This work was supported by the British Heart Foundation, project grant PG/13/69/30454.

il lavoro degli animali è stato autorizzato e approvato dal Newcastle University Ethics Review Board. Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità alle linee guida della direttiva 2010/63 / UE del Parlamento europeo sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici. 1. Amministrazione EdU <ol><li> Sciogliere EdU in soluzione salina sterile (0,9% w / v) ad una concentrazione finale di 12,5 mg / ml. <ol><li> Riscaldare la soluzione a 40 ° C e agitare per sciogliere completamente. Conservare abbastanza EdU / Saline a 4 ° C per iniettare tutti i topi nello studio consentendo 6 iniezioni giornaliere. Nota: in genere oltre 6 topi sono necessari per ogni gruppo sperimentale. Tuttavia, i calcoli di potenza devono essere eseguite per studi indipendenti. </li></ol></li><li> Pesare i singoli topi. Calcolare il volume necessario per somministrare 100 mg / g di soluzione salina / EdU per ogni mouse (8 ml di soluzione madre EdU per g). </li><li> Disegnare il volum appropriatae di Edu / soluzione salina in insulina siringa con un ago da 25 G. </li><li> Eseguire intraperitoneale (ip) iniezioni durante la manipolazione topo, utilizzando le tecniche del Ministero degli approvati. <ol><li> Posizionare il mouse sul coperchio della gabbia. Delicatamente tirare indietro sulla base della coda e afferrare saldamente il mouse per la collottola. </li><li> Esporre l&#39;addome per iniezione tenendo il mouse con il dito indice e pollice vicino alla base della testa e ribaltamento testa dell&#39;animale all&#39;indietro verso il pavimento. </li><li> Pulire l&#39;addome con una soluzione di alcool al 70%. Individuare linea mediana dell&#39;animale e quadrante in basso a destra. Iniettare la soluzione EdU / Saline nell&#39;animale nel quadrante inferiore destro. </li><li> Iniettare topi con una soluzione salina / EdU e registrare l&#39;ora del giorno. </li></ol></li><li> Ripetere i passaggi da 1,2 a 1,4, allo stesso tempo del giorno, per 6 giorni consecutivi. Nota: Come un controllo negativo EdU è necessario impostare il gating per l&#39;analisi di citometria di flusso, iniettare un&#39;età aggiuntivo, sesso e sperimentalmente corrispondonoMouse ed un volume equivalente di soluzione salina senza EdU. Ciò fornirà il controllo richiesto (nessun controllo UDE). Questo controllo deve essere incluso per ogni studio per consentire variazioni di lotti di reagenti e citometro istituito. </li></ol> 2. Cuori di raccolta <ol><li> A 24 ore dopo il 6 ° iniezione EdU, sacrificare i topi utilizzando dislocazione cervicale (o un programma alternativo approvato 1 Home Office metodo). </li><li> Mettere animale sacrificato in posizione supina e fare incisione cutanea dalla metà addome per il diaframma con le forbici chirurgiche. </li><li> Tagliare il diaframma, e tenendo lo sterno dalla cavità del corpo, tagliato bilateralmente per esporre il cuore. </li><li> Sollevare il cuore un po &#39;e tagliare i principali vasi sanguigni del tratto di efflusso a sezionare il cuore fuori della cavità toracica. </li><li> Immediatamente svolge ogni cuore in un individuo da 15 ml tubo da centrifuga contenente 10 ml di PBS refrigerate a 4 ° C. </li><li> Trasferimento cuori SEParate 10 cm Petri, utilizzando un bisturi tagliare ogni cuore in due in un orientamento sagittale e lavare cuore comprimendo delicatamente con un paio di pinze. Quindi sostituire la PBS per rimuovere tutto il sangue possibile. Ripetere questa operazione due volte. </li><li> Mettere entrambe le parti di ogni cuore nella stessa 1,5 ml singolo tubo microcentrifuga. </li><li> Passare al punto 3 o in alternativa Conservare i campioni -80 ° C come descritto nei passi 2.9 e 2.10. </li><li> Utilizzando un ago G 25, fare un piccolo foro nel coperchio provetta per impedire l&#39;apertura del coperchio causa dell&#39;espansione del gas quando il cuore viene elaborato. </li><li> Etichettare ogni provetta e posto in un contenitore di azoto liquido per congelare. </li></ol> 3. Nuclei Dissociazione e Cardiomyocyte Nuclei etichettatura Nota: Questo nuclei etichettatura di dissociazione e cardiomiociti nuclei è adattato da quello di Bergmann et al 11 eseguire questa procedura su tutti i campioni iniettati.con EdU e soluzione salina iniettata (nessun controllo UDE) controllo negativo. Vedi Tabella 1 per la ricetta di soluzioni necessarie per effettuare queste operazioni. <ol><li> Per ogni cuore da analizzare, collocare 36 ml di soluzione PBS 1% BSA / in un tubo ultracentrifuga, incubare per 30 min, scartare la soluzione e poi lasciare asciugare all&#39;aria. Nota: Questo tubo è utilizzato nel passo 3.6. </li><li> Posizionare i singoli cuori congelati su un piatto di 10 millimetri su ghiaccio e tritare con un bisturi che permette il cuore per scongelare durante il processo di macinazione. </li><li> Posizionare cuori macinate in 15 ml di cellule Lysis Buffer in una provetta da centrifuga da 50 ml ed omogeneizzare con un omogeneizzatore sonda per 15 secondi a 25.000 rpm a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere altri 15 ml di cellulare Lysis Buffer alla provetta e trasferire ad un 40 ml Dounce con un grande pestello spazio. Eseguire 10 colpi con il pestello e filtrare a 100 micron, allora 40 micron colino cella in una provetta da centrifuga da 50 ml. </li><li> Centrifugare per 10 min at 700 xg a 4 ° C e rimuovere il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet nucleare in 25 ml di saccarosio gradiente Solution e sovrapporre i nuclei cellulari contenenti soluzione sopra di 10 ml di soluzione gradiente di saccarosio fresca nel tubo ultracentrifuga preparato in 3.1. </li><li> Centrifugare a 13,000 xg per 1 ora a 4 ° C utilizzando un rotore tubo oscillazione fuori. </li><li> Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet nuclei in 1.300 ml di buffer di stoccaggio nuclei in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e l&#39;etichetta PCM1. </li><li> Rimuovere 300 microlitri della sospensione ad una nuova provetta e aggiungere a 700 ml di tampone di conservazione nuclei fresco. Etichettare questo tubo come il controllo ISO. </li><li> Aggiungere anti-PCM1 ad una concentrazione finale di 8 mg / ml per provetta etichettata PCM1 e aggiungere IgG di coniglio anticorpo di controllo isotipico ad una concentrazione di 8 mg / ml per provetta etichettata controllo ISO. </li><li> Incubare per una notte a 4 ° C. Dopo incubzione, centrifugare a 700 xg per 10 minuti, scartare il surnatante, sostituirlo con 1 ml di tampone di conservazione nuclei fresco, risospendere e centrifugare ancora per 10 min a 700 x g. Eliminare il supernatante e sostituirlo con 1 ml di tampone di conservazione nuclei fresco. </li><li> Aggiungere 1 ml di F (ab &#39;) 2 Frammento di capra anti-IgG di coniglio (H + L) anticorpo (FITC o colorante verde fluorescente equivalente) per ottenere una concentrazione finale di 2 mg / ml. Nota: L&#39;uso di un F (ab &#39;) 2 dell&#39;anticorpo frammento diminuisce il potenziale di marcatura non specifica delle cellule immunitarie compresi macrofagi e cellule B. </li><li> tubi avvolgere in un foglio di alluminio per proteggere dalla luce e incubare per 1 ora a 4 ° C. </li></ol> 4. Individuazione di EdU incorporazione <ol><li> Diluire 10x concentrata EdU tampone di reazione 1:10 con acqua deionizzata. </li><li> Centrifugare il PCM-1 e ISO controllo etichettato nuclei sospensioni a 700 xg per 10 minuti, scartare il surnatante e risospendere il pellet nuclei in 1 ml di1% BSA / PBS soluzione. Lavare il pellet nuclei due volte. