Questo protocollo è significativo, perché consente di fare immunoistochimica sul notum della pupa di Drosophila, anche dopo che sono stati precedentemente feriti e fotografati dal vivo, senza interrompere l'architettura del tessuto. Questa tecnica permette di sfruttare, della vasta gamma di macchie anticorpali già disponibili, per macchiare cellule, strutture e proteine, nell'epitelio notum. Abbiamo usato questa tecnica per l'immunochimica e la colorazione del DNA.
Tuttavia, questa dissezione potrebbe essere utilizzata come punto di partenza per altre tecniche, come l'ibridazione in situ. Questo protocollo può essere difficile, perché le pupe sono piccole e delicate, quindi richiede una mano ferma per eseguire la dissezione. E diventa più facile con l'esperienza, quindi esercitati su pupe non importanti prima di quelle importanti.
Inizia rimuovendo con cura tre o quattro pupe allo stadio P5, usando un cannocchiale di dissezione, e raccoglile sul vetrino del microscopio accanto al nastro. Quindi, posizionare le pupe ad almeno una larghezza di pupa di distanza, sul nastro, con i lati ventrali verso il basso. Ora, posiziona una goccia di colla adesiva su un film parrafin o nel coperchio di un tubo centrifugo.
Quindi, immergere l'estremità di una punta della pipetta da 0,1 a 10 microlitri nella goccia di colla adesiva e picchiettare la punta della pipetta due volte su una scivolata di copertura, a un centimetro per un centimetro da un angolo, creando una linea di colla adesiva, circa la metà della lunghezza della pupa. Quindi, preimpostare una pipetta P2 a due microlitri e una pipetta P200 a un volume di 200 microlitri e adattarle con punte. Ora, inserisci una pinza vicino al lato della testa e rimuovi delicatamente il più possibile la pupilla, lavorando dall'anteriore alla posteriore.
Quindi, afferra le gambe in via di sviluppo della pupa, con un paio di pinze smussate, e tira con attenzione la pupa dalla sua custodia. Posare la pupa nell'angolo della scivolata di copertura. Afferrare la pupa all'addome posteriore, o l'ala in via di sviluppo, con una pinza smussata.
Sollevare e posizionare il lato ventrale della pupa verso il basso, nella linea di colla adesiva. Riempire rapidamente la pipetta P2, con due microlitri di PBS monopolimerale, contenenti calcio 0,1 millimolare, e tenendola in aria, espellere quel tanto che basta per formare una piccola bolla sulla punta. Toccare la piccola bolla della soluzione, su un lato della pupa alla base del torace, quindi ripetere la procedura sull'altro lato.
Quindi, riempire la pipetta P200, con 200 microlitri di PBS a singola resistenza, con calcio millimolare 0,1, quindi posizionare la punta della pipetta sul torace ed espellere il contenuto per immergere completamente le pupe e il resto della colla adesiva si solidificherà immediatamente. Ora, rimuovere circa 100 microlitri della soluzione PBS, in modo che la pupa sia appena sommersa, prima di procedere immediatamente al passaggio successivo. Per sezionare il notum, afferrare un paio di forbici da micro dissezione, rinforzando un lato del manico contro l'indice e il medio della mano dominante, in modo che il pollice della mano dominante applichi la forza di taglio.
Quindi, stabilizzare il collo delle forbici contro il dito medio della mano non dominante, mentre si rinforza la scivolata di copertura, con l'anulare della mano non dominante. Ora, taglia al centro dell'addome dorsale per creare un piccolo foro di circa 0,2-0,5 millimetri. Per isolare il tessuto dorsale, fare piccoli tagli da 0,5 a 0,75 millimetri attraverso il tegumento, dal posteriore all'anteriore, e alla fine, questi circonderanno il tessuto dorsale.
Inoltre, ripetere i tagli posteriori a anteriori sull'altro lato delle pupe. Ruotare lo stadio di dissezione, per consentire un taglio pulito attraverso la testa, se necessario. Determina se il notum è stato isolato, vedendo se è facilmente spostabile.
Aggiungere circa 200 microlitri di PBS monopolimere al centro dello slittamento del coperchio e creare un canale che lo colleghi alla goccia di dissezione originale, trascinando delicatamente la punta della pipetta attraverso il vetro di copertura, dalla nuova goccia a quella originale. Usando un paio di pinze smussate, spingere o trascinare delicatamente il notum isolato al centro del coperchio scivolare e ruotare, in modo che il lato interno sia rivolto verso l'alto. Tenere il notum verso il basso con una pinza smussata, premendo nella sezione addominale o della testa.
