Per le malattie neonatale come la cardiomiopatia, la terapia rigenerativa con cellule staminali pluripotenti indotte ha un enorme potenziale. Tuttavia, la crescita accelerata delle cellule in vitro porta al danno del DNA da parte di metaboliti accumulati come le specie reattive dell'ossigeno. Il trapianto di queste cellule danneggiate dal DNA comporterebbe uno scarso innesto e rigenerazione dell'organo.
Prima del trapianto, la qualità delle cellule deve essere valutata. Qui forniamo due protocolli passo-passo per valutare il danno al DNA nelle cellule staminali. A dimostrare le procedure saranno Jessica Miller, ricercatrice, Nikhil Mardhekar, ricercatrice, e Vasanthi Rajasekaran, tecnico di laboratorio.
Per iniziare, posizionare 500 milligrammi di agarosio a bassa fusione in 100 millilitri di acqua priva di DNA-RNA. Scaldare la bottiglia in un forno a microonde fino a quando l'agarosio si dissolve. Quindi, posizionare la bottiglia in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius fino a quando necessario.
Per preparare diapositive di comete pre-rivestite, posizionare alcune gocce dello 0,5% di agarosio su uno scivolo di vetro. Stendere immediatamente l'agarosio per formare un sottile strato di rivestimento di agarosio utilizzando un copripasta. Lavorando in condizioni di scarsa illuminazione per evitare danni cellulari indotti dalla luce ultravioletta, mescolare 10 microlitri di sospensione cellulare e 90 microlitri di soluzione di agarosio in un tubo.
Posizionare il tubo in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per evitare che l'agarosio si solidifica. Mescolare la soluzione senza introdurre bolle d'aria e pipettare 70 microlitri per punto sul vetrino pre-rivestito. Utilizzando una punta di pipetta, stendere la miscela di agarosio cellulare per formare uno strato sottile.
Posizionare la diapositiva a quattro gradi Celsius per 15 minuti. In un contenitore, immergere completamente lo scivolo nel tampone di lysis fredda. Posizionare il contenitore al buio a quattro gradi Celsius per un'ora.
Sostituire il tampone di lisi con soluzione alcalina fredda. Assicurarsi che le diapositive siano completamente sommerse. Dopo aver lasciato il contenitore al buio a quattro gradi Celsius per altri 30 minuti, posizionare lo scivolo in un serbatoio di elettroforesi orizzontale.
Riempire il serbatoio con tampone di elettroforesi alcalina fredda fino a quando i vetrini sono completamente sommersi. Applicare la tensione a un volt per centimetro per 15-30 minuti. In un contenitore, immergere completamente lo scivolo in acqua fredda deionizzata.
Dopo due minuti, rimuovere l'acqua deionizzata e aggiungere acqua fresca deionizzata, quindi ripetere questo passaggio una seconda volta. Quindi, sostituire l'acqua deionizzata con 70% di etanolo freddo. Dopo cinque minuti, rimuovere delicatamente lo scivolo senza inclinarlo e lasciarlo asciugare all'aria.
Una volta asciugato, aggiungere 100 microlitri di colorante di DNA diluito in ogni punto e attendere 15 minuti a temperatura ambiente. Utilizzando un filtro FITC in un microscopio a epifluorescenza, scatta immagini da 50 a 100 comete in totale per campione. Cultura cardiomiociti derivati da iPS come descritto nel protocollo di testo.
Per vedere i cardiomiociti derivati da iPS nelle diapositive da camera, prima scartare il mezzo di coltura dai pozzi e lavare le cellule tre volte con PBS. Aggiungere un millilitro dello 0,25% di tripside per pozzo e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Controllare la piastra al microscopio per il distacco cellulare.
Quindi aggiungere un millilitro di CMM per fermare la tripina. Posizionare la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri e centrifugare per cinque minuti a quattro gradi Celsius e 200 volte g. Scartare il mezzo, aggiungere un millilitro di CMM e rimospend le celle.
Contare le celle e regolare il conteggio delle celle per ottenere due milioni di celle in 1,6 millilitri di CMM. Ora semina 200 microlitri di sospensione cellulare per pozzo dello scivolo da camera a otto pozzi. Toccare delicatamente la diapositiva per stendere le celle intorno al pozzo.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius. Per il trattamento con doxorubicina di cardiomiociti derivato da iPS, scartare il mezzo di coltura dai pozzi cardiomiociti derivati da iPS e lavare le cellule con PBS. Trattare le cellule con doxorubicina un micromolare per quattro ore a 37 gradi Celsius.
Aspirare il mezzo e lavare le cellule con PBS. Per eseguire l'immunoetichettatura, lavare le cellule tre volte con PBS e aggiungere 200 microlitri di paraformaldeide al 4% preparata al momento ad ogni pozzo. Fissare le cellule per 20 minuti al buio a temperatura ambiente.