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, scartare il surnatante e sostituirlo con 100 ml di fissativo EdU. </li><li> Avvolgere tubi in alluminio per proteggere dalla luce e incubare a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Lavare i campioni due volte con 1 ml di 1% BSA / PBS, centrifugare a 700 xg ed incubare con soluzione di permeabilizzazione saponina basata 1x a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Preparare 1x etichettatura cocktail EdU (Tabella 2). Un minimo di 2 reazioni sarà richiesto di inserire il nessun controllo edu. </li><li> Aggiungere 500 ml di 1x EdU etichettatura cocktail direttamente a ciascun campione già contenente nuclei in 100 ml di soluzione di permeabilizzazione saponina basata 1x e incubare a temperatura ambiente al riparo dalla luce per 30 minuti. </li><li> Centrifugare a 700 xg e risospendere in 1 ml di 1% BSA / PBS e ripetere l&#39;operazione altre due volte. </li><li> Centrifugare a 700 xg, scartare il surnatante e sostituirlo con 400 ml di soluzione colorante DNA (vedi Tabella dei Materiali). </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td></tr><tr><td> 1. cellulare Lysis Buffer </td></tr><tr><td> 0,32 M di saccarosio </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 mM CaCl 2 </td></tr><tr><td> 5 mM acetato di magnesio </td></tr><tr><td> 2.0 mM EDTA </td></tr><tr><td> 0,5 mM EGTA </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr><tr><td> 2.Sucrose Gradient Soluzione </td></tr><tr><td> 2.1 M saccarosio </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 mM acetato di magnesio </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr><tr><td> 3. buffer di stoccaggio Nuclei (NSB) </td></tr><tr><td> 0.44 M saccarosio </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) </td></tr><tr><td> 70 mM KCl </td></tr><tr><td> 10 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 1,5 mm spermina </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Nuclei ingredienti tampone isolamento Ricetta per tutti i buffer utilizzati nella sezione del protocollo 3 (Nuclei dissociazione e dei cardiomiociti nuclei etichettatura).. 5. analisi di citometria di flusso Nota: Eseguire la citometria a flusso su nuclei isolati come descritto in precedenza 7,11,15. <ol><li> In primo luogo, creare un grafico che descrive Forward Scatter (FSC) e Side Scatter (SSC) per consentire la discriminazione dei nuclei da detriti (Figura 2A). </li><li> Creare un diagramma a discriminare singoli nuclei da aggregati (Figura 2b) tracciando 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole) (DAPI) zona (3-405 / 450/50-A) rispetto altezza (33-405 / 450 / 50-H). garantire that il 3-405 / 450/50-Un segnale viene raccolto della scala lineare per consentire la corretta determinazione del contenuto di DNA. </li><li> Creare un diagramma che descrive 488/535 / 30 A (PCM-1) vs SSC e visualizzare solo gli eventi dal cancello singoletto creata in 5.2 al fine di valutare PCM-1 nella popolazione singoletto. </li><li> Eseguire il campione di controllo Isotype per stabilire un PCM-1 cancello positivo (Figura 2C). Eseguire una piccola quantità di PCM1 etichettato esempio per verificare l&#39;PCM1 che esprime la posizione della popolazione e gating. </li><li> Creare un diagramma che descrive SSC-A vs 405/450 / 50-A (per rilevare DAPI). In questa trama, visualizzazione singoletto solo pcm1 nuclei che esprimono, con le porte create in 5.3. Utilizzare questa trama per creare un cancello gerarchico aggiuntivo che contiene solo 2N nuclei (Figura 2D). </li><li> Creare una trama che descrive 488/535 / 30-A vs 1-633 / 660/20-A per consentire l&#39;identificazione di etichettatura EdU della PCM1 esprimere popolazione di cardiomiociti. Visualizzare solo i nuclei che sono singoletto, P<html> CM1 + e 2N utilizzando il gating sopra. </li><li> Campione di cuore eseguito da alcun controllo EdU per impostare il cancello positivo EdU (Figura 2E). Creare la porta appropriata per le cellule EdU +. </li><li> Record e quantificare singoletto, PCM-1 che esprimono, nuclei 2N che hanno incorporato edu. </li><li> Calcolare questa popolazione come percentuale del totale singoletto, PCM1 + nuclei. Ciò fornirà la velocità di generazione nuclei neo-cardiomiociti, durante il periodo di impulso EdU 7 giorni, come percentuale del totale nuclei cardiomiociti. Nota: Come DAPI legame al DNA è stechiometrico l&#39;intensità di fluorescenza è proporzionale alla quantità di DNA. Determinare ploidia base all&#39;intensità della / 450/50-Un segnale 405, come descritto in precedenza 7. </li><li> Per valutare la ploidia all&#39;interno della popolazione totale dei cardiomiociti utilizzare la trama stabilita in 5,5 e una strategia basata su gating concentrazione del DNA 7. </li></ol>/files/ftp_upload/53979/53979fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2:. Soppressione strategia di quantificare cardiomiociti EdU costituzione e ploidia (A) I nuclei sono discriminati da detriti sulla base di forward scatter (FSC) e side scatter (SSC). (B) Viene creato un cancello lineare e la popolazione nuclei singoletto è identificato sulla base di etichettatura DAPI e l&#39;altezza 405/450/50 vs segnale di zona. (C) gating fluorescente permette la separazione dei nuclei cardiomiociti nuclei (PCM-1-negativi) (PCM-1-positive) e non cardiomiociti dal tessuto cardiaco. (D) L&#39;intensità del segnale di DAPI viene utilizzato per determinare la concentrazione del DNA e quindi ploidia nuclei della popolazione cardiomiociti PCM1 +. Nel topo&gt; 80% dei nuclei cardiomiociti sono diploide (2n). (E) gating fluorescente permette la separazione di 2N, nuclei cardiomiociti, che hanno incorporato EdU (PCM + / EDU + = 0,9%) da 2N, cardiomiociti che non sono incorporati EdU (PCM + istruzione). Tutte le fasi sono dettagliati nel protocollo 5.0. Esempio illustrato da MDX -. / Y topi sullo sfondo C57 / BL10 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53979/53979fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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The authors have nothing to disclose.

