana basale durante l'oogenesi della drosophila

Dissezione e colorazione di Drosophila Larvali ovaie

Drosophila pupa Addome Immunoistochimica

Dissezione e Immunostaining di immaginale dischi da

Studiare mitocondriale Struttura e funzione in

Colorazione delle goccioline per nidi e lipidi degli ovociti nelle larve di Drosophila

Dissezione, fissaggio e visualizzazione della Drosophila Pupal Notum