Dopo aver lavato le celle con PBS, aggiungere 200 microlitri di tampone di blocco per pozzo e bloccare per 30 minuti in una camera umidificata a temperatura ambiente. Rimuovere il tampone di blocco e aggiungere 200 microlitri di soluzione anticorpale primaria. Dopo aver incubato per 45 minuti in una camera umidificata scura a temperatura ambiente, lavare i pozzi tre volte con PBS.
Rimuovere il PBS e aggiungere 200 microlitri di miscela di anticorpi secondari. Incubare per 45 minuti in una camera umidificata scura a temperatura ambiente. Quindi lavare i pozzi tre volte con PBS.
Lavare con acqua deionizzata prima di montare gli scivoli con antifade. Posizionare un vetro di copertura e conservare gli scivoli al buio a quattro gradi Celsius. Utilizzando un microscopio confocale, prendi da tre a cinque immagini di campi casuali per campione e procedi all'analisi delle immagini.
Per contare i focolai di risposta ai danni del DNA, scaricare e installare CellProfiler. Selezionate file, importate, condotte dal file e scegliete il file della tubazione denominato puncti gamma-H2AX. Trascinare la cartella contenente le immagini acquisite dei fuochi gamma-H2AX nella finestra dell'elenco dei file nella sezione immagini dei moduli di input per l'analisi.
Quindi seguire le istruzioni come mostrato nel protocollo di testo. Per impostare i parametri per le immagini, trascinare l'immagine desiderata per l'analisi nell'elenco dei file. In Moduli di input selezionare immagini.
Anche nei moduli di input, selezionare i metadati e quindi selezionare nomi e tipi. Per i gruppi, selezionare no. Lavorando nei moduli di analisi, selezionare da colore a grigio.
Quindi selezionare smussato, identificare gli oggetti primari e selezionare di nuovo liscio. Selezionare quindi migliora o sopprimere le feature e quindi identificare gli oggetti primari. Ancora lavorando nei moduli di analisi, selezionare Correla oggetti, quindi classificare gli oggetti e infine selezionare esporta in foglio di calcolo.
Fate clic su Analizza immagini nel pannello in basso a sinistra per eseguire l'analisi delle immagini. Al completamento dell'analisi, vengono generate diverse immagini. Si noti il file CSV generato e salvato nel percorso appropriato nel computer.
Questo file contiene i dati quantitativi per ulteriori analisi. Nel foglio di calcolo chiamato immagine dell'esperimento, la colonna B avrà il numero di nuclei che hanno fino a cinque puncti, e la colonna D avrà il numero di nuclei che hanno più di cinque puncti. Aggiungere le colonne B e D per ottenere il numero totale di nuclei.
Ripetere questi passaggi per tutte le immagini, modificando il nome del file dell'esperimento prima di ogni analisi. Qui sono riportate micrografie rappresentative di comete provenienti da cellule iPS non trattate e non trattate. Una quantità basale di danno al DNA è stata trovata nelle cellule iPS, espressa come frazione del danno al DNA e del momento della coda.
Tuttavia, il trattamento doxo ha aumentato il danno al DNA nelle cellule iPS come previsto, indicando che il test della cometa può essere utilizzato per valutare l'integrità del DNA nelle cellule staminali pluripotenti. Qui sono mostrate micrografie rappresentative dell'immunoetichettatura gamma-H2AX, con un ingrandimento inferiore e un ingrandimento più elevato. Nei cardiomiociti derivati dall'iPS di controllo, più del 90% delle cellule aveva meno di cinque focolai DDR per nuclei.
E un totale di meno del 10% delle cellule aveva più di sei focolai DDR per nuclei. Per i cardiomiociti derivati dall'iPS coltivati per sei mesi, meno del 90% delle cellule aveva fino a cinque focolai DDR per nuclei, e un totale di oltre il 13% delle cellule aveva più di sei focolai DDR per nuclei. Mentre nei cardiomiociti derivati dall'iPS trattati con doxo, meno dell'80% delle cellule aveva fino a cinque focolai DDR per nuclei.
E un totale di circa il 24% delle cellule aveva più di sei focolai DDR per nuclei. Questi dati indicano che la coltura prolungata di cellule cardiomiociti derivate da iPS e il trattamento doxo hanno indotto danni significativi al DNA, rendendoli inadatti al trapianto di cellule. È molto importante evitare variabili durante la miscelazione della sospensione cellulare, in quanto ciò potrebbe influire sull'elettroforesi.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire i test delle comete e le procedure di immunoetichettatura con cellule di vari tipi. Queste tecniche consentiranno di valutare cellule di vario tipo per il danno al DNA prima di essere utilizzate negli studi sul trapianto di cellule.