Per quantificare con precisione il fatturato dei cardiomiociti e saggi di rigenerazione deve distinguere tra vero generazione dei cardiomiociti e la divisione del DNA non produttivo. Molti studi continuano ad ignorare semplicemente questi eventi non produttive, quantificando la proliferazione dei cardiomiociti esclusivamente tramite l&#39;espressione della ciclina kinesis e marcatori del ciclo cellulare. Fino ad oggi un unico metodo che consente la quantificazione precisa del fatturato cardiomiociti, mentre il controllo di questi eventi non produttive rimane allusiva. In particolare, rimane difficile spiegare poliploidizzazione cardiomiociti che contribuisce fino al ~ 65% dei cardiomiociti replicazione del DNA 13. Pertanto, per facilitare la quantificazione accurata di generazione cardiomiociti abbiamo sviluppato un protocollo che consente la quantificazione robusta delle aliquote di nuclei cardiomiociti neo escludendo replicazione del DNA che si traduce in un aumento ploidia. Anche se questo protocollo non può discriminazione tra generi neo-cardiomiocitizione e cardiomiociti bi-nucleazione, può essere utilizzato rapidamente e calcolare con precisione il limite superiore (pari al ploidia) di generazione di cardiomiociti. Questo protocollo prevede quindi uno strumento di screening per valutare eventuali variazioni dei tassi di generazione dei cardiomiociti e poliploidizzazione in modelli di malattia o per valutare il potenziale di efficienza di terapie. Una volta variazioni del tasso di generazione di nuclei neo-cardiomiociti vengono identificati utilizzando questo protocollo studi successivi possono essere utilizzati per l&#39;accertamento se questo a causa di cambiamenti nella generazione cardiomiociti del numero dei cardiomiociti nucleazione, come descritto in precedenza 2,13,17,18. Questi includono l&#39;uso delle dinamiche di nucleazione quantificazione cardiomiociti istologici durante il periodo di impulso o analisi di sezioni di tessuto ottenuti da animali impulsi Edu per confrontare EdU incorporazione nelle popolazioni cardiomiociti mononucleate e multinucleate. A causa dei bassi livelli di fatturato cardiomiociti questoprotocollo utilizza iniezioni multiple di EdU nel corso di un periodo di 7 giorni. Ciò consente anche la &quot;caccia&quot; di tutte le potenziali fonti cellulari di generazione di cardiomiociti e consente la quantificazione della generazione di cardiomiociti nuclei cumulativo in questo periodo di tempo. A seconda dello studio, questo lasso di tempo può essere regolata per soddisfare i livelli previsti di generazione di cardiomiociti. Per la quantificazione accurata EdU incorporazione nei nuclei cardiomiociti, è imperativo che non vi è alcuna marcatura non specifica dei nuclei con l&#39;anticorpo secondario utilizzato per rilevare PCM-1 reattività. Sarebbe quindi opportuno effettuare ulteriori esperimenti di titolazione anticorpi secondari per ottimizzare questo aspetto del protocollo, in particolare se un anticorpo secondario diverso da quello proposto in questo protocollo deve essere utilizzato. Il protocollo qui descritto utilizza PCM-1 per identificare i nuclei cardiomiociti. Mentre questo è un marcatore cardiomiociti stabilita, marcatori alternativi possono essere utilizzati per convalidaredati; questi includono anticorpi specifici per cardiaca Troponina T, che è stato identificato come in parte localizzato nei nuclei cardiomiociti 1. Analogamente, alternative proteine ​​localizzate nucleari possono essere utilizzati per identificare e quantificare EdU incorporazione in popolazioni nuclei diversi da quello dei cardiomiociti. E &#39;importante che tutti i nuclei cardiomiociti che sono attivamente mitosi sono esclusi dall&#39;analisi, come il destino di questa sintesi del DNA è sconosciuta e può provocare sia la divisione cellulare o aumento della ploidia. PCM1 viene smontato durante la fase M del ciclo cellulare quindi cardiomiociti mitosi non sarà identificato mediante espressione PCM1. Inoltre, tutti i nuclei in fase s del ciclo cellulare devono essere esclusi dal successiva analisi. Ciò può essere ottenuto gating su tutti i nuclei con intensità DAPI sopra popolazione 2N compresi quelli con un&#39;intensità DAPI tra 2N e 4N popolazioni. Anche se è sempreaccettato che il cuore ha la capacità di sostituire cardiomiociti durante l&#39;invecchiamento normale e dopo lesione acuta, la sorgente e il grado di questo potenziale rimane controverso. Inoltre, i tassi di turnover disparate cardiomiociti sono stati segnalati 1,7,20-22. Questo può essere in parte dovuto alla difficoltà di individuare e quantificare la generazione neo-cardiomiociti 19 in modo accurato. Ad oggi la maggior parte degli studi hanno contato esclusivamente sull&#39;impiego di analisi istologica e l&#39;identificazione dei cardiomiociti tramite l&#39;espressione di proteine ​​citoplasmatiche, comprese le proteine ​​del sarcomero, per la quantificazione del fatturato cardiomiociti e rinnovo 2,4,23,24. L&#39;uso di questi metodi per rilevare l&#39;espressione di marcatori di proliferazione, o come dimostrato qui, l&#39;incorporazione di analoghi della timidina può facilmente portare alla errata identificazione di altri tipi di cellule cardiache come cardiomiociti. Mentre l&#39;uso di confocale 3D può aiutare ad alleviare questi problemi Thmetodi di ESE sono costose e che richiede tempo. È interessante notare che il protocollo qui descritto dimostra neo-cardiomiociti generazione nuclei avviene ad una velocità di 0,17% a settimana. Ciò è coerente con altri citometria a flusso studi basati dimostrano tassi di turnover settimanali fino al 0,13% 5. Anche se è forte la tentazione di estrapolare i tassi di fatturato annuo sulla base di questi dati, come negli studi precedenti 2,5,25,26, questo è inadeguato come i tassi di turnover sono dinamici durante il tempo di vita di un animale 13. Questo metodo ha un certo numero di potenziali applicazioni, tra cui la valutazione dei potenziali terapie per migliorare la rigenerazione dei cardiomiociti o studio degli effetti di malattia cardiaca sul fatturato dei cardiomiociti ei tassi di cardiomiociti poliploidizzazione.