Utilizzando un paio di pinze affilate e delicate espulsioni di PBS a forza singola, da una pipetta da 200 microlitri, rimuovere qualsiasi corpo grasso rimanente, bande muscolari o sollevamento dell'emo, per esporre completamente l'epitelio monostrato. Una volta che il tessuto è pulito, utilizzare una pipetta da 200 microlitri per rimuovere il più possibile la soluzione PBS, monitorando con l'ambito di dissezione, per evitare di aspirare il notum. Dopo la massima rimozione del liquido, utilizzare un tessuto assorbente, per pulire accuratamente il resto della colla adesiva, la carcassa della pupilla e altri detriti sullo slip di copertura.
Ora, aggiungi da 150 a 200 microlitri del 4% di PFA e fissa per 20 minuti a temperatura ambiente. E a seconda della velocità di dissezione, è possibile sezionare da una a tre pupe in più, durante la fissazione della prima pupa su scivoli di copertura separati. Rimuovere il PFA e sostituirlo con PBS monopolimero, per lavare il notum una volta per 30 secondi.
Se si procede con la colorazione anticorpale, eseguire tre lavaggi di cinque minuti, in PBS o PBST a singolo dosaggio, per permeabilizzare il tessuto se l'antigene è intracellulare. Il campione può essere conservato in PBS monopolimero, con 0,02% di azide di sodio durante la notte in una camera umidificata. Dopo la colorazione, preparare un nuovo slip di copertura denominato topper, con supporti.
Creare uno spazio di circa 200 micrometri, utilizzando distanziali realizzati con 22 per 22 scivoli di copertura, a circa un centimetro di distanza, al centro del topper. Per aderire, dipingere la cucitura del distanziatore più lontano dal centro, con un sottile strato di smalto per unghie, quindi lasciarlo asciugare. Rimuovere il più possibile la soluzione acquosa dal campione e applicare immediatamente due gocce di mezzo di montaggio anti-dissolvenza sul campione.
Se necessario, utilizzare una pinza affilata pulita per posizionare il notum nel centro della goccia media di montaggio anti-dissolvenza. Posizionare il coperchio con il notum, su un supporto in schiuma di circa 10 per 40 millimetri per elevare il campione in modo che non aderisca al piano di lavoro. Sotto un ambito di dissezione, abbassare lentamente il topper sul campione.
Una volta che il mezzo di montaggio anti-dissolvenza incontra il topper, rilasciare delicatamente e consentire l'azione capillare per tirare il topper verso il basso. Posizionare un altro pezzo di schiuma sul topper e utilizzare un vetrino per microscopio standard come peso, per convincere delicatamente il mezzo di montaggio anti-dissolvenza tra lo slittamento del coperchio del campione, il topper e i distanziali. Dopo 5-10 minuti, utilizzare un tessuto assorbente per allontanare qualsiasi mezzo di montaggio anti-dissolvenza in eccesso, toccando delicatamente i bordi dello slip di copertura.
Applicare delicatamente lo smalto su ogni angolo del coperchio scivola per farli aderire insieme. Per evitare che lo scivolamento del coperchio si sposti e danneggi il tessuto dorsale, evitare prima di rivestire i bordi e, una volta che lo smalto negli angoli si asciuga, dipingere tutti i bordi del coperchio scivola per sigillare. Questo protocollo consente l'imaging dei campioni fissi, utilizzando anticorpi e macchie cellulari.
Questo protocollo può essere utilizzato su campioni che sono stati precedentemente feriti e ripresi dal vivo. Un confronto tra immagini vive e fisse, mostra che il protocollo preserva l'architettura e la morfologia del tessuto. Il protocollo consente diverse viste di un notum sezionato.
La vista apicale è ideale per visualizzare i bordi e i nuclei delle cellule epiteliali, sotto la cuticola. La vista basale rivela meglio le strutture basali al margine della ferita. Assicurati di non piegare o deformare il notum durante la dissezione.
Tagliare un pezzo piatto evitando i bordi laterali. Non tagliare troppo vicino ai lati ventrali, altrimenti si deformerà durante il montaggio. Dopo aver sezionato un notum pupillare, potrebbero essere applicate molte altre tecniche, come la microscopia elettronica e la sezione trasversale.
Queste tecniche potrebbero consentire di studiare le strutture precedentemente fotografate in modo estremamente dettagliato.