Negli ultimi anni c&#39;è stato un accumulo di prove contestare la supposizione che il cuore è un terminalmente differenziate, 1,2 organo post-mitotico. Tuttavia, la quantificazione del fatturato dei cardiomiociti e rigenerazione rimane difficile. Le difficoltà di identificare con precisione la generazione dei cardiomiociti rara utilizzando tecniche di immunoistochimica standard sono ben segnalati 3. Inoltre, la fonte cellulare di generazione cardiomiociti rimane incerta con evidenza di contributi di proliferazione dei cardiomiociti, nonché di differenziazione delle cellule staminali 4-6. Pertanto, l&#39;uso di modelli lineage tracing che richiedono la conoscenza del fenotipo cardiomiociti progenitore è impossibile e quantificazione della proliferazione in una singola popolazione, compresi cardiomiociti, è appropriato. Inoltre, una cardiomiociti ha il potenziale per endoreplication senza cariocinesi (risultante in una macchina poliploidediomyocyte) o cariocinesi in assenza di citocinesi (risultante in un cardiomiociti binucleate) 7,8. La quantificazione precisa del fatturato cardiomiociti dipende dalla capacità di distinguere tra questi eventi e la vera generazione neo-cardiomiociti. Questo crea complicazioni unici, poiché la replicazione del DNA e l&#39;espressione delle chinasi ciclina-dipendenti in cardiomiociti non dimostrano solo la divisione cellulare vera 9,10. Per facilitare la quantificazione della generazione neo-cardiomiociti, abbiamo unito una tecnica di isolamento nuclei stabilito, e l&#39;etichettatura immunologica di materiale pericentriolar 1 (PCM1) per l&#39;identificazione dei nuclei cardiomiociti come descritto da Bergmann et al. 7,11 con nuovi metodi di lungo termine l&#39;etichettatura del DNA e analisi ploidia. PCM-1 è una proteina centrosome che si accumula sulla superficie nucleare differenziate, miociti non ciclismo. Studi precedenti hanno dimostrato che gli anticorpi controPCM-1 Etichetta specificamente nuclei cardiomiociti 7,11 e come tale PCM1 è stato utilizzato da un certo numero di gruppi indipendenti per identificare cardiomiociti 1,12,13. Inoltre, abbiamo dimostrato che l&#39;espressione PCM1 associa a nuclei cardiomiociti geneticamente etichettati in TnT-cre modello di topo transgenico 14 (figura supplementare 1). Il protocollo qui descritto consente l&#39;identificazione precisa e sensibile di neo generazione cardiomyocyte nuclei nel cuore del mouse, indipendentemente dalle origini cellulari (Figura 1A e B) e contemporaneamente escluse etichettatura nucleoside causa poliploidizzazione dall&#39;analisi (Figura 1C e D). Anche se questo metodo non può controllare per cardiomiociti binucleazione, permette una quantificazione rapida e robusta dei nuclei neo-cardiomiociti che è richiesto per la quantificazione precisa del fatturato dei cardiomiociti. Per di più,essa fornisce uno strumento di screening rapido per valutare eventuali cambiamenti nelle dinamiche di generazione dei cardiomiociti. Mentre etichettatura DNA solito comporta 5-Bromo-2&#39;-deossiuridina (BrdU) come analogico timidina, il protocollo qui descritto utilizza dosaggio 5 etinil-2&#39;-deossiuridina (EdU) basato quanto richiede meno fasi di lavorazione per una più rapida through-put e non richiede denaturazione del DNA per immuno-rilevamento, che lo rende compatibile con altri protocolli immunocolorazione e aumentando così le potenziali applicazioni a valle del metodo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53979/53979fig1.jpg" /> Figura 1: pulsante continuo con EdU etichette neo-cardiomiociti, indipendentemente dalla loro progenitori. (A) EdU è incorporato nel DNA dei cardiomiociti durante la divisione cellulare. La proliferazione della popolazione cardiomiociti sarà Result in un aumento, o la sostituzione dei cardiomiociti ed è sintesi del DNA pertanto produttivo (contribuisce al mantenimento dei tessuti e la riparazione). (B) EdU è incorporato nel DNA delle cellule progenitrici cardiache durante la divisione cellulare. Questo verrà mantenuto nella cella durante la differenziazione alla stirpe dei cardiomiociti. Questa differenziazione delle cellule staminali comporterà anche un aumento del numero dei cardiomiociti e contribuisce quindi alla manutenzione e riparazione dei tessuti. (C) cardiomiociti hanno il potenziale per subire &quot;non produttivi&quot; replicazione del DNA con conseguente aumento della ploidia dei cardiomiociti, che è associato con l&#39;ipertrofia dei cardiomiociti e rimodellamento miocardico, ma non sostituisce cardiomiociti persi. Il processo di poliploidizzazione differisce da binucleazione poiché comporta un cardiomiociti con un singolo nucleo che contiene quattro o più insiemi di due cromosomi omologhi (&gt; 2N). (D) A seguito di un continuo nuclei pUlse, questo protocollo descrive l&#39;isolamento dei nuclei e l&#39;identificazione dei nuclei cardiomiociti di espressione PCM1 per consentire la quantificazione sia ploidia dei cardiomiociti e EdU incorporazione. Espressione PCM1 e EdU incorporazione rilevato mediante citometria a flusso. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53979/53979fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>0.32 M sucrose</td><td>Sigma</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH = 8)</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>5 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>c5086</td><td></td></tr><tr><td>5 mM magnesium acetate</td><td>sigma</td><td>M-5661</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mM EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mM EGTA</td><td>Sigma</td><td>63779</td><td></td></tr><tr><td>1 mM DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>70 mM KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mM spermine</td><td>Sigma</td><td>85590</td><td></td></tr><tr><td>Isotype rabbit IgG- ChIP Grade</td><td>abcam</td><td>abc7415</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-PCM-1 antibody</td><td>Sigma</td><td>HPA023374</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 F(ab&#039;)2 Fragment of Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>A-11070</td><td></td></tr><tr><td>cell strainers&amp;nbsp; 70 &amp;mu;m and 100 &amp;mu;m&amp;nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>11597522, 11517532</td><td></td></tr><tr><td>Glass dounce (40 ml) and pestle large clearance</td><td>Sigma</td><td>D9188-1SET</td><td></td></tr><tr><td>EdU (5-ethynyl-2&amp;rsquo;-deoxyuridine)</td><td>Life technologies</td><td>A10044</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit</td><td>Life technologies</td><td>C10634</td><td>This kit inlcudes&amp;nbsp; reagents required for section, EdU reaction buffer,&amp;nbsp; EdU fixative, saponin-based permeabilization solution and the reagents required for the EdU labelling cocktail.</td></tr><tr><td>CyStain DNA 2 step kit,</td><td>Sysmex Partec</td><td>05 5005</td><td>This kit inlcudes&amp;nbsp; reagents required for DAPI labelling (DNA staining solution)</td></tr><tr><td>Probe homogeniser, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, TissueRuptor</td><td>Qiagen</td><td>9001273</td><td></td></tr><tr><td>TissueRuptor Disposable Probes</td><td>Qiagen</td><td>990890</td><td></td></tr><tr><td>ultracentrifuge</td><td>Sorvall&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Facscanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Polypropylene. 38.5 ml, 25 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous assessment of cardiomyocyte dna synthesis and ploidy: a method to assist quantification of cardiomyocyte regeneration and turnover

Anche se è accettato che il cuore ha un potenziale limitato per rigenerare cardiomiociti dopo un trauma e che bassi livelli di fatturato cardiomiociti si verificano durante il normale invecchiamento, la quantificazione di questi eventi rimane difficile. Questo è in parte dovuto alla rarità del processo e il fatto che più fonti cellulari contribuiscono al mantenimento del miocardio. Inoltre, la duplicazione del DNA all&#39;interno di cardiomiociti spesso porta ad un cardiomiociti poliploide e solo raramente porta a nuove cardiomiociti di divisione cellulare. Al fine di quantificare con precisione cardiomiociti discriminazione fatturato tra questi processi è essenziale. Il protocollo qui descritto si avvale di etichettatura nucleoside lungo termine al fine di etichettare tutti i nuclei che sono sorte a seguito di nuclei replicazione del DNA e cardiomiociti identificati utilizzando l&#39;isolamento dei nuclei e la successiva immunomarcatura PCM1. Insieme questo permette l&#39;identificazione accurata e sensibile dell&#39;etichettatura nucleoside della cardiomyocyte popolazione nuclei. Inoltre, 4 &#39;, l&#39;etichettatura e l&#39;analisi di ploidia nuclei 6-diamidino-2-phenylindole, consente la discriminazione dei nuclei neo-cardiomiociti da nuclei che hanno incorporato nucleosidici durante poliploidizzazione. Anche se questo metodo non può controllare per cardiomiociti binucleazione, permette una quantificazione rapida e robusta dei nuclei neo-cardiomiociti tenendo conto di poliploidizzazione. Questo metodo ha un certo numero di applicazioni a valle, tra cui la valutazione dei potenziali terapie per migliorare la rigenerazione dei cardiomiociti o studio degli effetti di malattia cardiaca sul fatturato dei cardiomiociti e ploidia. Questa tecnica è anche compatibile con l&#39;aggiunta di tecniche immunoistochimiche a valle, permettendo la quantificazione di incorporazione nucleoside in tutti i tipi di cellule cardiache.

Questo metodo consente la quantificazione di una maggiore integrazione EdU a causa di cardiomiociti divisione dei nuclei, mentre il controllo per una maggiore poliploidizzazione. Utilizzando un test basato BrdU, abbiamo precedentemente dimostrato che il cuore dei mammiferi risponde alla perdita di cardiomiociti cronica, nel modello di topo mdx di distrofia muscolare di Duchenne, con la rigenerazione di nuovi cardiomiociti. Abbiamo usato i metodi descritti qui per validare ulteriormente i nostri risultati pubblicati e per dimostrare l&#39;utilità del protocollo. Come per il protocollo descritto; adulti (12 settimane di età) topi mdx BL10 e di controllo sono stati impulsiva con una sola iniezione quotidiana di EdU per 7 giorni, ha riferito in precedenza per consentire l&#39;analisi statica tra i gruppi sperimentali 5,13. Analisi immunoistochimica di cuori pulsati dimostra la presenza di PCM1 esprimere cardiomiociti che hanno incorporato EdU (Figura 3A). usin Tuttavia, i dati ottenutig metodi immunoistologici possono essere male interpretate, come altri tipi di cellule che hanno incorporato EdU possono essere erroneamente identificati come cardiomiociti. Un esempio di questo è illustrato nel complementare Figura 1A e B. Inoltre i metodi immunoistologici non distinguono poliploidizzazione dalla divisione nucleare. La citometria a flusso analisi dettagliata in questo protocollo consente la rapida quantificazione della divisione nucleare cardiomiociti in topi mdx e di controllo, mentre escludendo le cellule che erano incorporate EdU a causa di poliploidizzazione. Simili dati precedentemente pubblicati 13, analisi ha rivelato un aumento dei tassi di generazione nuclei neo-cardiomyocyte nei cuori mdx topo rispetto ai pari età controlli (1,2% contro 0,17%; Figura 3B e C). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53979/53979fig3.jpg" /> Figura 3: </strong&gt; La quantificazione del EdU etichettato cardiomiociti in di tipo selvatico e cuori MDX. (A) Immagine di proiezioni Z-stack prese da 40 micron di spessore sezioni di cuori mdx. PCM-1 che esprimono nuclei cardiomiociti (verde) che ha incorporato EdU (rosso). freccia gialla indica EdU etichettato cardiomiociti. ie ii indica individuale EdU etichettato cardiomiociti indicati nella Z-plane. Nuclei etichettato con DAPI (blu) (B e C) citometria a flusso dei nuclei isolati che mostra trame rappresentativi 12-13 settimane di età wild type (C57 / BL10) e topi mdx (MDX - / y sul C57 / BL10 sfondo). (B) Istogramma che mostra l&#39;intensità DAPI e discriminazione tra 2N e&gt; 2N nuclei. (C) Piazzole mostrano EdU incorporazione nella popolazione nuclei 2N cardiomiociti se analizzato come descritto nel presente protocollo. Per tutti i mouse Edu è stato somministrato per 1 settimana a partire dal 12 settimane di età. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53979/53979fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 1 supplementare:. PCM-1 è un marcatore specifico per nuclei cardiomiociti Utilizzando il protocollo descritto nuclei sono stati isolati dal topo transgenico doppio prodotto da attraversando topi TNT-cre 14 con la ROSA nT / NG cre sensibile linea di giornalista 16. Nella risultante di attivazione del mouse cre sotto il controllo di Troponina T (TNT) promotore conduce all&#39;espressione irreversibile di GFP con sta localizzata ai nuclei. Nuclei etichettato con controllo isotipico (Iso) dimostra la capacità di identificare la GFP esprimere cardiomiociti popolazione nuclei (488/530/30-A). Etichettatura dei nuclei con PCM1 anti-(anticorpo secondario rilevati dai 633-660 / 20-A) dimostra la correlazione di espressione PCM1 con il cardiomyocy esprimono GFPTE popolazione nuclei. In questo esempio, il 98,8% dei nuclei cardiomiociti come individuati dal promotore attività TNT, sono etichettati con anticorpi PCM1. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure1.tif" target="_blank">Clicca qui per scaricare la Figura 1 supplementare.</a> Figura integrativa 2:. Sfide per quantificare il rinnovo dei cardiomiociti con tecniche immunoistochimiche (A) 2D L&#39;immagine mostra due PCM-1 che esprimono nuclei cardiomiociti (verde), che sembrano essere etichettato anche per EdU (rosso). Le frecce gialle indicano quello che sembra essere cardiomiociti, che hanno incorporato edu. Ciò è dovuto alla apparente co-localizzazione di espressione PCM1 ed etichettatura EdU quando visualizzati utilizzando immagini 2-dimensionale. (B) Una proiezione 3-dimensionale di questa immagine identifica la EdU etichettato cellule non sono cardiomiociti, ma sono cellule non-cardiomiociti sovrastanti PCM1 esprimere nuclei cardiomiociti. Topi C57 / BL10 a 12 settimane di età utilizzato per gli esperimenti. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2A.tif" target="_blank">Clicca qui per scaricare supplementare figura 2A.</a> <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2B.avi" target="_blank">Clicca qui per scaricare supplementare figura 2B.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Componenti di reazione </td><td colspan="2"> Numero di reazioni </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 875 ml </td><td> 2.19 ml </td></tr><tr><td> protettivo di rame </td><td> 20 microlitri </td><td> 50 microlitri </td></tr><tr><td> colorante fluorescente picolyl azide </td><td> 5 ml </td><td> 12,5 ml </td></tr><tr><td> reazione diluitodel buffer preparato in 4.1 </td><td> 100 pl </td><td> 250 microlitri </td></tr><tr><td> volume di reazione totale </td><td> 1 ml </td><td> 2,5 ml </td></tr></tbody></table> Tabella 2: EdU ingredienti del cocktail. Ricetta per un cocktail etichettatura EdU necessaria sezione del protocollo 4 (Rilevamento di EdU incorporazione).

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Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.

La valutazione simultanea di Cardiomyocyte DNA Sintesi e Ploidia: Un metodo per assistere Quantificazione del Cardiomyocyte Rigenerazione e fatturato

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.3K Views.  Newcastle University. Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.

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Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data in all cells, including stem cells, and its integrity is fundamental to its regenerative ability. Stem cells undergo rapid propagation in labs to achieve the necessary numbers for transplantation. Accelerated cell growth leads to the loss of DNA integrity by accumulated metabolites, such as reactive oxygen, carbonyl, and alkylating agents. Transplanting these cells would result in poor engraftment and regeneration of the deteriorating organ. Moreover, transplanting DNA-damaged cells leads to mutations, DNA instability, cellular senescence, and possibly, life-threatening diseases such as cancer. Therefore, there is an immediate need for a quality control method to evaluate the cell's suitability for transplantation. Here, we provide step-by-step protocols for the assessment of the DNA integrity of stem cells prior to cell transplantation.

Here, we provide a detailed description of an experimental setup for an analysis of the assessment of DNA integrity in stem cells prior to cell transplantation.

Valutazione dell'integrità del DNA di cellule staminali per la terapia cellulare cardiaca

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

Ricerca

Genetica

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and cytokinesis) and acytokinetic mitosis (karyokinesis but no cytokinesis). Such atypical cell cycle variations result in polyploid and multinucleated cells rather than in cell division. Therefore, to determine cardiac turnover and regeneration, it is of crucial importance to correctly identify cardiomyocyte nuclei, the number of nuclei per cell, and their cell cycle status. This is especially true for the use of nuclear markers for identifying cell cycle activity, such as thymidine analogues Ki-67, PCNA, or pHH3. Here, we present methods for recognizing cardiomyocytes and their nuclearity and for determining their cell cycle activity. We use two published transgenic systems: the Myh6-H2B-mCh transgenic mouse line, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and the CAG-eGFP-anillin mouse line, for distinguishing cell division from cell cycle variations. Combined together, these two systems ease the study of cardiac regeneration and plasticity.

To distinguish cell division from cell cycle variations in cardiomyocytes, we present protocols using two transgenic mouse lines: Myh6-H2B-mCh transgenic mice, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and CAG-eGFP-anillin mice, for distinguishing cell division from cell cycle variations.

La visualizzazione delle variazioni del ciclo cellulare e la determinazione di nucleazione in postnatali cardiomiociti

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Biologia dello sviluppo

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

Isolamento dei Nuclei Cardiomyocyte dal post-mortem del tessuto

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Medicina

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

Valutare cardiomiociti sottotipi A seguito di riprogrammazione Fattore di trascrizione-mediata di fibroblasti embrionali di topo

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.2. Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart3. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact4. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

In these studies, we provide methodology for novel, neonatal, murine cardiac scaffolds for use in regenerative studies.

Neonatale cardiaco Impalcature: Matrici innovativi per gli Studi rigenerativi

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Bioingegneria

Clonal Analysis of the Neonatal Mouse Heart using Nearest Neighbor Modeling

By replacing lost or dysfunctional myocardium, tissue regeneration is a promising approach to treat heart failure. However, the challenge of detecting bona fide heart regeneration limits the validation of potential regenerative factors. One method to detect new cardiomyocytes is multicolor lineage tracing with clonal analysis. Clonal analysis experiments can be difficult to undertake, because labeling conditions that are too sparse lack sensitivity for rare events such as cardiomyocyte proliferation, and diffuse labeling limits the ability to resolve clones. Presented here is a protocol to undertake clonal analysis of the neonatal mouse heart by using statistical modeling of nearest neighbor distributions to resolve cardiomyocyte clones. This approach enables resolution of clones over a range of labeling conditions and provides a robust analytical approach for quantifying cardiomyocyte proliferation and regeneration. This protocol can be adapted to other tissues and can be broadly used to study tissue regeneration.

Presented here is a protocol for using multicolor lineage tracing and nearest-neighbor modeling to identify clonally derived cardiomyocytes during growth and regeneration in mice. This approach is objective, works across different labeling conditions, and can be adapted to incorporate a variety of image analysis pipelines.

By replacing lost or dysfunctional myocardium, tissue regeneration is a promising approach to treat heart failure. However, the challenge of detecting ...

Assessing Cardiac Reprogramming using High Content Imaging Analysis

The goal of this protocol is to describe a method for quantifying induced cardiomyocyte-like cells (iCMs), which are directly reprogrammed in vitro by a reprogramming technique. Cardiac reprogramming provides a strategy to generate new cardiomyocytes. By introducing core cardiogenic transcription factors into fibroblasts; fibroblasts can be converted to iCMs without transition through the pluripotent stem cell state. However, the conversion rate of fibroblasts to iCMs still remains low. Accordingly, there have been numerous additional approaches to enhance cardiac reprogramming efficiency. Most of these studies assessed cardiac reprogramming efficiency using flow cytometry, while at the same time performed immunocytochemistry to visualize iCMs. Thus, at least two separate sets of reprogramming experiments are required to demonstrate the success of iCM reprogramming. In contrast, automated high content imaging analysis will provide both quantification and qualification of iCM reprogramming with a relatively small number of cells. With this method, it is possible to directly assess the quantity and quality of iCMs with a single reprogramming experiment. This approach will be able to facilitate future cardiac reprogramming studies that require large-scale reprogramming experiments such as screening genetic or pharmacological factors for enhancing reprogramming efficiency. In addition, the application of high content imaging analysis protocol is not limited to cardiac reprogramming. It can be applied to reprogramming of other cell lineages as well as any immunostaining experiments which need both quantification and visualization of immunostained cells.

We present a protocol to quantify directly reprogrammed induced cardiomyocyte-like cells (iCMs) in vitro using high content imaging analysis. This method allows us to quantify the efficiency of cardiac reprogramming in an automated manner and to directly visualize iCMs.

The goal of this protocol is to describe a method for quantifying induced cardiomyocyte-like cells (iCMs), which are directly reprogrammed in vitro by a ...

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as cholangiocytes, myofibroblasts, progenitors and inflammatory cells also indicate chronic liver damage, tissue remodeling and disease progression. In this protocol, we describe a simple high-throughput approach for calculating changes in the cellular composition of the liver that are associated with injury, chronic disease and cancer. We show how information extracted from two-dimensional (2D) tissue sections can be used to quantify and calibrate hepatocyte nuclear ploidy within a sample and enable the user to locate specific ploidy subsets within the liver in situ. Our method requires access to fixed/frozen liver material, basic immunocytochemistry reagents and any standard high-content imaging platform. It serves as a powerful alternative to standard flow cytometry techniques, which require disruption of freshly collected tissue, loss of spatial information and potential disaggregation bias.

We present a robust, cost-effective, and flexible method for measuring changes in hepatocyte number and nuclear ploidy within fixed/cryopreserved tissue samples that does not require flow cytometry. Our approach provides a powerful sample-wide signature of liver cytology ideal for tracking the progression of liver injury and disease.

Un metodo ad alto throughput in Situ per la stima della ploidia nucleare epatica nei topi

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...

Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes

Ischemic heart disease is a significant cause of death worldwide. It has therefore been the subject of a tremendous amount of research, often with small-animal models such as rodents. However, the physiology of the human heart differs significantly from that of the rodent heart, underscoring the need for clinically relevant models to study heart disease. Here, we present a protocol to model ischemic heart disease using cardiomyocytes differentiated from human induced pluripotent stem cells (hiPS-CMs) and to quantify the damage and functional impairment of the ischemic cardiomyocytes. Exposure to 2% oxygen without glucose and serum increases the percentage of injured cells, which is indicated by staining of the nucleus with propidium iodide, and decreases cellular viability. These conditions also decrease the contractility of hiPS-CMs as confirmed by displacement vector field analysis of microscopic video images. This protocol may furthermore provide a convenient method for personalized drug screening by facilitating the use of hiPS cells from individual patients. Therefore, this model of ischemic heart disease, based on iPS-CMs of human origin, can provide a useful platform for drug screening and further research on ischemic heart disease.

We present a model of ischemic heart disease using cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells, together with a method for quantitative evaluation of tissue damage caused by ischemia. This model can provide a useful platform for drug screening and further research on ischemic heart disease.

Modello di cardiomiociti ischemici e confronto video-based della contrazione cardiomiocite utilizzando cardiomiociti derivati da hiPSC

Ischemic heart disease is a significant cause of death worldwide. It has therefore been the subject of a tremendous amount of research, often with ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Isolamento, cultura e trasduzione di topo adulto cardiomiociti

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...